Αφηρημένο

Η αυθόρμητη CD4

+ Τ- οι κυτταρικές αποκρίσεις στην ογκο-ειδικό αντιγόνο ΝΥ-ESO-1 (ESO) βρέθηκε συχνά σε ασθενείς με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC). Εάν αυτές οι απαντήσεις είναι του τελεστή ή /και το είδος Treg, ωστόσο, έχει παραμείνει ασαφής. Εδώ, έχουμε χρησιμοποιήσει λειτουργικές προσεγγίσεις μαζί με πρόσφατα ανεπτυγμένες MHC κατηγορίας II /ESO τετραμερή να εκτιμηθεί η συχνότητα, φαινότυπο και τη λειτουργία των ΕδΟ-ειδικών κυττάρων στα κυκλοφορούντα λεμφοκύτταρα από ασθενείς EOC. Βρήκαμε ότι κυκλοφορούν ΕδΟ-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα σε ασθενείς ΕΓΚ με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις προς το αντιγόνο είναι κατά κύριο λόγο T

κυττάρων τύπου Η1 εκκρίνουν ΙΡΝ-γ αλλά όχι της IL-17 ή IL-10 και δεν έχουν κατασταλτικό . Διαπιστώσαμε τετραμερούς

+ κυττάρων

ex vivo

, με μέση συχνότητα των 1:25000 κυττάρων μνήμης, δηλαδή, σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι σε ασθενείς που έχουν ανοσοποιηθεί με ένα εμβόλιο ESO. ESO τετραμερούς

+ κυττάρων ήταν ως επί το πλείστον τα κύτταρα μνήμης τελεστών σε προχωρημένα στάδια της διαφοροποίησης και δεν ανιχνεύθηκαν στα κυκλοφορούντα CD25

+ FoxP3

+ Treg. Έτσι, αυθόρμητη CD4 απαντήσεις

Τ-κυττάρων + για ESO σε ασθενείς με καρκίνο είναι κατά κύριο λόγο των Τ

τύπου Η1 και όχι Treg. Τους σχετικά χαμηλή συχνότητα και το στάδιο προηγμένη διαφοροποίηση, ωστόσο, μπορεί να περιορίσει την αποτελεσματικότητά τους, που μπορεί να ενισχυθεί με ανοσογόνα εμβόλια ESO

Παράθεση:. Redjimi Ν, Duperrier-Amouriaux Κ, Raimbaud Ι, Luescher Ι, Dojcinovic D, Classe JM, et al. (2011) NY-ESO-1-Ειδική κυκλοφορούντων CD4

+ Τ κύτταρα σε καρκίνο των ωοθηκών ασθενείς είναι κατά κύριο λόγο Τ

H1 Τύπος Cells Μη ανιχνεύσιμο στο CD25

+ FoxP3

+ Treg διαμέρισμα. PLoS ONE 6 (7): e22845. doi: 10.1371 /journal.pone.0022845

Επιμέλεια: Γιώργος Κασσιώτης, MRC Εθνικό Ινστιτούτο Ιατρικής Έρευνας, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 25 του Μαρτίου, 2011? Αποδεκτές: 30 Ιουνίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 του Ιούλη 2011

Copyright: © 2011 Redjimi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Fondation de France, το Ερευνητικό Ινστιτούτο Καρκίνου και το Ludwig Institute for Cancer Research. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

υποσύνολα CD4

+ Τ-κυττάρων παίζουν σημαντικό και ενδεχομένως αντίθετη ρόλους σε ανοσολογικής όγκου [1], [2]. Τύπου Ι βοηθητικά (T

Η1) Τ κύτταρα, που εκκρίνουν το υπογραφή κυτοκίνης IFN-γ, ευνοούν την ανάπτυξη των CD8

+ κυτταρολυτική τελεστές (CTL), μεσολαβούν και αποτελεσματικές απαντήσεις κατά του όγκου. Σε αντίθεση, οι ρυθμιστικές /κατασταλτικά Τ κύτταρα (Treg), χαρακτηριζόμενη

ex vivo από

υψηλή έκφραση του IL-2R α-αλυσίδας (CD25) και της γενεαλογίας-ειδικό παράγοντα μεταγραφής Foxp3 και χαμηλή έκφραση του IL -7R α-αλυσίδας (CD127), πιστεύεται ότι αναστέλλουν αποκρίσεις κατά των όγκων [3], [4], [5], [6], [7]. Treg, που αποτυγχάνουν να εκκρίνουν ΙΡΝ-γ ή IL-2, έχουν αναφερθεί να είναι παρόν σε αυξημένες αναλογίες σε ασθενείς με καρκίνο, σε σύγκριση με υγιή άτομα [8], [9]. Επειδή η εξειδίκευση αντιγόνου του Treg είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη, δεν είναι σαφές εάν η ικανότητα των Treg να αναστέλλουν αποκρίσεις κατά του όγκου έχει σχέση ή όχι με την παρουσία /επικράτηση μεταξύ αυτών των ογκο-ειδικού αντιγόνου CD4

+ Τ κύτταρα.

NY-ESO-1 (ESO), ένα ογκο-ειδικό αντιγόνο της ομάδας του καρκίνου /όρχεων εκφράζονται συχνά σε ανθρώπινους όγκους διαφορετικών ιστολογικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων των ωοθηκών, αλλά όχι σε φυσιολογικά σωματικούς ιστούς [10], [11 ], είναι ένας υποψήφιος για την ανάπτυξη της γενικής αντικαρκινικών εμβολίων [12]. ESO είναι εξαιρετικά ανοσογόνος και εκμαιεύει αυθόρμητη χυμική, CD4

+ και CD8 αποκρίσεις

Τ-κυττάρων + σε ασθενείς που φέρουν όγκους που εκφράζουν αντιγόνο [11], [13], [14], [15]. Επιπλέον, ESO-ειδικό αντίσωμα, CD4

