Αφηρημένο

TP53 είναι η πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου (HNSCC), με μεταλλάξεις που σχετίζονται με την αντοχή στη συμβατική θεραπεία. Αποκατάσταση φυσιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης ρ53 έχει προηγουμένως ερευνηθεί μέσω της χρήσης RITA (επανενεργοποίηση του ρ53 και επαγωγή των καρκινικών κυττάρων απόπτωση), ένα μικρό μόριο το οποίο επάγει μία διαμορφωτική αλλαγή στην ρ53, οδηγώντας σε ενεργοποίηση των κατάντη στόχους της. Στην παρούσα μελέτη βρήκαμε ότι ΡΙΤΑ ασκεί πράγματι σημαντικές επιπτώσεις στα κύτταρα HNSCC. Ωστόσο, σε αυτό το μοντέλο, βρήκαμε ότι ένα σημαντικό αποτέλεσμα της αγωγής RITA επιταχύνθηκε γήρανση. ΡΙΤΑ επαγόμενη γηρασμό σε διαφορετικά υπόβαθρα ρ53, συμπεριλαμβανομένων κυττάρων ρ53 null. Επίσης, η αναστολή της έκφρασης p53 δεν φάνηκε να αναστέλλει σημαντικά την RITA προκαλούμενη γήρανση. Έτσι, το φαινόμενο αυτό φαίνεται να είναι μερικώς ρ53-ανεξάρτητη. Επιπλέον, ΡΙΤΑ προκαλούμενη γήρανση φαίνεται να διαμεσολαβείται εν μέρει από την ενεργοποίηση της απόκρισης βλάβης του DNA και SIRT1 (σιωπηλές πληροφορίες ρυθμιστής Τ1) αναστολή, με συνεργική δράση παρατηρείται με το συνδυασμό είτε ιονίζουσα ακτινοβολία ή η αναστολή SIRT1 με θεραπεία RITA. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν προς ένα νέο μηχανισμό λειτουργίας RITA, καθώς και υπόδειξη για πιθανές θεραπευτικές παροχές, HNSCC

Παράθεση:. Chuang HC, Yang LP, Fitzgerald AL, Οσμάν Α, Woo SH, Myers JN, κ.ά. . (2014) Η p53-Επανενεργοποίηση μικρό μόριο ΡΙΤΑ Προκαλεί γήρανση σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. PLoS ONE 9 (8): e104821. doi: 10.1371 /journal.pone.0104821

Επιμέλεια: Αριάννα L. Kim, Πανεπιστήμιο Κολούμπια Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Απριλίου 2014? Αποδεκτές: 16 Ιουλίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Αυγούστου του 2014

Copyright: © 2014 Chuang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Head και το Βραβείο Ανάπτυξης τραχήλου SPORE Σταδιοδρομίας (ΕΣ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μεταλλάξεις σε

ΤΡ53

είναι μια κοινή γενετική μεταβολή υπάρχει σε πολλούς τύπους συμπαγούς όγκου, περιλαμβανομένης της κεφαλής και του καρκινώματος των πλακωδών κυττάρων του λαιμού (HNSCC) [1], [2]. Η ομάδα μας και άλλοι έχουν δείξει ότι

Οι ΤΡ53

μεταλλάξεις που σχετίζονται με αυξημένη αντοχή σε ακτινοβολία και χημειοθεραπεία σε HNSCC κυτταρικές σειρές

in vitro

και με κακή έκβαση σε ασθενείς με HNSCC [3] – [5 ]. Δυστυχώς, θεραπευτικές στρατηγικές για να εισαγάγει εκ νέου άγριου τύπου (wt) p53 σε έχουν όγκους εφοδιαστικά πρόκληση [6], και έτσι οι στρατηγικές που διερευνώνται για θεραπευτικούς εκ νέου ενεργοποίηση του ενδογενούς p53 αντί [7] – [10]. Μία ένωση που μας ενδιαφέρει, RITA (επανενεργοποίηση του ρ53 και επαγωγή των καρκινικών κυττάρων απόπτωση), είναι ένα μικρό μόριο που συνδέεται με το Ν-άκρο της πρωτεΐνης ρ53 και προκαλεί μία διαμορφωτική μεταβολή που μπορεί να οδηγήσει σε αποκατάσταση της κανονικής λειτουργίας ρ53 [11] , [12]. RITA μπορεί να ενεργοποιήσει την ρ53 καθοδικά στόχους τόσο p53 κ.β. [13], [14] και τα κύτταρα ρ53 μεταλλαγμένη (mt) [15] σε μία ποικιλία μοντέλων.

RITA πιστεύεται ότι δρουν κυρίως μέσω της επαγωγής της απόπτωσης , και μάλιστα RITA, μόνα τους ή σε συνδυασμό με σισπλατίνη, μπορεί να διεγείρει απόπτωση σε πολλά HNSCC κυτταρικές γραμμές [16], [17]. Ωστόσο, αυτή η επίδραση δεν είναι καθολική. Κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν ννί ρ53 αλλά δεν έχουν υποστεί απόπτωση σε απόκριση στη θεραπεία περιλαμβάνει την RITA HNSCC κυτταρική γραμμή JHU-028 [17], η ανθρώπινη οστεοσαρκώματος SJSA κυτταρική γραμμή και η κυτταρική γραμμή καρκινώματος κόλου του ανθρώπου RKO [18].

