Αφηρημένο

Η επίδραση των νανοσωματιδίων χρυσού για τον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων δεν είναι ακόμη σαφές. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την κυτταροτοξικότητα και κυτταρική εισβολή δραστηριότητα των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα μετά από θεραπεία με νανοσωματίδια χρυσού και έδειξε ότι οι μικρές νανοσωματίδια χρυσού μπορεί να υποστεί ενδοκύττωση από τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και ότι διευκολύνουν την κυτταρική διείσδυση. Η ανάπτυξη των κυττάρων Α549 αναστέλλεται μετά από θεραπεία με νανοσωματίδια χρυσού 5-nm, αλλά κύτταρο εισβολή αυξήθηκε. Ενδοκυτταρώνεται νανοσωματίδια χρυσού (μέγεθος, 10 nm) κυρίως προώθησε τη δραστηριότητα εισβολή 95δ κύτταρα. Όλες αυτές οι επιδράσεις της νανοσωματίδια χρυσού δεν παρατηρήθηκαν μετά από θεραπεία με μεγαλύτερα σωματίδια (20 και 40 nm). Η ενισχυμένη δραστηριότητα εισβολή μπορεί να σχετίζεται με την αυξημένη έκφραση του μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας 9 και ενδοκυτταρικής προσκόλλησης μορίου-1. Σε αυτή τη μελέτη, ως μάρτυρες για την επίδραση των νανοσωματιδίων χρυσού για τη δράση των κυττάρων εισβολής καρκίνου του πνεύμονα in vitro. Επιπλέον, μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης 9 και ενδοκυτταρικής προσκόλλησης μόριο-1, ρυθμιστές κλειδιά του κυττάρου εισβολή, βρέθηκε να ρυθμίζεται από νανοσωματίδια χρυσού. Αυτά τα δεδομένα επίσης δείχνουν ότι οι απαντήσεις του Α549 και 95δ κύτταρα σε νανοσωματίδια χρυσού έχουν μια αξιοσημείωτη σχέση με μοναδικές φυσικοχημικές ιδιότητες του μεγέθους που εξαρτώνται τους. Ως εκ τούτου, η μελέτη αυτή παρέχει μια νέα προοπτική για την έρευνα κυτταρικής βιολογίας στο νανοϊατρική

Παράθεση:. Liu Ζ, Wu Υ, Guo Ζ, Liu Υ, Shen Υ, Zhou P, et al. (2014) Επιδράσεις των εσωτερικευμένη νανοσωματίδια χρυσού με Σεβασμός στην κυτταροτοξικότητα και εισβολή στα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (6): e99175. doi: 10.1371 /journal.pone.0099175

Επιμέλεια: Hidayatullah Γ Munshi, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 του Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 12 του Μάη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Ιουνίου του 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (No.81270428 και 81300999). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Προηγούμενες μελέτες διαπίστωσε ότι τα νανοσωματίδια χρυσού (Au-NPS) δείχνουν μικρή κυτταροτοξικότητα, παρά την αποτελεσματική αξιοποίησή τους σε ανθρώπινα κύτταρα με ενδοκύττωση [1], [2], που τους καθιστά κατάλληλους υποψηφίους για νανοϊατρικής. Εκτός βιοσυμβατότητά τους, το γεγονός ότι είναι εύκολο να συντεθούν, χαρακτηρισμό, και επιφανειακά τροποποιούν συνέβαλε στην προσέλκυση πολλή προσοχή σε διάφορες βιοϊατρικές εφαρμογές. Au-ΣΔ έχουν ερευνηθεί ως οχήματα χορήγησης φαρμάκων και θεραπειών φωτοθερμικών και εργαλεία μοριακής απεικόνισης για τις πιθανές biodiagnosis [3], [4]. Τα νανοσωματίδια που βασίζεται θεραπευτικές στρατηγικές για τη θεραπεία του καρκίνου βασίζεται κυρίως στην παράδοση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων για να επάγει απόπτωση [5]. Οι κύριοι λόγοι για τη χρήση νανοσωματιδίων ως φορείς για θεραπευτική παράδοσης είναι να επιτρέψει πολυτροπικών λειτουργικότητες, όπως η απεικόνιση ή ειδική στόχευση, για την αύξηση της διαπερατότητας των ιστών και τη συσσώρευση του φαρμάκου στη συγκεκριμένη τοποθεσία, και για τη μείωση των παρενεργειών στους υγιείς ιστούς [6]. Επί του παρόντος, Αυ-ΣΔ χρησιμοποιούνται σε διάφορες βιοϊατρικές εφαρμογές: δεν μπορούν να χρησιμοποιούνται μόνο ως ικριώματα για όλο και περισσότερο ισχυρός διανομή φάρμακο για τον καρκίνο, αλλά μπορούν επίσης να χρησιμεύσουν ως μέσα επιμόλυνσης για επιλεκτική γονιδιακή θεραπεία και ως εγγενές αντινεοπλασματικών παραγόντων [7] – [9] . Dreaden et al. [8] έχουν δείξει ότι η στοχοθετημένη Au-ΣΔ είναι ικανά να μεταβάλλουν τον κυτταρικό κύκλο, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής διαίρεσης, σηματοδότηση, και τον πολλαπλασιασμό.