+ και CD8

Τ-κυττάρων + αποκρίσεις μπορεί να προκληθεί μέσω ανοσοποίησης με εμβόλια που βασίζονται ESO [16]. Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως ανοσοκυρίαρχο περιοχών που αναγνωρίζονται από το ESO-ειδικά CD4

+ και CD8

+ Τ κύτταρα [16] και έχουν δημιουργήσει διαλυτές φθορισμού MHC τάξης Ι και, πρόσφατα, MHC τάξης II /ESO πεπτιδίου τετραμερή επιτρέπει την άμεση ανίχνευση , φαινοτυπική και απομόνωση του ESO-ειδικών Τ κυττάρων [17], [18]. Χρησιμοποιώντας MHC τάξης II ESO πεπτιδίου τετραμερή /να αξιολογήσει ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα σε ασθενείς ανοσοποιημένους με μία ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη ESO χορηγείται με Montanide ™ ISA 51 και GpG 7909, έχουμε δείξει ότι το εμβόλιο που προκαλείται ΕδΟ-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα είναι κατά κύριο λόγο Τ

H1 κύτταρα, ανιχνεύονται

ex vivo

μεταξύ της μνήμης (CD45RA

-) κύτταρα, περιλαμβάνουν τόσο κεντρική μνήμη (CCR7

+) και μνήμης τελεστές (CCR7

-) πληθυσμούς και δεν περιλαμβάνουν σημαντικές αναλογίες Treg [16], [17], [18]. Πρόσφατες μελέτες, ωστόσο, έχουν δείξει ότι, σε αντίθεση με ESO-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα γεμάτοι μέσω του εμβολιασμού, ESO-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα σε ασθενείς με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις μπορεί να περιέχει σημαντικές αναλογίες Treg [19 ], και ότι αυξημένα ποσοστά κυκλοφορούντος Treg σε ασθενείς με καρκίνο μπορεί να επηρεάσει την ικανότητά τους να ανταποκρίνονται ESO εμβόλια [20]. Για την αντιμετώπιση των προβλημάτων αυτών, στην παρούσα μελέτη, έχουμε χρησιμοποιήσει λειτουργικές προσεγγίσεις, μαζί με MHC κατηγορίας II /ESO πεπτιδίου τετραμερή να εκτιμήσει ΕδΟ-ειδικών κυττάρων μεταξύ των συμβατικών και Treg CD4

Τ-κυττάρων + υποσύνολα στα κυκλοφορούντα λεμφοκύτταρα του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών (ΕΓΚ) ασθενείς με ανιχνεύσιμη αυθόρμητη ανοσολογική απάντηση στην ESO

Αποτελέσματα

Αξιολόγηση της μνήμης συμβατικών CD25

-. και ρυθμιστικών CD25

+ FoxP3

+ CD4

+ Τ-κυττάρων υποσύνολα στα κυκλοφορούντα λεμφοκύτταρα από υγιείς δότες και ασθενείς EOC

Μεταξύ μνήμη CD4

+ Τ κύτταρα αρκετές υποομάδες μπορούν να διακριθούν με βάση την έκφραση του CD25 και CD127. Εκτιμώντας τα συμβατικά CD4

+ Τ κύτταρα είναι CD25

-CD127

+, Treg είναι CD25

+ CD127

– και FoxP3

+ (Εικόνα 1Α). Ένα τρίτο του πληθυσμού, CD25

-CD127

-, περιέχει πρόσφατα ενεργοποιημένα και IL-10 που παράγουν CD4

+ Τ κύτταρα [21]. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η CD25

-CD127

+ κύτταρα αποτελούν την πλειοψηφία των κυκλοφορούντων μνήμης CD4

+ Τ κύτταρα, Treg και CD25

-CD127

– πληθυσμοί βρίσκονται σε πολύ χαμηλότερο και σχεδόν ισοδύναμες αναλογίες, που αντιπροσωπεύουν κάθε περίπου 5%. Επειδή προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι οι πληθυσμοί Treg μπορεί να αυξηθεί στα κυκλοφορούντα λεμφοκύτταρα από ασθενείς με καρκίνο, σε σύγκριση με υγιή άτομα, συγκρίναμε το ποσοστό των CD4 υποσυνόλων

Τ-κυττάρων + στα κυκλοφορούντα λεμφοκύτταρα ασθενών EOC σε υγιείς δότες. Εμείς απέτυχε, ωστόσο, να εντοπίζονται τυχόν σημαντικές διαφορές στην αναλογία των κυκλοφορούντων Treg στους ασθενείς σε σύγκριση με υγιείς δότες (Σχήμα 1Β). Ομοίως, το ποσοστό των CD25

-CD127

– CD4

+ Τ κυττάρων δεν διέφερε σημαντικά μεταξύ των ασθενών και των υγιών δοτών. Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό CD4

Τ-κυττάρων + υποσύνολα στα κυκλοφορούντα λεμφοκύτταρα από ασθενείς EOC, μπορούμε να απομονωθεί

ex vivo

, με κυτταρομετρία ροής των κυττάρων διαλογή, αυτά διεγείρονται

in vitro

και αξιολογείται η καλλιέργειες 12 ημέρες αργότερα για την ικανότητά τους να εκκρίνουν διαφορετικές κυτοκίνες. Όπως ήταν αναμενόμενο, και στις δύο υγιείς δότες και ασθενείς, CD25

– πληθυσμοί που περιέχονται σημαντικά υψηλότερες αναλογίες κυττάρων που εκκρίνουν ΙΡΝ-γ σε σύγκριση με Treg (Σχήμα 2). CD127

+ πληθυσμοί περιείχαν υψηλότερα ποσοστά ΙΡΝ-γ-κυττάρων που εκκρίνουν από CD127

– πληθυσμούς. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε σύγκριση με υγιείς δότες, CD25

-CD127

– πληθυσμοί από ασθενείς με καρκίνο που περιέχονται υψηλότερες αναλογίες IFN-γ-κυττάρων που εκκρίνουν. Αντίθετα, η αναλογία των κυττάρων IL-10 που εκκρίνουν IL-17- ή δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ υγιείς δότες και ασθενείς για κανέναν από τους πληθυσμούς.