η απόπτωση δεν είναι η μόνη κυτταρική μοίρα μετά την ενεργοποίηση της ρ53. Πολυάριθμες μελέτες έχουν διαπιστώσει ότι η ενεργοποίηση της ρ53 σε απόκριση σε μία ποικιλία ερεθισμάτων σε καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε επιταχυνόμενη γήρανση [7]. Παρά το γεγονός ότι το τελικό αποτέλεσμα του κυττάρου μετά την έναρξη γηρασμού είναι ασαφής, αρκετές μελέτες έχουν συνδέσει την επαγωγή του γηρασμού με απόκριση σε θεραπευτικούς παράγοντες. Έχουμε παρατηρήσει ότι η ακτινοβολία [3] και σισπλατίνης [4] ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων μέσω επαγωγής γήρανση σε wt κύτταρα ρ53 HNSCC. Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση, τα κύτταρα που εκφράζουν HNSCC mt ρ53 βρέθηκαν να είναι ανθεκτικά σε ακτινοβολία ή σισπλατίνη, σε μεγάλο βαθμό λόγω της έλλειψης μιας απόκρισης γήρανσης. Παρατηρήσαμε επίσης ότι πολλές από αυτές τις ίδιες κυτταρικές σειρές είναι επίσης ανθεκτικά σε θεραπεία απόπτωσης [3], [4]. Έτσι, τουλάχιστον σε αυτό το μοντέλο, η επαγωγή του γηρασμού φαίνεται να αντικατοπτρίζει μια ευνοϊκή έκβαση της θεραπείας.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει την επίδραση της RITA στην επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό και την επαγωγή της γήρανσης σε πολλά ανθρώπινα HNSCC κυτταρικές γραμμές. Επιδιώξαμε επίσης να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς με τους οποίους αυτές οι επιδράσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Οι κυτταρικές σειρές HNSCC που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν πλούσια δώρα από τον Dr. Jeffrey Myers (Το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου και έχουν προηγουμένως χαρακτηριστεί [19]. HN30 και κυτταρικές γραμμές HN31 προήλθαν από πρωτοπαθή όγκο και λέμφου κομβικά μετάσταση του φαρυγγικού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, αντίστοιχα. Το σύνολο exome αυτών των δύο κυτταρικών σειρών έχει αλληλουχία για ένα ξεχωριστό σχέδιο και, με την εξαίρεση των ΤΡ53, δεν παρατηρήθηκαν άλλες ασύμφωνα μεταλλάξεις ανάμεσα στις δύο κυτταρικές σειρές. Η κυτταρική γραμμή PCI-13 που προέρχεται από ένα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων της στοματικής κοιλότητας. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε Dulbecco τροποποιημένο μέσο Eagle που περιέχει 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, γλουταμίνη, πυροσταφυλικό νάτριο, μη απαραίτητα αμινοξέα και βιταμίνες. Τεχνικές για σταθερώς να χτυπήσει κάτω ρ53 σε κύτταρα HN30 (τα οποία έχουν wtp53) και τα κύτταρα HN31 (τα οποία έχουν mt ρ53) είναι περιγράφεται αλλού [3]. PCI-13 κύτταρα, τα οποία δεν έχουν καμία ενδογενή ρ53, είχαν κατασκευαστεί για να εκφράζουν

ΤΡ53

κατασκευάσματα υπερέκφραση (wt ρ53, A161S, G245D), που παράχθηκαν και εισάγεται σε έναν ρετροϊικό φορέα που περιέχει ένα pBabe εισαγωγή πουρομυκίνη αντίσταση ( ρΒΑΒΕ-puro? Addgene) χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές κλωνοποίησης. κύτταρα HN31 επιμολύνθηκαν με βραχείας φουρκέτας RNA (shRNA) ειδικό για SIRT-1 (σιωπηλή πληροφορίες ρυθμιστής Τ1) ή ελέγχου κωδικοποιημένο shRNA μέσω φορείς λεντοϊών που περιέχουν το γονίδιο πουρομυκίνης-αντίσταση από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα ελέγχου λεντοϊό επιμολυσμένα (HN31-C2) και shRNA τους, σταθερή SIRT-1-knockdown ομόλογό (HN31-S19) απομονώθηκαν με ανοσοστύπωση μετά υποβλήθηκαν σε διαλογή κλώνων. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης.

Αντισώματα και ανοσοστύπωση

πρωτεϊνών και φωσφορυλιωμένη επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης εκτιμήθηκαν με ανοσοστύπωμα λύματα ολόκληρων κυττάρων από κύτταρα κατεργασμένα ή μη κατεργασμένα με RITA. Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: ρ53 (DO-1) και φωσφο-σερίνη 15 ρ53 από την Santa Cruz Biotechnology? p21 από Calbiochem? p-p53 (Ser-15), ρ53-ρυθμίζεται προς τα πάνω ρυθμιστής της απόπτωσης (PUMA), μυοειδούς διπλό minute2 (MDM2), σημείο ελέγχου κινάσης 2 (Chk2), φωσφορυλιωμένο Chk2 (ρ-Chk2, Thr68), SIRT1, και β-ακτίνης από Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Goat αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα σε ραφανιδική υπεροξειδάση αγοράστηκαν από την Cell Signaling και Santa Cruz Biotechnology, αντίστοιχα.