Παρά την ευρεία εφαρμογή του Au-ΝΡ, μια σαφή κατανόηση του τρόπου με βιολογικά συστήματα ανταποκρίνονται στα νανοσωματίδια είναι ζωτικής σημασίας, και ο χαρακτηρισμός των μοναδικών μέγεθος που εξαρτάται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες της Au-NPs είναι ένα κρίσιμο συστατικό. Μια προηγούμενη μελέτη απέδειξε ότι το μέγεθος της επιφάνειας του Au-NPs παίζει μεγάλο ρόλο στη θεραπευτική τους δράση [10]. Au-NPs πολύ μικρής διαμέτρου (& lt? 2 nm) μπορούν να διαπεράσουν τα κύτταρα και κυτταρικά διαμερίσματα όπως τον πυρήνα και να είναι εξαιρετικά τοξικά [11]. Για παράδειγμα, βρέθηκε ότι σφαιρικά Au-NPs με διάμετρο 1,4 nm επάγει νέκρωση και μιτοχονδριακή βλάβη σε διάφορες κυτταρικές σειρές μέσω μηχανισμών οξειδωτικό στρες, το οποίο μπορεί να σχετίζεται με τις γνωστές καταλυτική δράση τους σε αυτό το μέγεθος [12]. Μια πρόσφατη μελέτη από τον Connor et al. [1] ανέφεραν ότι σημαντικές ποσότητες μεγαλύτερες Au-NPs (π.χ., 18 nm σε διάμετρο) διεισδύουν μέσα στα κύτταρα, αλλά ότι αυτά τα Au-NPs δεν είναι εγγενώς τοξικές προς τα ανθρώπινα κύτταρα. Chithrani et al. [13] μελέτησαν τη σχέση μεταξύ των κυττάρων Au-NPs και HeLa και πρότεινε ότι Au-NPs εισέλθει στα κύτταρα μέσω ενδοκυττάρωσης με μεσολάβηση υποδοχέα σε μέγεθος κατωφλίου περίπου 50 nm. Δεδομένου ότι δεν υπάρχουν κανονισμοί ασφαλείας ακόμα, η επίδραση του Au-ΝΡ σε κύτταρα εξακολουθεί να απαιτεί περαιτέρω μελέτη.

εισβολή και τη μετάσταση είναι σημαντικά παθολογικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων. Επεμβατική ικανότητα είναι το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό που διακρίνει καλοήθεις από κακοήθεις αλλοιώσεις [14]. Πράγματι, επεμβατική τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να ξεφύγει από τη χειρουργική εκτομή και είναι υπεύθυνος για την επανεμφάνιση του όγκου. Παρά τις προόδους σε χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία και, υποτροπή είναι σχεδόν αναπόφευκτη παρουσία ενός επιθετικού μεταστατικής εξάπλωσης [15], [16]. Η διαδικασία της εισβολής και της μετάστασης περιλαμβάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, διαχωρισμό από τις πρωτογενείς βλάβες, υποβάθμιση, και διαπέραση μέσα στην εξωκυττάρια μήτρα (ECM), μετανάστευση στο αίμα ή λέμφο ρεύμα, την προσκόλληση και την ανάπτυξη σε ένα δευτερεύον όργανο [17]. Προηγούμενες αναφορές έχουν περιγράψει ότι ενδοκυτταρικής προσκόλλησης μόριο-1 (ICAM-1) και μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης 9 (MMP-9) εμπλέκονται στην προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, και τη μετανάστευση, τα οποία συμβάλλουν στην μετάσταση του καρκίνου [18]. Οι συντελεστές αυτοί έχουν θεωρηθεί ως προγνωστικούς βιοδείκτες για την εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα [19]. Περαιτέρω μελέτες σχετικά με τις επιδράσεις του Au-ΝΡ στην έκφραση αυτών των πρωτεϊνών είναι απαραίτητη.

Από την κυτταροτοξικότητα μπορεί να μην είναι το μόνο αποτέλεσμα που νανοσωματίδια μπορεί να προκαλέσει, σε αυτή τη μελέτη, επικεντρωθήκαμε στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη δραστηριότητα εισβολή, και η έκφραση πρωτεΐνης, τα οποία μπορεί να επηρεαστεί από την παρουσία του Au-NPs. Για να διερευνηθεί η σημασία του μεγέθους των σωματιδίων στην νανοϊατρική, επιλέξαμε τέσσερα διαφορετικά μεγέθη Au-ΣΔ (δηλαδή, 5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm) για μια σε βάθος ανάλυση αυτού του συστήματος.

Τέλος, , επιλέξαμε να μελετήσει αυτά τα αποτελέσματα σε δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (δηλαδή, Α549 και 95d), επειδή ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μια σημαντική κακοήθης όγκος στην Κίνα και έχει αυξανόμενη συχνότητα στις περισσότερες πόλεις. Το 2010, υπήρχαν περίπου 600.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα στην Κίνα [20]. Τα ποσοστά νοσηρότητας συνεχίζουν να αυξάνονται με ταχείς ρυθμούς, λόγω της σοβαρής ρύπανσης του αέρα [21]? Ωστόσο, η γνώση των βιολογικών αλληλεπιδράσεων και αποκρίσεις του Au-NPs με ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα είναι πολύ περιορισμένη. Επιπλέον, για να αποκτήσουν μια βασική κατανόηση των διεργασιών που εμπλέκονται, θεωρήσαμε ότι ήταν σημαντικό να επικεντρωθεί αρχικά σχετικά με τις επιπτώσεις των νανοσωματιδίων σε μεμονωμένα καρκινικά κύτταρα, παρά σε ολόκληρο οργάνων, εάν άλλοι παράγοντες μπορεί να περιπλέξει την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Ως εκ τούτου, ο στόχος της έρευνας αυτής ήταν να παρέχει μια σημαντική βάση για την εφαρμογή Au-ΣΔ στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