A. CD4

+ Τ κύτταρα χρωματίστηκαν με αντι-FoxP3, -CD25, -CD45RA και αντισώματα CD127 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Έκφραση των CD25 και CD127 ορίζει 3 πληθυσμούς της μνήμης (CD45RA

-) CD4

+ Τ κυττάρων: τα συμβατικά CD25

-CD127

+ και CD25

-CD127

– και Treg CD25

+ CD127

– (αριστερά dot οικόπεδο, αριθμοί αντιστοιχούν στο ποσοστό του κάθε υποσυνόλου μεταξύ μνήμη CD4

+ Τ κύτταρα). Ιστογράμματα δείχνουν την έκφραση του Foxp3 στην οριοθετημένη μνήμη υποσυνόλων CD4

+ Τ-κυττάρων. B. Το ποσοστό των συμβατικών CD25

-CD127

+ και CD25

-CD127

– και Treg CD25

+ CD127

– υποσύνολα, τα οποία ορίζονται στο σημείο Α, μεταξύ μνήμη CD4

+ Τ κύτταρα από υγιείς δότες (HD, n = 27) και των ασθενών (P, n = 18).

Η

Ex vivo

-sorted μνήμη συμβατικά, CD25

-CD127

+ και CD25

-CD127

– και Treg, CD25

+ CD127

– πληθυσμοί από υγιείς δότες (HD, n = 12) και των ασθενών (P, n = 12) διεγέρθηκαν

in vitro

και ημέρα 12 οι καλλιέργειες αξιολογήθηκαν για IFN-γ, IL-10 και IL-17 παραγωγή, μετά από διέγερση με ΡΜΑ και ιονομυκίνη, σε μία δοκιμασία έκκρισης ενδοκυτταρικής κυτοκίνης 4-h και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Οι Dot οικόπεδα για έναν χορηγό που φαίνεται στο Α και τα στοιχεία για όλους τους υγιείς δότες και ασθενείς συνοψίζονται στον Β στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός προτύπου δίπλευρη

t-test

.

Η

ESO ειδικά κυκλοφορούντων CD4

+ Τ κύτταρα από ασθενείς ΕΓΚ με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις που βρέθηκαν στο CD25

-CD127

+ και CD25

-CD127

– πληθυσμούς αλλά όχι σε CD25

+ CD127

-FOXP3

+ Treg και εκκρίνουν IFN-γ, αλλά όχι IL-17 ή IL-10

Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, περίπου το 40% των όγκων των ωοθηκών εκφράζουν ESO και περίπου 30% των ασθενών ΕΓΚ φέρουν ESO εκφράζουν οι όγκοι αναπτύσσονται συγκεκριμένες αυθόρμητη αντίσωμα (Ab) [22]. Εκτιμήσαμε αποκρίσεις Ab να ESO σε μία ομάδα από 110 ασθενείς EOC (Πίνακας 1) σε ορούς των ασθενών με ELISA όπως περιγράφεται [14]. Διαπιστώσαμε σημαντικές αποκρίσεις Ab να ESO σε 8 (7%) από τους ασθενείς (Σχήμα 3Α) στους τίτλους που κυμαίνονται μεταξύ 1:500 και 1:50000 (Σχήμα 3Β). Οι ασθενείς με ανιχνεύσιμη ESO Ab παρουσιάζονται με υψηλού βαθμού (ΙΙ, ΙΙΙ) όγκων στο στάδιο ΙΙΙ ή IV και με ορώδες ιστολογία (Πίνακας 1). Για 6 ασθενείς, PBMC ήταν διαθέσιμα για ανάλυση. Για να εκτιμηθεί ΕδΟ-ειδικών κυττάρων εντός καθορισμένων κυκλοφορούντων μνήμη CD4

+ υποσύνολα Τ-κυττάρων από τους ασθενείς αυτούς, τους απομονώνονται

ex vivo

με κυτταρομετρία ροής διαλογής κυττάρων, και τα διεγερμένα με μία ομάδα μακράς επικαλυπτόμενα πεπτίδια που καλύπτουν την αλληλουχία ESO, όπως περιγράφεται [16]. Δώδεκα ημέρες αργότερα, διεγερμένα δείγματα των καλλιεργειών με την πισίνα πεπτίδιο ESO και αξιολογούνται ειδική παραγωγή κυτοκίνης από ενδοκυτταρική χρώση. Διαπιστώσαμε σημαντική αναλογία των κυττάρων που παράγουν IFN-γ σε απάντηση ESO σε καλλιέργειες από κυκλοφορούντα CD25

-CD127

+ και CD25

-CD127

– CD4

Τ-κυττάρων + πληθυσμούς, αλλά όχι από Treg (Σχήμα 4Α και 4Β). Αντίθετα, βρήκαμε μόνο χαμηλές αναλογίες των κυττάρων που εκκρίνουν IL-10 ή IL-17 σε απόκριση προς ΕΕΕ σε κανέναν από τους πληθυσμούς. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μεγάλη πλειοψηφία των κυκλοφορούντων ΕδΟ-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα σε αυτούς τους ασθενείς ήταν T

τύπος H1 IFN-γ-κυττάρων που εκκρίνουν, CD25

-, και οι δύο CD127

+ και CD127

– και δεν ήταν ανιχνεύσιμα σε CD25

+ FoxP3

+ Treg

Α.. Η παρουσία του ΕδΟ-ειδικών Ab σε ορούς ασθενών αξιολογήθηκε με ELISA. Οροί αρχικά εκτιμηθεί σε αραίωση 1:100 για Reso επικαλυμμένα ή μη επικαλυμμένα ελάσματα ελέγχου. Οι οροί βαθμολογήθηκαν ως ESO Ab