Αντιδραστήρια

RITA αγοράστηκε από την Cayman Chemical (Αηη Arbor, ΜΙ ) και ο αναστολέας κινάσης πρωτεΐνης σταυροσπορίνη αγοράστηκε από την Sigma (St Louis, ΜΟ). Ο αναστολέας SIRT1 Tenovin-6 ελήφθη από την Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). RITA διαλύθηκε σε 100% διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε μία συγκέντρωση αποθέματος 50 mM και αποθηκεύεται ως κλάσματα μέχρι τη χρήση. Η σταυροσπορίνη και Tenovin-6 διαλύθηκαν σε 100% DMSO και νερού, αντίστοιχα, σε συγκεντρώσεις στοκ 1 Μ και φυλάχθηκε σαν δείγματα μέχρι τη χρήση.

δοκιμασίες καταστολή της ανάπτυξης

Η δοκιμασία βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, κύτταρα 2000 /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις RITA για μέχρι και 72 ώρες, και η βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ. Για την δοκιμασία αποικίας σχηματισμός [3], τα κύτταρα HNSCC σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων για 24 ώρες, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RITA, και καλλιεργήθηκαν για 10-14 ημέρες. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα φορμαλίνης /10% 3% crystal violet και οι αποικίες που περιέχουν περισσότερο από 50 κύτταρα μετρήθηκαν με λογισμικό ImageJ.

γηρασμό associated- β-γαλακτοσιδάσης χρώση

Γήρανση σχετιζόμενη β-γαλακτοσιδάση (SA-β-gal) χρώση διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Cell Signaling Technology). Εν συντομία, τα κύτταρα HNSCC επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RITA σε διάφορες συγκεντρώσεις για διάφορους χρόνους (συνήθως 5 ημέρες), μετά το οποίο τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν για 10 λεπτά και χρωματίστηκαν για δραστικότητα SA-β-gal όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Ισοπέδωσε και τα κύτταρα μπλε χρώση βαθμολογήθηκαν ως γηρασμένα και αναφέρεται ως ποσοστό όλων των κυττάρων που παρατηρούνται ανά πεδίο υψηλής ισχύος.

Στατιστικές αναλύσεις

Τα δεδομένα συγκεντρώθηκαν για ανάλυση από διάφορα ανεξάρτητα πειράματα, και δοκιμασίες με βάση κύτταρα έγιναν εις τριπλούν. Δύο κατεύθυνσης Student

t

δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των διαφορών σε γήρανση και για άλλες μη ζευγαρωμένα συγκρίσεις ομάδας. Για όλες τις συγκρίσεις,

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της RITA για p53 και p53 πρωτεϊνών που σχετίζονται

χρησιμοποιείται. ένα ζεύγος κυτταρικών σειρών ισογονιδιακών HNSCC, ένα με wt ρ53 (HN30) και το άλλο με mt ρ53 (HN31), για να ελεγχθεί η επίδραση της RITA στην έκφραση και η φωσφορυλίωση της ρ53 και άλλων σχετικών πρωτεϊνών. RITA επάγεται έντονα την φωσφορυλίωση της ρ53 και ρ21 μετά από 12 ώρες στα κύτταρα HN30 και μετά από 24 ώρες στα κύτταρα HN31 (Εικ. 1Α). επίπεδα πρωτεΐνης PUMA ήταν επίσης αυξημένα μετά από 24 ώρες έκθεσης σε RITA στις δύο κυτταρικές σειρές. Οι αυξήσεις στην έκφραση της ρ53, φωσφορυλίωση ρ53, και η έκφραση PUMA στις 24 ώρες ήταν όλοι δοσοεξαρτώμενη (Εικ. 1Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μπορεί να ενεργοποιήσει RITA κατάντη στόχοι της σηματοδότησης ρ53 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές ισογονιδιακές με ννί ή mt ρ53.

(Α και Β) HN30 (άγριου τύπου ρ53) και HN31 (μεταλλαγμένο ρ53) κεφαλής και του τραχήλου καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RITA για τους υποδεικνυόμενους χρόνους (Α) και δόσεις (Β) και την έκφραση της ρ53 και τους στόχους της εκτιμήθηκαν με ανοσοκηλίδωση. (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RITA (0,1 μΜ-20 μΜ) για 72 ώρες και αξιολογήθηκε μέσω ανάλυσης ΜΤΤ. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.E από τρία πειράματα. (D) HN30 και HN31 κύτταρα επεξεργάστηκαν με RITA στις ενδεικνυόμενες δόσεις για 10-14 ημέρες, μετά τις οποίες είχαν καθορισθεί αποικίες, χρωματίζονται και ποσοτικά. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από τρία πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα φαίνονται. Τα ποσοτικά δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.E από τρία πειράματα. * – Δηλώνει p & lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

ΡΙΤΑ αναστέλλει την ανάπτυξη των γραμμών καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κυττάρων