Μέθοδοι

Παρασκευή και Χαρακτηρισμός του κιτρικού κάλυκα Au-ΣΔ

Au-NPs (5 nm και 10 nm) συντέθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ταννικό κιτρικό διάλυμα οξέως /, στο οποίο ταννικό οξύ παίζει το ρόλο ενός αναγωγικού παράγοντα και κιτρικό δρα ως σταθεροποιητικό παράγοντα [22]. Για κάθε σύνθεση, απαιτήθηκαν δύο αρχικές λύσεις: (α) 1 ml 1% (w /v) HAuCl

4 λύση, η οποία προστέθηκε σε 79 mL νερού? και (β) ένα μίγμα αποτελούμενο από 4 ml 1% (w /v) κιτρικό διάλυμα 0,7 mL ή 0,1 mL 1% ταννικό οξύ, και νερό (για να επιτευχθεί ένας τελικός όγκος των 20 mL). Τόσο (α) και (β) διαλύματα θερμάνθηκαν στους 60 ° C σε υδατόλουτρο και στη συνέχεια διάλυμα (β) προστέθηκε σε (α) υπό συνεχή ανάδευση. Το προκύπτον Au-ΣΔ ψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για τα επόμενα πειράματα.

Συνθέσεις των 20 nm και 40 nm-Au-NPs σταθεροποιούνται με κιτρικά ιόντα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας την κλασσική μέθοδο μείωσης κιτρικό [23] . Για κάθε σύνθεση, 100 mL 0,01% HAuCl

4 διάλυμα θερμάνθηκε μέχρι βρασμού. Επιλεγμένες όγκοι (4,5 ml ή 1,0 ml) κιτρικού διαλύματος 1% προστέθηκαν και βρασμός συνεχίστηκε μέχρις ότου το χρώμα του διαλύματος μετατράπηκε σε ρουμπινί. Το κιτρικό καλυμμένο λύση Au-ΣΔ ψύχθηκε φυσικά σε RT

Η μορφολογία του Au-ΣΔ παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. (TEM? JEM-2100EX, JEOL, Tokyo, Japan) σε τάση επιτάχυνσης 200 kV. Υπεριώδους-ορατού (UV-Vis) φάσματα αποκτήθηκαν με ένα Shimadzu UV-3600 φασματοφωτόμετρο στην περιοχή των 300-1100 nm.

Cell Culture

Α549 και 95d κύτταρα (Σαγκάη Ινστιτούτα Βιολογικών Επιστημών, κινεζική Ακαδημία Επιστημών) καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (όλα από την GIBCO, Invitrogen) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Τα κύτταρα προ-καλλιεργήθηκαν στο μέσο επί μία νύκτα και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία είτε με είτε χωρίς διάλυμα /mL Au-NPs 50 μg για επιπλέον 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη-ethylenediamintetraacetic οξύ (EDTA? GIBCO, Invitrogen) απόσπαση στο λογαριθμική φάση ανάπτυξης και φυγοκεντρήθηκαν. Τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FBS για υποκαλλιέργεια ή άλλες χρήσεις.

Πρόσληψης και ΤΕΜ Studies

Η πρόσληψη του Au-NPs εξετάστηκε επίσης χρησιμοποιώντας ΤΕΜ. Πριν την έκθεση στον Au-ΝΡ, τα κύτταρα Α549 και 95d κύτταρα τοποθετήθηκαν σε συγκέντρωση 1 × 10

6 κύτταρα ανά δίσκο σε δίσκο καλλιέργειας των 100 mm (Corning, USA) που περιέχει το μέσο ανάπτυξης και επωάζονται στους 37 ° C με 5% CO

2 για 24 ώρες. Οι Au-ΕΠ προστέθηκαν στη συνέχεια. Μετά από έκθεση σε Au-NPs για 48 ώρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 3.7% (ν /ν) παραφορμαλδεϋδη σε φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως, τα κύτταρα προετοιμάστηκαν για ανάλυση ΤΕΜ ως εξής: κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 1% (w /v) τετροξείδιο του οσμίου για 2 ώρες, αφυδατώνονται σε διαβαθμισμένη σειρά από 30%, 50%, 70%, 80%, και 90% αιθανόλη , και υποβλήθηκε σε επεξεργασία τρεις φορές με 100% αιθανόλη για 15 λεπτά η κάθε μία. Τα δείγματα στη συνέχεια ενσωματώνεται σε ένα μίγμα ρητίνης σε προπυλενοξειδίου πολυμερίζεται στους 80 ° C. Υπέρλεπτων τμήματα για ΤΕΜ παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα μαχαίρι διαμάντι και τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο μετάδοσης ηλεκτρονίων.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Α549 και 95d κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε χαμηλή συρροή (2000 κύτταρα /φρεάτιο), αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Au-NPs (έλεγχος, 5 nm, 10 nm, 20 nm και 40 nm). Μετά από 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες, ένα αντιδραστήριο ανιχνεύσεως κυτταρικής βιωσιμότητας (καταμέτρηση κυττάρων kit-8, Kaiji, Nanjing) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 1, 2, 3, και 4 ώρες, αντίστοιχα. Οι τιμές απορρόφησης στα 450 nm καταγράφονταν χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πλάκας μικροκαλλιέργειας (BioRad) και η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράζεται ως ποσοστό του μη επεξεργασμένου ελέγχου (η κυτταρική βιωσιμότητα 100%). Η επίδραση του Au-NPs με διαφορετικά μεγέθη για τη βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε εις τριπλούν και τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

ανίχνευσης απόπτωσης με Annexin V /ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) Χρώση

κύτταρα σε λογαριθμική φάση σπάρθηκαν πάνω σε μία πλάκα καλλιέργειας 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο, επωάζονται στους 37 ° C σε CO

2 θερμοκοιτίδα, και αφέθηκε να αποδίδουν τη διάρκεια της νύχτας. Μετά την επεξεργασία με Au-NPs (έλεγχος, 5 nm, 10 nm, 20 nm και 40 nm) για 48 ώρες, η απόπτωση και νέκρωση αναλύθηκαν με το αννεξίνης V-ΡΙ (BD Biosciences) κιτ ανίχνευσης απόπτωσης ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο BD FACS CantoII (BD Biosciences).