+ εάν η οπτική πυκνότητα (OD) που λαμβάνονται επί Reso επικαλυμμένες πλάκες ήταν και τα δύο τουλάχιστον 3 διπλώνει υψηλότερα από εκείνα που ελήφθησαν για το ίδιο δείγμα για μη επικαλυμμένων πλακών και υψηλότερη από τη μέση + 6xSD του OD τιμές που λαμβάνονται με ορούς από υγιή άτομα για Reso-επικαλυμμένες πλάκες (η = 53, μέσος όρος + 6xSD = 750, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Β σειρά αραιώσεις του ΕΟΤ Ab

+ οροί ελέγχθηκαν για Reso-επικαλυμμένες πλάκες. Ορός τίτλος υπολογίστηκε ως η αραίωση του ορού που αποδίδει το 50% της μέγιστης OD

Η

Μνήμη συμβατικά, CD25

-CD127

+ και CD25

-CD127

-., Και Treg, CD25

+ CD127

-, οι πληθυσμοί διαχωρίστηκαν

ex vivo

από CD4

+ Τ κύτταρα του ΕΟΤ Ab + ασθενείς

και διεγείρονται

in vitro

με πισίνα μακρών επικαλυπτόμενων πεπτιδίων που καλύπτουν την πλήρη αλληλουχία ESO μήκους. καλλιέργειες Α και Β Ημέρα 12 αξιολογήθηκαν για IFN-γ, IL-10 και IL-17 παραγωγή σε μια δοκιμασία χρώσης ενδοκυτταρική κυτοκίνη 4-h μετά την διέγερση με την απουσία ή την παρουσία του πεπτιδίου πισίνα ESO. Οι Dot οικόπεδα για έναν ασθενή που φαίνεται στο Α και τα δεδομένα που λαμβάνονται για όλους τους ασθενείς συνοψίζονται στον Β Γ και Δ Ημέρα 12 καλλιέργειες χρωματίστηκαν με DR52b /ESO

119-143 (NA017, NA093 και NA097) ή DR4 /ESO

119-143 (NA304) τετραμερή και αντι-CD4 mAb και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Οι Dot οικόπεδα για έναν ασθενή που φαίνεται στο C και τα δεδομένα για όλους τους ασθενείς συνοψίζονται στον D.

Η

Αξιολόγηση της ESO-ειδικών Τ κυττάρων σε CD4

+ υποσύνολα χρησιμοποιώντας MHC τάξης II /πεπτίδιο τετραμερή ESO

Μια προειδοποίηση από την πειραματική ρύθμιση που χρησιμοποιείται παραπάνω ήταν ότι, ενώ ESO-ειδικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με βάση την ικανότητά τους να εκκρίνουν ειδικά IFN-γ σε απάντηση ESO, Treg εκκρίνονται λίγο IFN-γ, ακόμη και κατά την διέγερση με ΡΜΑ /ιονομυκίνη (Σχήμα 2). Για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί που επιβάλλονται από την ανίχνευση του ESO-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων βασίζεται σε λειτουργικές δοκιμασίες, έχουμε αναπτύξει πρόσφατα διαλυτό φθορισμού MHC τάξης II τετραμερή που ενσωματώνουν ένα ανοσοκυρίαρχο επιτόπιο από το ESO, που αντιστοιχεί στο πεπτίδιο 119-143 [17 ], [18]. Δείξαμε ότι MHC κατηγορίας II /ESO

119-143 τετραμερή χρώση ΕδΟ-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα στα κυκλοφορούντα λεμφοκύτταρα ασθενών που έχουν ανοσοποιηθεί με ένα ESO ανασυνδυασμένο εμβόλιο με υψηλή απόδοση και επιλεκτικότητα, επιτρέποντας την άμεση οπτικοποίηση τους μεταξύ πολυειδικά CD4 πολιτισμών

+ Τ-κυττάρων. Επειδή 4 ασθενείς με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις προς ESO εξέφρασε αλληλόμορφα II για τις οποίες οι κατάλληλοι τετραμερή ήταν διαθέσιμα (DR52b και DR4) MHC κατηγορίας, αξιολογήσαμε ΕδΟ-ειδικών Τ κυττάρων σε αυτές τις καλλιέργειες με χρώση τετραμερούς (Σχήμα 4C και 4D). Διαπιστώσαμε σημαντική αναλογίες ESO τετραμερούς

+ κυττάρων σε καλλιέργειες από CD25

-CD127

+ πληθυσμών από όλους τους ασθενείς, καθώς και σε αυτούς από το CD25

-CD127

– πληθυσμών (σε 3 ασθενείς με σημαντικά αυξημένη συχνότητα σε σύγκριση με το CD25

-CD127

+ κλάσματα). Ωστόσο, σε όλες τις περιπτώσεις, δεν καταφέραμε να ανιχνεύει τις σημαντικές αναλογίες τετραμερή

+ κυττάρων σε Treg πολιτισμούς. Εκτός από CD25

+ CD127

-FOXP3

+ Treg, κατασταλτική CD4

+ Τ κύτταρα έχουν επίσης περιγραφεί σε ορισμένες μελέτες, μεταξύ άλλων πληθυσμών [21]. Για να εκτιμηθεί αν, ανεξαρτήτως του φαινοτύπου τους, ESO-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα εμφανίζονται κατασταλτικός λειτουργίες, τους απομονώθηκε από τις καλλιέργειες με tetramer- ή ΙΡΝ-γ-καθοδηγούμενη διαλογή κυττάρων και τους αξιολογούνται λειτουργικά σε μια δοκιμασία καταστολής που περιγράφεται [23], [24]. Όπως ήταν αναμενόμενο, οι πληθυσμοί FoxP3

+ Treg αξιολογούνται ταυτόχρονα ως εσωτερικοί έλεγχοι κατέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη των κυττάρων αποκριτών. Σε αντίθεση, το ESO-ειδικά κύτταρα που απομονώθηκαν από δύο CD25

-CD127

+ και CD25

-CD127

+ πολιτισμούς ήταν FoxP3

-. Και δεν κατασταλτικό (Σχήμα 5)