Αρκετές μελέτες έχουν ότι ΡΙΤΑ μπορεί να προκαλέσει τον θάνατο των καρκινικών κυττάρων [15], [. ,,,0],18]. Αρχικά, ελέγξαμε εάν RITA μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων και HN30 HN31. Χρησιμοποιώντας μια βραχυπρόθεσμη δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων, βρήκαμε ότι RITA, σε συγκεντρώσεις πάνω από 5 μΜ, επαγόμενη καταστολή μέτρια αύξηση στα δύο κύτταρα HN30 και HN31 μετά από 72 ώρες συνεχούς θεραπείας (Εικ. 1 C). Σε μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας μακροπρόθεσμα, ΡΙΤΑ βρέθηκε να μειώσει σημαντικά τον αριθμό των αποικιών που σχηματίζονται από δύο κυτταρικές σειρές σε όλες τις δόσεις που δοκιμάστηκαν (ρ & lt? 0,05). (Εικ. 1 D)

RITA επάγει γήρανση στο κεφάλι και του καρκίνου του τραχήλου κυτταρικές σειρές

Είμαστε στο παρελθόν έδειξαν ότι ο κυρίαρχος τρόπος απάντηση είτε φυσιολογικά σχετικές συγκεντρώσεις της σισπλατίνης [4] ή πρότυπο δόσεις ακτινοβολίας [3] στο p53 HNSCC κυτταρικές σειρές άγριου τύπου δεν είναι απόπτωση. Ομοίως, στο τρέχον μοντέλο, ελάχιστη κασπάσης και διάσπαση PARP παρατηρήθηκε μετά από έκθεση σε RITA (Εικ. 2Α). Έτσι, για να ελεγχθεί η υπόθεση ότι η παρατηρούμενη αντι-πολλαπλασιαστική απόκριση των HN30 και HN31 κύτταρα να RITA ήταν τουλάχιστον εν μέρει, λόγω της επαγωγής του γηρασμού, αναλύσαμε δραστικότητα SA-β-gal, ένα δείκτη της κυτταρικής γήρανσης. Βρήκαμε ότι RITA επηρεάζονται μορφολογία των κυττάρων και σημαντικά αυξημένη χρώση SA-β-gal με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο στις δύο κυτταρικές σειρές (ρ & lt? 0,05? Εικ. 2Β), υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία RITA οδήγησε σε επιταχυνόμενη γήρανση σε αυτές ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές.

(Α) και PARP διάσπαση της κασπάσης 3 εξετάσθηκαν μέσω κηλιδώσεως Western μετά από έκθεση των κυττάρων σε RITA σε 1 μΜ για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα. Ρ, σταυροσπορίνη (1 μΜ για 8 ώρες) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. (Β) HN30 και κυττάρων HN31 σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 6-φρεατίων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις RITA για 5 ημέρες, μετά τις οποίες τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για γήρανση που σχετίζεται -β-γαλακτοσιδάσης (SA-β-gal) δραστηριότητα . Αντιπροσωπευτικά εικόνες από τρία πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα φαίνονται. Σε κάθε επεξεργασμένο ή καλά, πέντε τυχαίες επιλογές πεδίο έγιναν και ο αριθμός των κυττάρων με γηρασμένων μορφολογία και με μπλε χρώση μετρήθηκαν υπό μεγέθυνση 20x (Olympus IX71). * – Δηλώνει p & lt? 0,05 έναντι μη επεξεργασμένο έλεγχο

Η

Κατάσταση p53 και RITA μεσολάβηση αναστολή της ανάπτυξης σε κυτταρικές σειρές HNSCC

Στη συνέχεια, για να διερευνηθεί κατά πόσο RITA που προκαλείται από τη γήρανση εξαρτάται από την κατάσταση του p53. , υποβάλλαμε σε αγωγή των σταθερών-p53-knockdown κυτταρικές σειρές HN30-shp53 και HN31-shp53 με RITA και διαπίστωσε ότι knockdown έκφρασης πρωτεΐνης ρ53 μείωσε σημαντικά τόσο την έκφραση και την φωσφορυλίωση της ρ53 (Εικ. 3). Ωστόσο, βασική έκφραση ρ21 ήταν αμετάβλητη στα κύτταρα HN30 (wt ρ53) (Σχ. 3Α). Βρήκαμε επίσης ότι η αναστολή της ρ53 είχε μόνο μια μερική επίδραση διάσωσης ΡΙΤΑ επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης και του σχηματισμού αποικιών σε κύτταρα HN30, και δεν είχε καμία σημαντική επίδραση επί κυττάρων διάσωση HN31 (Σχ. 3Β). Επιπλέον, p53 νοκ ντάουν δεν επηρέασε ΡΙΤΑ που προκαλείται από τη γήρανση σε οποιονδήποτε τύπο της p53-νοκ ντάουν κύτταρα (Σχ. 3C).