Κυτταρομετρίας Ροής ανάλυση του κύκλου Κυττάρου

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη με διάλυμα 1 mM EDTA και σταθερές για 12 h σε 70% αιθανόλη στους 4 ° C. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 3000 rpm για 15 λεπτά για να απομακρυνθεί τελείως η αιθανόλη. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με 3 mL του PBS, επαναιωρήθηκαν σε 1 mL του διαλύματος ΡΙ χρώση, και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το διάλυμα χρώσης αποτελείτο από 20 μg /mL ΡΙ και 0.2 mg /mL RNase Α σε PBS. Τα δείγματα στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα όργανο BD FACS CantoII (BD Biosciences). Είκοσι χιλιάδες γεγονότα συλλέχθηκαν από το κάθε δείγμα. Τα ποσοστά των κυττάρων στην G0 /G1, S και G2 /M φάσεις του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit (BD Biosciences).

Εισβολή Δοκιμασία

Για την δοκιμασία εισβολής , ένθετα καλλιέργεια κρέμονται κυττάρων (8,0-μm μέγεθος πόρου) προ-επικαλύφθηκαν με 50 μg /mL Matrigel (BD Biosciences) στην άνω επιφάνεια. Τα κύτταρα προ-καλλιεργήθηκαν στο μέσο επί μία νύκτα και έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία είτε με είτε χωρίς διάλυμα /mL Au-NPs 50 μg για επιπλέον 48 ώρες, στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν και 2,5 χ 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 200 μΙ ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 0,2% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) στην κορυφή του θαλάμου. Το κάτω μέρος του φρεατίου προστέθηκαν με 750 μΐ DMEM που περιέχει 5% FBS. Η δοκιμασία εισβολή διεξήχθη για 48 ώρες στον επωαστή κυτταροκαλλιέργειας.

Τα κύτταρα στερεώθηκαν με αντικατάσταση του μέσου καλλιέργειας στο κάτω μέρος και την κορυφή του θαλάμου με 4% φορμαλδεΰδη διαλύεται σε PBS. Μετά τον καθορισμό, για 15 λεπτά σε RT, οι θάλαμοι ξεπλύθηκαν σε PBS και χρωματίστηκαν με 0,2% κρυσταλλικό ιώδες επί 10 λεπτά. Μετά την πλύση των θαλάμων πέντε φορές με εμβάπτιση τους σε ένα μεγάλο ποτήρι γεμάτο με dH

2O, τα κύτταρα (τώρα σε μπλε χρώμα) στο πάνω μέρος της μεμβράνης Matrigel απομακρύνθηκαν με τη χρήση αρκετών Q-συμβουλές. Τα κύτταρα απομακρύνονται έως ότου όχι περισσότερο μπλε χρωστική ουσία μπορεί να αφαιρεθεί με τα Q-συμβουλές. Στη συνέχεια, τα κύτταρα που παρέμειναν ήταν αυτά που είχαν εισβάλει και είχε φθάσει στο κάτω μέρος της μεμβράνης.

ποσοτικοποιούνται επίσης τα κύτταρα με τη χρήση της εισβολής QCM ™ 24 φρεατίων κυτταρική διείσδυση φθορομετρική δοκιμασία (Millipore) με ECMatrix επικαλυμμένο ένθετα, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δοκιμασία αυτή παρέχει ένα αποτελεσματικό σύστημα για την ποσοτική αξιολόγηση της εισβολής των κυττάρων όγκου μέσω ενός μοντέλου βασικής μεμβράνης. Α549 και 95d κύτταρα αναπτύχθηκαν επί 2 ημέρες σε πλήρες μέσο, ​​είτε με την απουσία (έλεγχος) ή παρουσία του Au-NPs (5 nm, 10 nm, 20 nm, 40 nm). Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού και εμβολιάζονται (2.5 × 10

5 κύτταρα /250 μΙ) σε κάθε ένθετο ενός πολλαπλών τοιχωμάτων θαλάμου πλάκα. Ορός (10%) προστέθηκε στο μέσο χωρίς ορό στο κατώτερο θάλαμο ως χημειοπροσελκυστικό. Μετά από μια περίοδο επώασης 48 ωρών στους 37 ° C, μη-εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την κορυφή των ενθέτων. Στη συνέχεια, τα ένθετα τοποθετήθηκαν σε ένα καθαρό φρεάτιο που περιέχει ένα προθερμασμένο διάλυμα κυττάρων απόσπαση και επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα ενθέματα απομακρύνθηκαν από τα φρεάτια, και διάλυμα ρυθμιστικού λύσης /βαφή προστέθηκε στο μέσο που περιέχει τα αποκολλημένα κύτταρα για 15 λεπτά σε RT. Τα μίγματα στη συνέχεια διαβάζεται με μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας φθορισμού (Bio-Tek, Synergy ΗΤ) χρησιμοποιώντας ένα σετ φίλτρου 480/520 nm. Οι μετρήσεις φθορισμού αναφέρθηκαν ως τιμές σε σχέση μονάδα φθορισμού (RFU).