ESO-ειδικά κύτταρα απομονώθηκαν από το πεπτίδιο-διεγερμένα CD25

-CD127

+ και CD25

-CD127

– πολιτισμούς CD4

Τ-κυττάρων + (Σχήμα 4) από tetramer- καθοδηγείται (NA017) ή IFN-γ-καθοδηγούμενη (NA114) κυτταρομετρία ροής διαλογής κυττάρων και επεκτάθηκε

in vitro

. Οι προκύπτουσες καλλιέργειες περιείχαν πολυκλωνικά & gt? 80% ESO-ειδικά κύτταρα. Α ESO-ειδικό πολυκλωνικό πολιτισμούς, καθώς και πολυκλωνικά καλλιέργειες από το ESO

– κλάσμα και τον έλεγχο των πολιτισμών των

in vitro

-επεκταθούν συμβατική μνήμη CD4

+ Τ κύτταρα (Μ) και τη μνήμη Treg ( MTreg), απομονωμένες

ex vivo

από υγιή άτομα, βάφτηκαν με Foxp3-ειδικό mAb και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Οι αριθμοί σε οικόπεδα κουκίδα αντιστοιχεί στην μέση ένταση φθορισμού (MFI) της χρώσης Foxp3. B. Η κατασταλτική δράση των ESO-ειδικά και ελέγχουν τους πληθυσμούς πολύκλωνα εκτιμήθηκε με συγκαλλιέργεια με CFSE-επισημασμένο συμβατικό CD4

+ Τ κύτταρα, σε μια αποκριτή: αναλογία καταστολέα του 1:01, παρουσία ακτινοβολημένων μονοκυττάρων και ΡΗΑ. Dot γραφικές παραστάσεις δείχνουν το προφίλ CFSE αραίωσης απουσία πληθυσμού δοκιμής (αριστερά) και με την παρουσία των υποδεικνυόμενων πληθυσμών δοκιμής. Οι αριθμοί σε ιστογράμματα αντιστοιχεί το ποσοστό της αδιαίρετης κυττάρων. Τα αποτελέσματα που αντιστοιχούν στο υπολογίζεται καταστολή% εμφανίζεται για όλες τις ελεγχόμενες πληθυσμούς.

Η

Ex vivo

αξιολόγηση της ESO-ειδικών κυκλοφορούντων CD4

+ Τ κύτταρα χρησιμοποιώντας MHC τάξης II /ESO τετραμερή

Για να επιβεβαιώσετε την κατανομή της ESO-ειδικών κυττάρων σε CD4 υποσύνολα

Τ-κυττάρων + σε ασθενείς με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις και να αξιολογήσει περαιτέρω αναλογίες και φαινότυπο τους, θα βάφονται συνόλου των κυκλοφορούντων CD4

+ T κύτταρα από ασθενείς DR52b

+

ex vivo

με τετραμερή ESO σε συνδυασμό με mAb που κατευθύνεται έναντι δεικτών που χαρακτηρίζουν διακριτά στάδια διαφοροποίησης των CD4

+ Τ κύτταρα. Όπως φαίνεται στο παρελθόν [17], ESO τετραμερούς

+ κύτταρα δεν ήταν ανιχνεύσιμα σε CD4

+ Τ κυττάρων από υγιείς δότες. Αντίθετα, ήταν σαφώς ανιχνεύθηκαν

ex vivo

στα κυκλοφορούντα μνήμη CD4

+ Τ κύτταρα από τους ασθενείς (Σχήμα 6Α). Τετραμερούς

+ κυττάρων στην κυκλοφορία CD4

+ Τ κύτταρα από τους ασθενείς ήταν ομοιόμορφα CD25

– και βρέθηκαν ανάμεσα σε δύο CD127

+ και CD127

– πληθυσμούς, αλλά δεν ήταν ανιχνεύσιμη μεταξύ CD25

+ CD127

– Treg (Εικόνα 6Β). Έτσι, παρόμοιο με αυτό που έχουμε παρατηρήσει στο παρελθόν σε ασθενείς που έχουν ανοσοποιηθεί με ένα ανασυνδυασμένο εμβόλιο ESO, άμεση

ex vivo

χρώση με τετραμερή ESO επιβεβαίωσε την έλλειψη σημαντικές διαστάσεις της ESO-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα στην κυκλοφορία Treg των ασθενών με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις προς το αντιγόνο. Η συχνότητα των κυκλοφορούντων τετραμερή ESO

+ κυττάρων στους ασθενείς με αυθόρμητες αποκρίσεις, ήταν, κατά μέσο όρο, από 1:25000, πέντε πτυχώσεις χαμηλότερη από αυτή που βρέθηκε σε εμβολιασμένα ασθενείς (Σχήμα 6Α) [17]. Ωστόσο, ESO τετραμερούς

+ κυττάρων σε ασθενείς με αυθόρμητες αποκρίσεις περιείχαν μικρότερα ποσοστά CD127

– κύτταρα σε σύγκριση με εκείνα των εμβολιασμένων ασθενών (Σχήμα 6Β). Επιπλέον, σε αντίθεση με την τελευταία, η οποία περιείχε, κατά μέσο όρο, περίπου συγκρίσιμες αναλογίες CCR7

+ και CCR7

– κυττάρων, καθώς και η μεγάλη πλειοψηφία των CD27

+ κύτταρα, ESO τετραμερούς

+ κυττάρων σε ασθενείς με αυθόρμητες αποκρίσεις ήταν ως επί το πλείστον CCR7

– και περιείχε αυξημένες αναλογίες των CD27

– κύτταρα, σύμφωνα με μια πιο διαφοροποιημένο φαινότυπο (Σχήμα 6C). Τέλος, για να αποκλείσει το ενδεχόμενο ότι η επιλογή του ESO Ab

+ ασθενείς μπορεί να έχουν επιλεγεί για ασθενείς με χαμηλή ή μηδενική ESO-ειδικά Treg, αξιολογήσαμε

ex vivo

CD4

+ Τ κύτταρα από ESO ab

– DR52b

+ ασθενείς (n = 23). Ωστόσο, απέτυχε να ανιχνεύσει σημαντικά επίπεδα ESO τετραμερούς