(Α) Τα επίπεδα της ολικής και φωσφορυλιωμένη p53 και p21 μετρήθηκαν σε HN30 και HN31 lentiviral- επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου και βραχείας φουρκέτα RNA τους, ρ53-σταθερό-knockdown ομολόγους μετά τη θεραπεία με 1 μΜ RITA για 72 ώρες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. (Β) HN30 και HN31 λεντοϊού-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου και p53-σταθερό-knockdown αντίστοιχά τους υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RITA στις ενδεικνυόμενες δόσεις για 10-14 ημέρες, μετά τις οποίες είχαν καθορισθεί αποικίες, χρωματίζονται και ποσοτικά. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από τρία πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα φαίνονται. Τα ποσοτικά δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± S.E από τρία πειράματα. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές (έλεγχος και sh53), η θεραπεία ΡΙΤΑ οδήγησε σε σημαντική (p & lt? 0,05) μειώθηκε το σχηματισμό αποικιών σε όλες τις δόσεις που δοκιμάστηκαν. κύτταρα ελέγχου (C) HN30 και HN31 λεντοϊού επιμολυσμένα και p53-σταθερό-knockdown αντίστοιχά τους σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 6-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις RITA για 5 ημέρες, μετά τις οποίες τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για senescence- συνδέονται -β-γαλακτοσιδάσης (SA-β-gal). Αντιπροσωπευτικά εικόνες από τρία πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα φαίνονται. Με την εξαίρεση των 0,1 μΜ σε HN30-shp53, όλες οι δόσεις του RITA σε όλες τις κυτταρικές σειρές οδήγησε σε σημαντικά (ρ & lt? 0,05) αύξησε SA-β-gal συγκριτικά με μη κατεργασμένο έλεγχο. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ ελέγχου και shp53 σε κάθε κυτταρική σειρά.

Η

Στη συνέχεια, ελέγξαμε εάν η ανασύσταση του βάρους p53 και p53 mt σε p53-null PCI-13 κύτταρα θα προσδώσει ευαισθησία σε RITA. Για αυτά τα πειράματα, pBabe (έλεγχος φορέα), wtp53, και οι A161S και G245D κατασκευάσματα ρ53 μεταλλαγμένη είχαν επανεισαχθεί στο PCI-13 κύτταρα για να παράγουν τις PCI-13-ρΒΑΒΕ, PCI-13-WT, PCI-13-A161S , και PCI-13-G245D κυτταρικές σειρές. Σε αντίθεση με ρ53-θετικά κύτταρα, ρ53 και ρ53 φωσφορυλιωμένη δεν ανιχνεύθηκαν στα PCI-13 κύτταρα ελέγχου pBabe (Σχ. 4Α). Επίσης, ρ21 εκφράστηκε μόνο από το βάρος κύτταρα που εκφράζουν και από ένα από τα κύτταρα ρ53 που εκφράζουν mt (PCI-13-A161S). Κύτταρα

(Α) PCI-13 (ρ53 null) που εκφράζουν τον έλεγχο φορέα ή οι υποδεικνύεται κατασκευάσματα ρ53 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RITA 2,5 μΜ για 72 ώρες μετά τις οποίες παρασκευάστηκαν και τα επίπεδα της ολικής και φωσφορυλιωμένης ρ53 προϊόντα λύσης πρωτεΐνης και ρ21 αξιολογήθηκαν με κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. (Β) PCI-13 κύτταρα που εκφράζουν τις υποδεικνυόμενες κατασκευάσματα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, σε επεξεργασία με RITA στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις, και μετρήθηκαν σε κλωνογονική δοκιμασία. Με την εξαίρεση των κυττάρων pBabe κατεργασία σε 0,25 μΜ, όλες οι κυτταρικές γραμμές σε όλες τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν από RITA εμφάνισαν σημαντικά μειωμένη σχηματισμό αποικιών σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο έλεγχο (ρ & lt? 0,05). (C) PCI-13 κύτταρα που εκφράζουν τις υποδεικνυόμενες κατασκευάσματα σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 6-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0,25 μΜ RITA μετά την οποία τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν για γήρανση που σχετίζεται -β-γαλακτοσιδάσης (SA-β-gal) δραστηριότητα . Αντιπροσωπευτικά εικόνες από τρία πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα φαίνονται. Όλες οι κυτταρικές σειρές παρουσίασαν σημαντική αύξηση χρώση SA-β-gal σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο έλεγχο (p & lt? 0,05).

Η

Μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας μακροπρόθεσμα (Εικ. 4Β) και SA-β-gal κηλίδωση (Εικ. 4C) έδειξε ότι RITA ανάπτυξη ανέστειλε σημαντικά κυττάρων και επαγόμενη από γήρανση σε όλες τις κυτταρικές σειρές PCI-13 ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53, συμπεριλαμβανομένου του γονική γραμμή ρ53-ηυΙΙ (ρ & lt? 0,05). Έτσι, η παρουσία της πρωτεΐνης ρ53 δεν φαίνεται να απαιτείται για RITA να ασκεί την επίδρασή της.

ΡΙΤΑ επαγόμενη DNA απόκριση βλάβης σε κυτταρικές σειρές HNSCC συνδέεται με ρύθμιση προς τα κάτω SIRT1

RITA είναι επίσης γνωστό ότι επάγουν την απόκριση βλάβη του DNA [21], [22]. Checkpoint κινάση 2 (Chk2) είναι μια σημαντική προς τα κάτω στόχος της απόκρισης βλάβης του DNA και οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, ή γήρανση. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα ενεργοποιημένα Chk2 μπορεί να διεγείρει ανεξάρτητη της ρ53 γήρανση σε καρκινικά κύτταρα [23], [24]. Αυτά τα αποτελέσματα, με τη διαπίστωση μας ότι RITA αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων HNSCC και μπορεί να προκαλέσει γήρανση, ακόμη και εν απουσία ρ53, μας οδήγησε στην διερεύνηση της επίδρασης της RITA επί Chk2 έκφραση και την κατάσταση φωσφορυλίωσης. Βρήκαμε ότι Chk2 πρωτεΐνη φωσφορυλιώθηκε στο site της ενεργοποίησής του, Thr68, μετά από έκθεση σε RITA στο HN30, HN31 και τα κύτταρα 13 PCI-ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53 (Εικ. 5Α).