Ποσοτική Αντίστροφη Μεταγραφή Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-) Δοκιμασίες

Ολικό RNA απομονώθηκε από μη επεξεργασμένο και Au-NPs επεξεργασμένο Α549 και 95δ κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen Τεχνολογία Life). Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) αντίδραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας 1 μα ολικού RNA, το οποίο μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας ολίγο dT εναρκτήρα και στη συνέχεια qRT- PCR διεξήχθη με τη χρήση του SYBR Green Mix (Applied Bio-systems). Οι αλληλουχίες εκκινητή που χρησιμοποιήθηκε για PCR ήταν ως ακολούθως: ICAM-1, εμπρός ACACTAGGCCACGCATCTGAT, αντίστροφη AGCATACCCAATAGGCAGCAA? MMP-9, προς τα εμπρός GGCTACGTGACCTATGACATCCT, αντίστροφη TCCTCCCTTTCCTCCAGAACA? αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH), προς τα εμπρός GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC, αντίστροφη GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT. PCR διεξήχθη στους 95 ° C για 30 s, στους 60 ° C για 30 s, και 1 λεπτό στους 70 ° C για 35 κύκλους. Η συγκριτική μέθοδος Ct χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί η σχετική αφθονία του mRNA και των αποτελεσμάτων για την έκφραση του γονιδίου-στόχου συγκρίθηκαν με εκείνα για έκφραση GAPDH. Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Protein ποσοτικοί προσδιορισμοί

πρωτεϊνική έκφραση ΜΜΡ9 στο υπερκείμενο και κυτταρολύματος μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ μαγνητικό σφαιρίδιο ΜΜΡ Panel 2 με βάση την τεχνολογία Luminex. Εν συντομία, αντισώματα σύλληψης ΜΜΡ9 (Millipore) συζεύχθηκαν σε σφαιρίδια Luminex (σφαιρίδια περιοχή 33). αντισώματα ανίχνευσης ΜΜΡ9 (Millipore) ήταν συζευγμένο με βιοτίνη μέσω προσαρμοσμένων υπηρεσιών που παρέχονται από την Millipore. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό MILLIPLEX ΜΑΡ λύσης (Millipore) και αραιώνεται με ίσο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος δοκιμασίας ΜΑΡ κύτταρο MILLIPLEX (Millipore). χάντρες αντίσωμα σύλληψης ΜΜΡ9 αραιώθηκαν σε 25 μί ρυθμιστικό διάλυμα ανάλυσης MILLIPLEX κυττάρων ΜΑΡ και προστέθηκε σε μια μαγνητική πλάκα (Millipore). Στη συνέχεια, 25 μL του αραιωμένου κυτταρολύματος ή κυτταρική καλλιέργεια υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε κάθε φρεάτιο της πλάκας στερεού και επωάστηκαν για 2 ώρες σε RT με ανάδευση. Μετά την επώαση, τα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης, και 25 μί αντισώματα ανίχνευσης προστίθενται σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT με ανάδευση. Μετά από αυτό, 25 μί MILLIPLEX ΜΑΡ στρεπταβιδίνη-φυκοερυθρίνη (Millipore) προστέθηκε και επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με ανακίνηση. Τέλος, υγρό περιβλήματος προστέθηκε μετά το πλύσιμο, και το σήμα αναγνώστηκε χρησιμοποιώντας ένα Luminex FLEXMAP 3D ™.

Ανάλυση Western Blot

Για ανάλυση western blot, Α549 και 95d κύτταρα απλώθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας και αντιμετωπίζονται με Au-ΝΡ (έλεγχος, 5 nm, 10 nm, 20 nm και 40 nm). Μετά από 48 ώρες, 5-10 × 10

6 κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με δωδεκυλικού νατρίου ηλεκτροφόρηση πηκτής θειικού-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά πάνω σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα για 2 ώρες και επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντίσωμα κουνελιού αντι-ΜΜΡ-9 (1:1000, Abcam), αντι-ΙΟΑΜ-1 αντίσωμα κουνελιού (1:500, Cell σηματοδότηση), ή αντι-GAPDH αντίσωμα ποντικού (1:10000, Abmart). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως ο έλεγχος γονίδιο οικοκυρική και τα επίπεδα έκφρασης του ΜΜΡ9 και ICAM-1 ομαλοποιήθηκαν σε σχέση με GAPDH. Οι πρωτείνες ανιχνεύθηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας και οπτικοποιούνται με αντιδραστήρια χημιφωταύγειας που παρέχονται με το κιτ ECL (BioRad, USA). Ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια και ποσοτικά με τη χρήση XRS ChemiDoc μοριακό απεικονιστή (BioRad).

Στατιστική Ανάλυση

αναλύει GraphPad Prism 5 στατιστικό λογισμικό χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις στατιστικές αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή ( GraphPad Prism έκδοση 5.00 για Windows, GraphPad Software, San Diego California, USA). Όλα τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Στατιστικές συγκρίσεις έγιναν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από το του Dunnett

t-test

για σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε Ρ & lt?. 0.05

χρησιμοποιήθηκαν

Αποτελέσματα

Σύνθεση και Χαρακτηρισμός Au-ΝΡ

Au-ΣΔ συντίθεται με την μέθοδο μείωσης κιτρικό, χωρίς καμία περαιτέρω τροποποίηση για όλες τις μελέτες και εδώ αναφέρονται ως μη τροποποιημένο νανοσωματίδια. Για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ του μεγέθους και της βιολογικής λειτουργίας των νανοσωματιδίων, χρησιμοποιήσαμε Au-NPs τεσσάρων διαφορετικών μεγεθών (5, 10, 20, ή 40 nm) και η οποία χαρακτηρίζεται τους με ΤΕΜ και UV-Vis φασμάτων (Εικόνα 1). Τα σωματίδια φαίνονται να είναι όλα σφαίρες με στενές κατανομές μεγέθους. Οι υψηλές πυκνότητες ηλεκτρονίων του Au-ΝΡ, καθώς και η ομοιογένεια του σχήματος και του μεγέθους τους, τους έκανε ιδιαίτερα εμφανής κάτω από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.

ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης (ΤΕΜ) εικόνες του Au-ΝΡ με διαμέτρους (Α ) 5 nm, (Β) 10 nm, (C) 20 nm, ή (D) 40 nm. Τα ένθετα δείχνουν εικόνες υψηλής ανάλυσης. Κλίμακα μπαρ, 20 nm και 100 nm (όπως αναγράφεται). Ε: UV-vis φασμάτων του Au-ΣΔ με 5-nm, 10 nm, 20 nm και 40 nm διάμετρο

Η

Η εσωτερίκευση του Au-ΝΡ

. για να διερευνηθεί αν Au-NPs με διάφορα μεγέθη πέρασε την κυτταρική μεμβράνη και όπου βρίσκονται, Α549 και 95d κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες με την παρουσία του Au-NPs (5, 10, 20, και 40 nm) σε πλήρες μέσο κυτταρικής καλλιέργειας . Το Σχήμα 2 δείχνει την εσωτερικοποίηση του διαφορετικού μεγέθους Au-NPs. Τα περισσότερα από τα σωματίδια βρέθηκαν σε κυστίδια δεσμευμένη σε μεμβράνη ή στην περιπυρηνική περιοχή εντός των κυττάρων.

εικόνες ΤΕΜ στα 200 nm-μεγέθυνση που δείχνει την εσωτερίκευση των 25 μg /mL Au-NPs με διάφορα μεγέθη (5 nm , 10 nm, 20 nm και 40 nm) σε (Α) Α549 και (Β) 95d κυττάρων μετά από 48 ώρες θεραπείας.

η

Μέτρηση της κυτταροτοξικότητας του Au-NPs

στη συνέχεια, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί η επίδραση αυτών των Au-NPs επί του πολλαπλασιασμού των δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, Α549 και 95d κύτταρα. Η κυτταροτοξική δράση στα τέσσερα Au-NPs με διαφορετικές διαμέτρους δοκιμάστηκε στην ίδια συγκέντρωση. Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι 5-nm Au-NPs παίζουν κεντρικό ρόλο στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των δύο Α549 και 95d κύτταρα σε 48 h και 72 h (Σχήματα 3Α και Β). Au-ΣΔ, με διάμετρο από 20 nm και 40 nm επέδειξε αξιοσημείωτη αποτελεσματικότητα από 24 ώρες μετά την προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Α549, ενώ δεν παρατηρήθηκε προώθηση στην 95δ κύτταρα (Σχήματα 3Α και Β). Au-NPs με διάμετρο 10 nm δεν είχε καμία επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των δύο Α549 και 95d κύτταρα. Αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, αυξάνοντας την κυτταρική απόπτωση, και συλλαμβάνοντας τα κύτταρα στον κύκλο G0 /G1 εκδηλώνεται την κυτταροτοξικότητα της 5-nm Au-NPs. Δεν υπήρξε σημαντική διαφορά (Ρ & gt? 0,05) στην απόπτωση και την κατανομή κυτταρικού κύκλου για την 10-nm, 20-nm, και 40-nm ομάδες AUNP αγωγή (Σχήματα 3C-Η). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι μικρές Au-ΝΡ μπορεί να είναι κυτταροτοξικά και ότι η διάμετρος δεν είναι ο μόνος παράγοντας που επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αλληλεπίδραση μεταξύ Au-ΣΔ, η οποία είναι μια πολύ σύνθετη διαδικασία που δικαιολογεί περαιτέρω διερεύνηση.

Το κύτταρο γραμμές Α549 (Α) και 95d (Β) στην λογαριθμική φάση ανάπτυξης εξετέθησαν σε Au-NPs για 24 ώρες, 48 ώρες, και 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίζεται ως το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων σε σύγκριση με τα δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής. Κάθε αποτέλεσμα αντιπροσωπεύει τη μέση βιωσιμότητα ± τυπική απόκλιση (SD) τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Η απόπτωση (C-D) και του κυτταρικού κύκλου (Ε-Η) αναλύσεις Α549 και 95d κύτταρα επεξεργασμένα με διαφορετικού μεγέθους Au-NPs. Οι ράβδοι σφάλματος δεικνύουν τιμές SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt?. 0.001

Η

Εισβολή Δοκιμασία

Ένα μοντέλο βασική μεμβράνη χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της δραστηριότητας εισβολή των κυττάρων. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 4. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι κυτταρικές εισβολή προήχθη σημαντικά μετά την αγωγή του Α549 με 5-nm Au-NPs και 95d κυττάρων με 10-nm Au-NPs (Ρ & lt? 0,05). Σε αντίθεση, τα κύτταρα που εσωτερικεύεται με 20-nm ή 40-nm Au-NPs δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από την δραστηριότητα εισβολής (Σχήμα 4). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν σαφώς ότι οι επιπτώσεις εισβολή ήταν μεγέθους- σωματιδίων και τον τύπο του κυττάρου-εξαρτώμενη.