+ σε αυτούς τους ασθενείς (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

CD4

+ Τ κύτταρα από DR52b

+ υγιείς δότες (HD) και οι ασθενείς βάφτηκαν

ex vivo

με DR52b /ESO

119-143 τετραμερή και mAb ειδικό για CD45RA, CD25, CD127, CCR7 και CD27 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα Α Dot οικόπεδα για ένα HD και έναν ασθενή του ΕΓΚ που φαίνεται. Οι αριθμοί σε οικόπεδα κουκίδα αντιστοιχεί στο ποσοστό της τετραμερούς

+ κυττάρων μεταξύ CD45RA

– κύτταρα μνήμης. Τα δεδομένα για όλους τους ΕΓΚ ασθενείς με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις προς ESO (S) που φαίνεται σε σύγκριση με την συχνότητα (μέση ± SD) του ESO τετραμερούς

+ κυττάρων σε δείγματα μετα-εμβόλιο από ασθενείς που έχουν λάβει ένα εμβόλιο ανασυνδυασμένου ESO (V) [17]. B. Dot οικόπεδα δείχνουν την έκφραση του CD25 και CD127 συνολικά κύτταρα μνήμης και σε τετραμερές

+ κύτταρα ενός EOC ασθενή. Δεδομένα που αντιστοιχούν στο ποσοστό των συμβατικών, CD25

-CD127

+ και CD25

-CD127

– και Treg, CD25

+ CD127

-, πληθυσμών εντός τετραμερούς

+ κύτταρα για όλους τους ασθενείς EOC (S) συνοψίζονται και σε σύγκριση με την αναλογία (μέσος όρος ± SD) των πληθυσμών αυτών σε εμβόλιο που προκαλείται τετραμερούς

+ κύτταρα (V). Γ Dot οικόπεδα δείχνουν την έκφραση του CCR7 και CD27 συνολικά κύτταρα μνήμης και σε τετραμερές

+ κύτταρα ενός EOC ασθενή. Δεδομένα που αντιστοιχούν στο ποσοστό των CCR7

+, CCR7

-CD27

+ και CCR7

-CD27

– Οι πληθυσμοί μέσα τετραμερούς

+ κύτταρα για όλους τους EOC ασθενείς (S) συνοψίζονται και σε σχέση με την αναλογία (μέσος όρος ± SD) των πληθυσμών αυτών σε εμβόλιο που προκαλείται τετραμερούς

+ κύτταρα (V). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός προτύπου δίπλευρη

t-test

.

Η

Συζήτηση

Ισχυρή ανοσολογικές αποκρίσεις σε καρκινικούς ιστούς είναι δυνητικά σε θέση να αποτρέψει την εξέλιξη της νόσου. Επειδή αυτές τις απαντήσεις, συχνά κατευθύνονται όχι αποκλειστικά έναντι όγκου-ειδικά αντιγόνα, αλλά και έναντι της διαφοροποίησης ή άλλων αυτο-αντιγόνα, έχουν τη δυνατότητα να βλάψει σημαντικά φυσιολογικούς ιστούς, ισχυρή ανοσορυθμιστική δίκτυα είναι σε θέση [25]. Ειδικότερα, CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ Treg, συμμετέχει στη διατήρηση της ομοιόστασης των ιστών και την αυτο-ανοχή, πιστεύεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην απόσβεση αντικαρκινική ανοσία. Προηγούμενες μελέτες ανέφεραν αυξημένες αναλογίες του Treg στην κυκλοφορία τουλάχιστον ενός μέρους των ασθενών με στερεούς όγκους [8], [9], καθώς και η συσσώρευση του CD25

+ FoxP3

+ Treg σε καρκινικές θέσεις [8], [26], ιδίως σε προχωρημένα στάδια της νόσου, και έχουν δημιουργήσει μια συσχέτιση μεταξύ της συχνότητας τους και τα κλινικά αποτελέσματα [3]. Στη βάση αυτών των ευρημάτων, οι προσεγγίσεις για την εξάλειψη των Treg έχουν σχεδιαστεί και έχουν ήδη αξιολογηθεί σε κλινικές ρυθμίσεις, παρόλο που συνδέονται με τον κίνδυνο να εξαπολύσει αυτόματη αντιδραστικότητα [27], [28], [29].

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αντιμετωπίσει την παρουσία και τη διανομή των CD4

+ Τ κύτταρα ειδικά για το ESO αντιγόνο όγκου, της ομάδας του καρκίνου /όρχεις [10], [30], [31], στο πλαίσιο κυκλοφορούν CD4

+ Τ-κυττάρων υποσύνολα ασθενών EOC. Χρησιμοποιήσαμε ένα συνδυασμό των λειτουργικών προσεγγίσεων και τετραμερή MHC τάξης II ενσωματώνει ένα ανοσοκυρίαρχο πεπτίδιο, το ESO

119 έως 143, ότι έχουμε αναπτύξει πρόσφατα [17], [18]. Εμείς δεν διαπίστωσε σημαντικές διαφορές στην αναλογία των Treg μεταξύ κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων των ασθενών EOC σε σύγκριση με υγιείς δότες. Ομοίως, βρήκαμε καμία σημαντική αύξηση στο ποσοστό των συνολικών κυκλοφορούντων CD4

+ CD25

-CD127

– Τ κύτταρα, ένας πληθυσμός που περιέχει πρόσφατα ενεργοποιημένα CD4

+ Τ κύτταρα και έχει προταθεί να περιέχει IL-10-κυττάρων που εκκρίνουν Tr1 σε υγιείς δότες [21], αλλά δεν είχαν αξιολογηθεί σε ασθενείς με καρκίνο πριν από την παρούσα μελέτη. Έτσι, ενώ οι μεταβολές στην κυκλοφορούσα διαμέρισμα Treg μπορεί πράγματι να συμβεί σε ορισμένους ασθενείς με καρκίνο, που δεν βρήκε μεγάλες αλλαγές στην ομάδα μας του ΕΓΚ ασθενών. Είναι αξιοσημείωτο, όμως, ότι οι ασθενείς αξιολογήθηκαν στην παρούσα μελέτη είχαν λάβει χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής, η οποία μπορεί να μειώσει προσωρινά Treg [32], αν και αξιολογήθηκαν σε διάφορες χρονικές στιγμές, αλλά τουλάχιστον ένα μήνα, μετά τον τερματισμό της θεραπείας. Ωστόσο, η αξιολόγηση της ανοσολογικής κατάστασης αυτού του πληθυσμού, σε σχέση με τις απαντήσεις αντι-όγκου, είναι το πιο σημαντικό για την κατάρτιση του ανοσοποιητικού που βασίζονται θεραπείες.