(Α) HN30 ή HN31 κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο λεντοϊού ή βραχείας φουρκέτα RNA, p53-σταθερό-knockdown κατασκευάσματα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ RITA 1 για 72 ώρες, μετά την οποία παρασκευάστηκαν και τα επίπεδα της ολικής και φωσφορυλιωμένης Chk2 προϊόντα λύσης πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με ανοσοστύπωση. Δεξιά: PCI-13 κύτταρα επιμολυσμένα με τα υποδεικνυόμενα κατασκευάσματα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 2,5 μΜ RITA για διάφορες περιόδους, μετά από την οποία παρασκευάστηκαν και τα επίπεδα της ολικής και φωσφορυλιωμένης Chk2 προϊόντα λύσης πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν. (Β) HN30, HN31, και PCI-13 κύτταρα με τις υποδεικνυόμενες κατασκευάσματα ρ53 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με RITA για τις υποδεικνυόμενες περιόδους, και προϊόντα λύσης αξιολογήθηκαν για έκφραση πρωτεΐνης SIRT1 με κηλίδωση Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης. κύτταρα (C) HN31 σταθερώς μεταγωγή με φορείς λεντοϊού ελέγχου (C) ή SIRT1 shRNA (S) αρχικά δοκιμάστηκαν για την αναστολή του SIRT-1 έκφρασης. Αντιπροσωπευτικά κλώνοι μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2,5 μΜ RITA για 72 ώρες, μετά από το οποίο εκχυλίσθηκαν και αναλύθηκαν με western αποτύπωση οι αναφερόμενες πρωτεΐνες. κύτταρα (D) HN31 σταθερώς μεταγωγή με φορείς λεντοϊού ελέγχου (C2) ή SIRT1 shRNA (S19) σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 6-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις RITA για 5 ημέρες, μετά τις οποίες είχαν καθορισθεί κύτταρα και χρωματίστηκαν για γήρανση -associated -β-γαλακτοσιδάσης (SA-β-gal) δραστηριότητα. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από τρία πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα φαίνονται. * – Δείχνει σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα στην ενδεικνυόμενη δόση (ρ & lt? 0,05). κύτταρα (Ε) HN31 σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RITA (0,25 Μ) με ή χωρίς Tenovin 6 (0.125 ή 0.25 μΜ) για 10 ημέρες, μετά τις οποίες είχαν καθορισθεί αποικίες, χρωματίζονται και ποσοτικά. * – Δεικνύει μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με Tenovin 6 μόνη ομάδα στην ενδεικνυόμενη δόση. Τα δεδομένα κανονικοποιούνται για είτε φορέα μόνο ή θεραπεία RITA συνθήκες. Αντιπροσωπευτικά εικόνες από τρία πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα φαίνονται. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SE από τρία πειράματα.

Η

Στη συνέχεια, επειδή Chk2 φαίνεται να ενεργοποιούν την κυτταρική γήρανση μέσω αναστολής SIRT1 [25], και επειδή knockdown ή αναστολή της δραστηριότητας SIRT1 επίσης μπορεί να διεγείρει γήρανση-όπως διακοπή της ανάπτυξης εν τη απουσία του λειτουργικού ρ53 [26] – [28], αξιολογήσαμε έκφραση SIRT1 και διαπίστωσαν ότι RITA οδήγησε σε μειωμένη έκφραση SIRT1 σε όλες τις κυτταρικές σειρές που αξιολογήθηκαν, ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53 (Σχήμα 5Β).

Για να δοκιμαστεί αυτό το αποτέλεσμα περαιτέρω, αξιολογήσαμε κατά πόσο η εξάντληση των SIRT1 με shRNA θα ενισχύσει την βιολογική επίδραση της RITA. Βρήκαμε ότι shRNA μεσολάβηση αναστολή της SIRT1 μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης SIRT1 και αύξησε φωσφορυλιωμένων επίπεδα Chk2 μετά την έκθεση σε RITA (Εικ. 5C). Επιπλέον, η θεραπεία ΡΙΤΑ ουσιαστικά ενισχυμένη χρώση SA-β-gal σε κύτταρα HN31-S19 (SIRT1-knockdown) σε σύγκριση με HN31-C2 κύτταρα (έλεγχος-επιμολυσμένα) (Σχ. 5D). Τέλος, ο συνδυασμός της RITA και ο αναστολέας SIRT1 Tenovin 6 παράγεται μία συνεργιστική δράση ανάπτυξης κυττάρου αναστολής (Σχ. 5Ε). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι RITA μπορούν να αναστείλουν την έκφραση SIRT1 και ότι το αποτέλεσμα αυτό συμβάλλει στη RITA προκαλούμενη γήρανση.