Οι εικόνες που αντιπροσωπεύουν κύτταρα Α549 (Α) και 95δ κύτταρα (Β) που έχουν διασχίσει τους πόρους του θαλάμου εισβολής Matrigel και τα αντίστοιχα αποτελέσματα ένταση φθορισμού. * P & lt? 0,05. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν τις τιμές SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Επιπτώσεις του Au-ΝΡ στην έκφραση της ΜΜΡ9 και ICAM-1 σε κύτταρα του πνεύμονα Καρκίνος

Για να αποκτήσουν μια βαθύτερη κατανόηση των Αυτό το φαινόμενο, qRT-PCR διεξήχθη για να μετρηθούν τα επίπεδα του mRNA της ΜΜΡ9 και ICAM-1 μετά από αγωγή με Au-NPs. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι 5-nm και 10 nm-Au-NPs κυρίως να διευκολύνει την έκφραση του mRNA του ICAM-1 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήματα 5Β και D, Ρ & lt? 0,05). Η έκφραση του mRNA της ΜΜΡ9 αυξήθηκε σε 5-nm Au-NPs-επεξεργασμένα κύτταρα Α549 και 10 nm Au-NPs επεξεργασμένα 95d κύτταρα αλλά οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (Σχήμα 5Α και C). Στη συνέχεια εκτελείται ένα πείραμα με Luminex που βασίζεται στην παρουσία του ΜΜΡ9 μαγνητικών σφαιριδίων να ποσοτικοποιηθεί η πρωτεΐνη έκφραση ΜΜΡ9 τόσο στο προϊόν λύσης κυττάρου και υπερκείμενο της καλλιέργειας. Τα αποτελέσματά μας απεικονίζονται ότι η θεραπεία με 5-nm Au-NPs σημαντικά αυξημένα τα επίπεδα της ΜΜΡ9 στο λύμα των κυττάρων Α549, ενώ ΜΜΡ9 ήταν κυρίως ρυθμίζεται αυξητικά στο προϊόν λύσης των κυττάρων 95d με επεξεργασία με 10-nm Au-NPs (σχήματα 6 Α- ΣΙ). Οι συγκρίσεις με το επίπεδο της ΜΜΡ9 στο υπερκείμενο απεκάλυψε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά (Ρ & gt? 0,05). Μεταξύ του Au-NP-θεραπεία και Au-NP-ανεπεξέργαστων Α549 και 95d (σχήματα 6, C-D)

Αποτελέσματα qRT-PCR για το (Α-Β) Α549 και 95d κυττάρων μετά από 48 ώρες επώασης με 5-nm, 10 nm, 20-nm, ή 40-nm Au-NPs (C-D). * P & lt? 0,05, *** P & lt? 0,001 έναντι του ελέγχου. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τις τιμές SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Ποσοτικοποίηση της έκφρασης του ΜΜΡ9 στο προϊόν λύσης κυττάρου (Α-Β) και το υπερκείμενο (C-D) του Α549 και 95d κύτταρα, αντίστοιχα , διεξήχθη χρησιμοποιώντας την τεχνολογία Luminex. * P & lt? 0,05. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν τις τιμές SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Επιπλέον, ερευνήσαμε την έκφραση πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΜΜΡ9 και ICAM-1 απορυθμίζεται στα προϊόντα λύσης των Α549 και 95d κύτταρα με επεξεργασία με 5-nm και 10 nm-Au-NPs, αντίστοιχα (Σχήμα 7)? Σε αντίθεση, ΜΜΡ9 και ICAM-1 ρυθμίζεται προς τα κάτω από επεξεργασία με 40-nm Au-NPs, υποδηλώνοντας ότι Au-NPs μέγεθος σωματιδίου παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση αυτών των πρωτεϊνών. Αυτά τα αποτελέσματα έδωσαν την απόδειξη ότι ΜΜΡ9 και ICAM-1, ρυθμιστές κλειδιά του κυττάρου εισβολής, θα μπορούσε να ρυθμιστεί με Au-NPs.

Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα που δείχνουν την επίδραση της θεραπείας Au-NPs στην έκφραση της ΜΜΡ9 και ICAM- 1 σε Α549 (Α) και τα κύτταρα 95d (Β). Σχετική πυκνότητα μπάντα των ΜΜΡ9 και ICAM-1 με τη μέση τιμή της ομάδας ελέγχου (C-H). Οι τιμές εκφράζονται ως σχετική ένταση κανονικοποιείται ένταση GAPDH και δίδονται ως μέση ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt?. 0,001 έναντι του ελέγχου