Με εκτίμηση ESO-συγκεκριμένες απαντήσεις στα κυκλοφορούντα CD4

+ Τ-κυττάρων υποσύνολα από ασθενείς ΕΓΚ με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις, ταξινομημένο

ex vivo

και διεγείρονται

in vitro

με πεπτίδια ESO, διαπιστώσαμε σημαντικές αναλογίες των κυττάρων που παράγουν IFN-γ σε απάντηση ESO, αλλά όχι IL-10 ή IL-17-κυττάρων που εκκρίνουν, υποδεικνύοντας ότι η πλειονότητα των ΕδΟ-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα Τ

τελεστές H1. Επειδή η μελέτη αυτή απευθύνεται ειδικά Τ

κύτταρα Η1 και Treg στην EOC, περιορίσαμε την ανάλυση των πιο σχετικών κυτοκινών, δηλαδή IFN-γ, IL-10 και, λόγω της αναφέρθηκε σχέση μεταξύ Treg και Τ

H17 κύτταρα , IL-17. Είναι, ωστόσο, θα είναι ενδιαφέρον, σε μελλοντικές μελέτες, για την αντιμετώπιση της παραγωγής επιπρόσθετων κυτοκινών όπως η IL-4 ή IL-13, από το ESO ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα. Σύμφωνα με το συμπέρασμα ότι ESO-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα που απομονώνονται από τις καλλιέργειες είναι κύτταρα τελεστές, δεν παρουσιάζουν σημαντική κατασταλτική λειτουργίες. Επιπλέον, δεν είχαμε ανιχνεύσει ΕδΟ-ειδικών κυττάρων στην κυκλοφορία Treg ασθενών με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις προς το αντιγόνο με χρώση, με MHC κατηγορίας II /ESO τετραμερή, των καθορισμένων συμβατικών και Treg CD4

Τ-κυττάρων + υποπληθυσμούς απομονωθεί

ex vivo

με κυτταρομετρία ροής ταξινόμηση κυττάρων, όπως επίσης και με άμεση

ex vivo

χρώση με τετραμερή. Σε αντίθεση με τα δεδομένα μας, προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει την απομόνωση του ESO-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων με κατασταλτική λειτουργιών από κυκλοφορούντα λεμφοκύτταρα ασθενών με προχωρημένο μελάνωμα [19], [33]. Έτσι, ενώ τα δεδομένα μας δεν αποκλείουν την ύπαρξη του ESO-ειδικών Treg, υπονοούν ότι ο τελευταίος δεν βρίσκονται συνήθως στα κυκλοφορούντα CD4

+ Τ κύτταρα από ασθενείς ΕΓΚ. Είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι, σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας, μελέτες σε μοντέλα ποντικών έχουν εξετάσει την παρουσία Treg σε αντιγονο-ειδικών Τ κυττάρων με τετραμερή και απέτυχε να ανιχνεύσει τετραμερές δέσμευσης Treg [34], [35].

Χρήση MHC τάξης II /ESO

119-143 τετραμερή

ex vivo

, θα μπορούσαμε άμεσα να συγκρίνετε ESO-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα αυθόρμητα προκύπτουν σε ασθενείς, με εκείνες που προκαλούνται μέσω εμβολιασμού με ένα ανασυνδυασμένο πρωτεΐνη ESO (Reso) χορηγείται με Montanide ™ και CpG [16]. Αξίζει να σημειωθεί ότι μέχρι την πρόσφατη ανάπτυξη των MHC κατηγορίας II /πεπτιδίου τετραμερή, ήταν δύσκολο να εκτιμηθεί αντιγόνου-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων

ex vivo

λόγω της εν γένει χαμηλής συχνότητας τους. Αυτή είναι πράγματι η πρώτη έκθεση χαρακτηρίζει CD4

+ Τ κύτταρα ειδικά για καρκίνο /αντιγόνου όρχεων σε ασθενείς με καρκίνο με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις

ex vivo.

Βρήκαμε ότι η συχνότητα των CD4

+ Τ κύτταρα ειδικά για ESO ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ασθενείς με αυθόρμητες ανοσολογικές αποκρίσεις σε σύγκριση με αυτή που βρίσκεται σε εμβολιασμένα ασθενείς. Επιπλέον, ο φαινότυπος του φυσικά προκύπτουν τετραμερούς ESO

+ κυττάρων ήταν περισσότερο διαφοροποιημένη, σε σύγκριση με τους ομολόγους τους το εμβόλιο που προκαλείται, που περιέχει αυξημένο ποσοστό των CCR7

– και CD27

– κύτταρα. Προηγούμενες μελέτες για τη συσχέτιση μεταξύ της ποιότητας της μνήμης CD4

+ αποκρίσεις των Τ-κυττάρων που προκαλείται από παθογόνα ή εμβολίων και φαινότυπο τους, έχουν δείξει ότι μια προστατευτική απόκριση μνήμης θα πρέπει να περιλαμβάνει όχι μόνο τελεστές (CCR7

-) αλλά τα κύτταρα μνήμης σε προηγούμενα στάδια διαφοροποίησης, δηλαδή κεντρική μνήμη (CCR7

+) και τα μεταβατικά μνήμης (CCR7

-CD27

+) Τ κύτταρα [36], [37]. Με βάση αυτή την ιδέα, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ΕδΟ-ειδικά CD4

+ Τ κυττάρων που επάγεται μέσω ανοσοποίησης των ασθενών με καρκίνο με το εμβόλιο Reso είναι πιθανό να είναι όχι μόνο ποσοτικά αλλά και ποιοτικά ανώτερες από εκείνες που προκύπτουν κατά την αυθόρμητη ανοσοαποκρίσεων, η οποία περαιτέρω ενθαρρύνει τη χρήση των εμβολίων ESO που βασίζεται σε ασθενείς που φέρουν ESO εκφράζουν όγκους.

Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν το δυναμικό των MHC τάξης ΙΙ /ESO τετραμερή για την σαφή ανίχνευση, ποσοτικοποίηση και την φαινοτυπική του ESO-ειδικά CD4

+ Τ κύτταρα, όχι μόνο μετά τον εμβολιασμό, αλλά επίσης και για την αξιολόγηση των ανοσολογικών αποκρίσεων που προκύπτουν φυσικά σε ασθενείς που φέρουν όγκους που εκφράζουν αντιγόνο. Η περαιτέρω εφαρμογή αυτής της προσέγγισης για τον χαρακτηρισμό των CD4

+ Τ κύτταρα ειδικά για ESO και άλλα αντιγόνα όγκων στην κυκλοφορία και σε καρκινικές θέσεις των ασθενών με καρκίνο, και οι δύο κατά μήκος τη φυσική πορεία της νόσου και κατά τη διάρκεια της θεραπείας, θα συμβάλει πιθανόν για την περαιτέρω σημαντικά την κατανόηση των ρόλων τους και τη συμβολή στην ανοσία στον καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα

ασθενών και υγιή δότη και την αξιολόγηση της ESO ειδικές αποκρίσεις αντισωμάτων

Sera και μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) συλλέχθηκαν από EOC ασθενείς δει σε CLCC René Gauducheau και από υγιή άτομα μετά από γραπτή συγκατάθεση και έγκριση από το Διοικητικό συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμική (Comité de Προστασίας des άτομα Ouest IV – Ναντ). Αντίσωμα (Ab) απαντήσεις σε ESO αξιολογήθηκαν με ELISA, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14], [16], με τη χρήση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης ESO (Reso) που παράγεται σε E.coli.

Ex vivo

εκτίμηση φαινοτυπική των CD4

+ υποσύνολα Τ-κυττάρων και κυτταρομετρία ροής διαλογή κυττάρων

CD4

+ Τ κύτταρα εμπλουτίστηκαν με θετική επιλογή από PBMC από υγιή άτομα και ασθενείς EOC μέσω μαγνητικής διαλογής κυττάρων (Miltenyi Biotec ), βάφονται με μονοκλωνικά αντισώματα (mAb) ειδικό για CD4 (BD Biosciences), CD8 (BD Biosciences), CD45RA (BD Biosciences), CD25 (Beckman Coulter), CD127 (eBioscience) και FoxP3 (eBioscience), όπως υποδεικνύεται, και αναλύονται με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα LSRII (BD Biosciences). Για

ex vivo

κυτταρομετρία ροής διαλογής κυττάρων, εμπλουτισμένο CD4

+ Τ κύτταρα χρωματίστηκαν με αντι-CD4, -CD8, -CD45RA, -CD25 και -CD127 mAb. Μετά gating σε CD4

+ CD8

-CD45RA

– λεμφοκύτταρα, τα κύτταρα χωρίστηκαν σε CD25 μνήμη

-CD127

+, CD25

-CD127

– και CD25

+ CD127

-Treg πληθυσμούς με υψηλή καθαρότητα (& gt? 97%). χρησιμοποιώντας ένα FACSAria (BD Biosciences)

In vitro

διέγερση και λειτουργική αξιολόγηση των CD4

+ υποσύνολα Τ-κυττάρων

Σύνολο CD4

+ Τ κύτταρα ή

ex vivo

ταξινομημένο μνήμη συμβατικών και Treg CD4

+ Τ-κυτταρικών πληθυσμών εγέρθηκαν

in vitro

είτε με μια δεξαμενή μακράς επικαλυπτόμενες πεπτίδια που καλύπτουν την αλληλουχία ESO [16] ή με αντι-CD2 /3/28 επικαλυμμένα μικροσφαιρίδια (Miltenyi Biotec) παρουσία ακτινοβολημένων αυτόλογων APC και καλλιεργήθηκαν με την παρουσία της ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IL- 2 (Chiron). Ημέρα 12 έως 14 καλλιέργειες αξιολογήθηκαν σε μία δοκιμασία χρώσης ενδοκυτταρική κυτοκίνη 4-h με mAb ειδικό για ΙΡΝ-γ (BD Biosciences), IL-10 (Βϋ Biosciences) και IL-17 (eBioscience), μετά από διέγερση είτε με το πεπτίδιο ESO πισίνα ή ΡΜΑ (100 ng /mL, Sigma Aldrich) και ιονομυκίνη (1 μg /mL, Sigma Aldrich), όπως υποδεικνύεται, και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (LSRII).

MHC κατηγορίας /ESO χρώση πεπτιδίου τετραμερούς II

φθορισμού HLA-DR52b /και HLA-DR4 /ESO

119-143 τετραμερή δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [18]. ESO-διεγερμένα CD4

καλλιέργειες + Τ-κυττάρων επωάστηκαν με τετραμερή σε μια τελική συγκέντρωση 3 μg /mL για 1 ώρα στους 37 ° C και στη συνέχεια βάφτηκαν με CD4-ειδικό mAb και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (LSRII). Για

ex vivo

απαρίθμηση και την φαινοτυπική των ειδικών κυττάρων, η συνολική CD4

+ Τ κύτταρα εμπλουτίζονται από PBMC με μαγνητικά ταξινομήσεως κυττάρων είχαν αναπαυθεί επί μία νύκτα, επωάστηκαν με τετραμερή (3 μg /mL) για 2 ώρες στους 37 °