RITA αυξάνει ραδιοευαισθησία του μεταλλαγμένου ρ53 έκφραση HNSCC

Με βάση την προηγούμενη διαπίστωση μας ότι ακτινοευαισθησία στα κύτταρα HNSCC συνδέεται στενά με την ικανότητά τους να υποβληθούν σε γήρανση μετά την ακτινοβολία, συγκεκριμένα ότι HN31 κύτταρα mt ρ53 είναι ανθεκτικά στην ακτινοβολία και έχουν χαμηλά επίπεδα της ακτινοβολίας που προκαλείται από τη γήρανση, και την τρέχουσα ευρήματά μας που RITA μειωμένη βιωσιμότητα και την αυξημένη γήρανση των κυττάρων HN31, ερευνήσαμε αν ΡΙΤΑ θα μπορούσε να λειτουργήσει ως ραδιοευαισθητοποιητής. Βρήκαμε ότι προκατεργασία των κυττάρων με HN31 RITA για 24 ώρες που ακολουθείται από ακτινοβολία είχε ως αποτέλεσμα συνεργική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, κατά τη σύγκριση της IC80 (Σχ. 6Α). Συγκεκριμένα, η αμοιβαία μη αποκλειστικό συνδυαστικές δείκτης (CI) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των Chou & amp? Talalay [29]. Ο συνδυασμός της RITA και ακτινοβολίας οδήγησε σε μια CI 0,50, με CI μικρότερη από 1 υποδεικνύει συνεργία.

(Α) κύτταρα HN31 απλώθηκαν σε 1000 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων, σε επεξεργασία με ΡΙΤΑ για 24 ώρες, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2 Gy ακτινοβολίας. Οι αριθμοί των αποικιών μετρήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του κλάσματος επιβίωσης. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως πρότυπο ισοβολόγραμμα, με τη συνεχή γραμμή αντιπροσωπεύει ένα προσθετικό αποτέλεσμα και τα σημεία που αντιπροσωπεύουν τη δόση που προκύπτει σε 80% αναστολή (IC80) (Β) προτεινόμενο μηχανισμό δράσης της RITA στο πλαίσιο των διαφόρων κατάστασης μετάλλαξης ρ53.

Συζήτηση

Βρήκαμε στην παρούσα μελέτη ότι ΡΙΤΑ θα μπορούσαν να εμποδίσουν την ανάπτυξη και να προκαλέσει γήρανση των κυττάρων HNSCC, ακόμη και εν απουσία του ρ53 ή στο πλαίσιο της εξάντλησης της έκφρασης p53, και ότι αυτό το φαινόμενο σχετίζεται με αυξημένη ενεργοποίηση Chk2 και εξαρτάται τουλάχιστον εν μέρει από SIRT1. Τα ευρήματα αυτά στέκονται σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι λειτουργεί RITA κυρίως μέσω της επαγωγής της απόπτωσης μέσω ενεργοποίησης της σηματοδότησης ρ53? μάλλον, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι RITA μπορεί να οδηγήσει σε γήρανση σε HNSCC κύτταρα μεταξύ άλλων αποτελεσμάτων και δεν εξαρτάται εξ ολοκλήρου από την έκφραση ρ53.

Αν και πολλές από τις οδούς που εμπλέκονται στη γήρανση προκαλούνται από ρ53, ιδίως στο πλαίσιο της φωσφορυλίωση ρ53, γήρανση μπορεί επίσης να εμφανιστεί σε περίπτωση απουσίας αυτής της πρωτεΐνης, προτείνοντας ότι η ρ53-ανεξάρτητοι μηχανισμοί μπορούν επίσης να μεσολαβήσουν θεραπεία επαγόμενης από γήρανση των κυττάρων του όγκου [30] – [34]. Για παράδειγμα, η δοξορουβικίνη δείχθηκε ότι επάγει γηρασμένων φαινότυπο στα κύτταρα ρ53-ηυΙΙ Saos-2, σε SW480 και U251 κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένο ρ53, και σε HeLa και Hep-2 κυτταρικές σειρές, στις οποίες η λειτουργία ρ53 έχει ανασταλεί [35 ].

Άλλες ομάδες έχουν αναφέρει ότι ΡΙΤΑ μπορεί όχι μόνο να προκαλέσει p53, αλλά επίσης να προκαλέσει μια ταυτόχρονη αντιμετώπιση βλαβών του DNA [21], [22]. Η απάντηση βλάβη του DNA περιλαμβάνει δύο κύριες οδούς σηματοδότησης, ο αισθητήρας κινάσες αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαχθεί (ATM) και αταξία τηλαγγειεκτασία και Rad3 που σχετίζονται με (ATR). Αυτές οι κινάσες ενεργοποιούν τα κατάντη κινασών τελεστή Chk2 και Chk1. Chk2 μπορεί να προκαλέσει την κυτταρική γήρανση μέσω p53 /p21 ή άλλων οδών σε απάντηση σε δυσλειτουργία των τελομερών και τις βλάβες του DNA [36]. Πρόσφατα, Chk2 δείχθηκε να ρυθμίζουν την κυτταρική απόκριση σε RITA [22]. Τα ευρήματά μας που κατεργασία RITA προκάλεσε μια αύξηση στην φωσφορυλίωση Chk2 ανεξαρτήτως του καθεστώτος ρ53 είναι συνεπείς με την παρατήρηση αυτή (Εικ. 5).