Η

Συζήτηση

Το χαμηλό κόστος παραγωγής και σχετική ευκολία να συνθέσει Au-ΣΔ κάνει αυτά είναι εφικτό για τις μελλοντικές βιοϊατρικές εφαρμογές. Ωστόσο, με τη μετάβαση του Au-NPs από τον πάγκο στην κλινική, πολύ περισσότερο η γνώση απαιτείται για τις θεμελιώδεις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των υλικών νανοκλίμακας και βιολογικά συστήματα. Η βιοασφάλεια και βιοσυμβατότητα του Au-ΝΡ είναι ζωτικής σημασίας ανησυχίες που θα πρέπει να αποδεικνύεται πριν από τέτοια υλικά εφαρμόζονται σε βιολογικά συστήματα. Παρόμοια με πολλές άλλες αναφορές [24], [25], σε αυτή τη μελέτη, Au-εθνικά κοινοβούλια είχαν απορροφηθεί ευκολότερα από Α549 και 95δ κύτταρα μέσω της μη ειδικής ενδοκύτωσης και βρίσκονται εντός κυτταροπλασματική κυστίδια. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι οι μικρές Au-NPs με διάμετρο 5 nm εμφανίζουν υψηλή αποτελεσματικότητα στην αναστολή του πολλαπλασιασμού, την προώθηση της απόπτωσης, και συλλαμβάνοντας τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0 /G1 σε δύο πνεύμονα καρκινικές κυτταρικές σειρές. Σε αντίθεση, κανένας προφανής κυτταροτοξικότητα παρατηρήθηκε σε 10 nm, 20 nm και 40 nm Au-NP-επεξεργασμένα κύτταρα, το οποίο είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα άλλων ερευνητικών ομάδων. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι το μέγεθος της επιφάνειας, και όχι επιφανειακά χρέωση, παίζει μεγάλο ρόλο στη θεραπευτική δράση του Au-ΝΡ [26]. Σε γενικές γραμμές, Au-ΣΔ για εφαρμογές χορήγησης φαρμάκων και θεραπεία φωτοθερμικών έχουν διαστάσεις μεγαλύτερες από 10 nm, η οποία είναι αρκετή για να μειώσει την αντιδραστικότητα επιφάνειας και έτσι κάνει χρυσό πυρήνες καλοήθης. Ένα μέγεθος μεγαλύτερο από 6-8 nm είναι επίσης βέλτιστη για απαγορεύει νεφρικής απέκκρισης και κατά συνέπεια μειώνεται η κυκλοφοριακή ημιζωή [27]. Απροσδόκητα, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Α549 προήχθη μετά από αγωγή 24 ώρες με Au-NPs των 20 nm ή 40 nm σε διάμετρο. Το φαινόμενο αυτό δεν παρατηρήθηκε σε 95d κύτταρα. Επιπλέον, 5-nm Au-NPs και 10 nm προώθησε σημαντικά την εισβολή του Α549 και 95d κύτταρα, αντίστοιχα, ενώ η διεισδυτική ικανότητα δεν επηρεάστηκε με την παρουσία σωματιδίων με μέγεθος μεγαλύτερο από 20 nm. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την άποψη ότι η Au-ΣΔ δεν καθολικά στοχεύουν όλους τους τύπους κυττάρων [28]. Coulter et al. Βρέθηκε ότι ο επιζών κλάσμα για Au-NPs επεξεργασμένα κύτταρα έδειξαν μία ισχυρή εξάρτηση από τον κυτταρικό τύπο σε σύγκριση με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων σε σχέση με την ραδιοευαισθητοποίηση δυναμικό [24].

Στη μελέτη μας, η βελτιωμένη ικανότητα εισβολής ήταν συνοδεύεται από αξιοσημείωτη ρύθμιση προς τα πάνω του ICAM-1 και την έκφραση της ΜΜΡ-9. Εισβολή μέσω της ECM είναι ένα σημαντικό βήμα στη μετάσταση του όγκου. Τα καρκινικά κύτταρα κινήσει εισβολή με την υιοθέτηση και διάδοση κατά μήκος του τοιχώματος των αιμοφόρων αγγείων. μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας είναι ενδοπεπτιδάσες που είναι σε θέση να αποδομούν τα συστατικά ECM, η οποία επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να έχουν πρόσβαση στο αγγειακό σύστημα και το λεμφικό σύστημα [29] – [31]. ΜΜΡ-9 έχει προσελκύσει μεγάλη προσοχή για την ικανότητά του να αποδομούν το κολλαγόνο τύπου IV, το βασικό συστατικό της βασικής μεμβράνης [32]. Αυξημένη έκφραση της ΜΜΡ-9 σε ασθενείς με καρκίνο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα έχει αναφερθεί [33], [34]? Ως εκ τούτου, οι παράγοντες καταστολή της έκφρασης των ΜΜΡ θα μπορούσαν να αναστείλουν τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [35]. ICAM-1 είναι ένα αντιπροσωπευτικό μόριο προσκόλλησης που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση μεταξύ των κυττάρων του όγκου, το ενδοθήλιο, και ECM. Υψηλή έκφραση του ICAM-1 σε ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του πνεύμονα συσχετίστηκε με μεγαλύτερο κίνδυνο προηγμένων καρκίνων (σταδίων III και IV). Α549 ICAM-1 κύτταρα /δείχθηκε ότι επάγουν in vitro εισβολή κυττάρων και in vivo μετάσταση όγκου [36]. Denissenko et al. παρατήρησε ότι το ICAM-1 προς τα κάτω ρύθμιση σε επίπεδο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης οδήγησε σε ισχυρή καταστολή των κυττάρων του μαστού εισβολή ανθρώπινων διαμέσου μιας μήτρας Matrigel [37]. Βρήκαμε ότι το 5-nm και 10 nm-Au-NPs προώθησε αποτελεσματικά την έκφραση του ICAM-1 και ΜΜΡ9 σε Α549 και 95d κύτταρα, αντίστοιχα, τα οποία εξηγούνται εν μέρει την ενισχυμένη δράση των σωματιδίων επί καρκινικών κυττάρων εισβολής.

Δεδομένου ότι τα αποτελέσματα προς τα πάνω ρύθμιση του Au-NPs επί ΜΜΡ-9 και ICAM-1 έκφραση σε Α549 και 95d κύτταρο πρότεινε ότι τα μικρά σωματίδια θα μπορούσαν να έχουν την ικανότητα να διευκολύνει την εισβολή των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα, περαιτέρω in vivo μελέτες απαιτούνται για την επιβεβαίωση των μηχανισμών. Εν περιλήψει, η θεραπεία με 5-nm Au-NPs ανέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και προώθησε την απόπτωση, αλλά ρυθμίζεται αυξητικά επίσης την έκφραση του ICAM-1 και ΜΜΡ9, καθώς και η αυξημένη την εισβολή των κυττάρων Α549. Σε αντίθεση, Mukherjee et al. ανέφεραν ότι Au-NPs (5 nm σε διάμετρο) εμφάνισαν αντι-αγγειογενετικές ιδιότητες (δηλαδή, ανέστειλαν την ογκογόνο ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων) τόσο in vitro όσο και in vivo [38].