Υπό συνθήκες κυτταρικού στρες ή βλάβης του DNA, ενεργοποίηση Chk2 μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της SIRT1 έκφραση και γήρανση [25]. SIRT1 είναι μια εξαιρετικά διατηρημένη δεακετυλάσης ιστόνης που είναι γνωστό ότι μεσολαβεί τον κυτταρικό μεταβολισμό, τη γήρανση, και την απόκριση να τονίσουμε [37]. Η υπερέκφραση του SIRT1 έχει δειχθεί ότι αναστέλλει την κυτταρική γήρανση σε μία ποικιλία διαφορετικών κακοηθειών [38]. Επιπλέον, SIRT1 υπερεκφράζεται σε χημειοθεραπεία κύτταρα και αναστέλλοντας SIRT1 μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου σε ορισμένα μοντέλα [27], [38] – [40]. Πράγματι, στην παρούσα μελέτη βρήκαμε ότι RITA ανέστειλε έκφραση SIRT1 σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53 (Εικ. 5Β). Επιπλέον, η θεραπεία με έναν αναστολέα SIRT1 ή SIRT1-ειδικό shRNA οδήγησε σε μειώσεις στην ανάπτυξη και την αύξηση στη γήρανση, σε συνδυασμό με θεραπεία RITA. Αν και η αναστολή της SIRT1 πιστεύεται ότι επάγει γήρανση κυρίως από την αλληλεπίδραση με την ρ53, τουλάχιστον μία ομάδα έχει δείξει ότι η δοξορουβικίνη μπορεί να προκαλέσει γήρανση σε SCC κύτταρα που στερούνται της ρ53 μέσω αναστολής της SIRT1 [26]. Επιπλέον, μια ομάδα ανέφερε ότι η αναστολή της SIRT1 μπορεί να προκαλέσει γήρανση σε Η1299 (ρ53 null) μέσω μειωμένης δραστηριότητας σε Ras σηματοδότησης /ΜΑΡΚ. Οι παρατηρήσεις αυτές μπορούν να παρέχουν μια σύνδεση με τις παρατηρούμενες επιδράσεις της RITA, ακόμη και σε κύτταρα HNSCC έλλειψη της πρωτεΐνης p53. Με βάση τα ευρήματά μας από την παρούσα μελέτη, καθώς και την εργασία των άλλων, προτείνουμε ότι ΡΙΤΑ προκαλεί διακοπή της ανάπτυξης και γήρανση κατά τουλάχιστον δύο διαφορετικές οδούς (Εικ. 6Β). Σε p53-ικανά κύτταρα, RITA πιθανόν δρα κυρίως μέσω κανονικών στόχους ρ53, η οποία είναι η κυρίαρχη επίδραση του φαρμάκου. Το τελικό αποτέλεσμα αυτής της ενεργοποίησης μπορεί να είναι είτε απόπτωση ή γήρανση ανάλογα με το πλαίσιο. Αντιστρόφως, ένα μικρότερο, αλλά ακόμα σημαντική επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων παρατηρείται σε ρ53 ελαττωματικό κυτταρικές σειρές. Ωστόσο, με την απουσία του λειτουργικού ρ53 ή οποιαδήποτε πρωτείνη ρ53, ΡΙΤΑ φαίνεται να ασκεί τουλάχιστον κάποιες από τις επιδράσεις της μέσω ενεργοποίησης του απόκριση βλάβης DNA και αναστολή της έκφρασης SIRT1. Η ακριβής φύση αυτής της διπλής λειτουργίας θα απαιτήσει περαιτέρω μελέτη.

προηγουμένως συνδέονται ανταπόκριση στη σισπλατίνη και ακτινοθεραπεία με την επαγωγή του γηρασμού, δείχνοντας ότι τα κύτταρα τα οποία είναι πιο ανθεκτικά σε αυτά τα φάρμακα είναι επίσης ανθεκτικά στην επαγωγή γήρανση [3 ], [4]. Αν και η σκοπιμότητα της θεραπείας που προκαλείται από γηρασμό ως απάντηση σε κλινικώς χρησιμοποιηθεί θεραπειών είναι ένα θέμα σημαντικής συζήτησης [41], για τους τύπους των κυττάρων που είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά σε άλλες μορφές κυτταρικού θανάτου ή σύλληψης, γήρανση μπορεί να είναι μια εναλλακτική θεραπευτική έκβαση. Η ανακάλυψή μας ότι οι χαμηλές δόσεις της RITA (0,1-0,5) θα μπορούσε επιλεκτικά ευαισθητοποιούν ιδιαίτερα ανθεκτικά κύτταρα HNSCC στη θεραπεία in vitro [3] δείχνει ότι η προσθήκη RITA μπορεί να αποδειχθεί μια βιώσιμη στρατηγική για την ευαισθητοποίηση των όγκων στην ακτινοβολία, η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη θεραπεία για HNSCC.

Ευχαριστίες

θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Μέι Zhao για την πολύτιμη τεχνική βοήθειά της.