Abstract

ανοσοθεραπείες όπως θετή μεταφορά Τ κυττάρων ή φυσικών φονικών κυττάρων, ή μονοκλωνικό αντίσωμα (MoAb) θεραπεία έχουν πρόσφατα αναγνωριστεί ως αποτελεσματικό μέσο για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο. Ωστόσο, θετή μεταφορά των κυττάρων Β ή κυττάρων πλάσματος που παράγουν αντισώματα όγκου-ειδικά δεν έχει εφαρμοστεί ως θεραπεία επειδή μακροχρόνια καλλιέργεια και επιλεκτική επέκταση αντιγονο-ειδικών Β κυττάρων ήταν τεχνικά πολύ δύσκολη. Εδώ, εμείς περιγράφουμε μία νέα ανοσοθεραπεία του καρκίνου που χρησιμοποιεί θετή μεταφορά των Β-κυττάρων. Έχουμε αποδείξει ότι βλαστικού κέντρου-σαν Β κύτταρα (κύτταρα iGB) επάγεται in vitro από αφελή Β κύτταρα ποντικού καθίστανται πλασματοκύτταρα και παράγουν αντισώματα IgG για περισσότερο από ένα μήνα στο μυελό των οστών μη-ακτινοβολημένων ποντικών δεκτών. Όταν μεταφέρονται σε ποντικούς, τα κύτταρα που παράγουν iGB αντίσωμα έναντι ενός υποκατάστατου αντιγόνου όγκου κατέστειλε μετάσταση στους πνεύμονες και την ανάπτυξη των κυττάρων μελανώματος ποντικού που εκφράζει το ίδιο αντιγόνο και παρέτεινε την επιβίωση των παραληπτών. Επιπλέον, έχουμε αναπτύξει ένα νέο σύστημα καλλιέργειας που ονομάζεται Φάις να επεκτείνει επιλεκτικά κύτταρα iGB αντιγονο-ειδικά χρησιμοποιώντας το γεγονός ότι τα κύτταρα iGB είναι ευαίσθητα σε Fas-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, εκτός εάν οι υποδοχείς αντιγόνου τους συνδέθηκε με αντιγόνα δεσμευμένα σε μεμβράνη. Τα επιλεγμένα κύτταρα iGB κατασταλεί αποτελεσματικά μετάσταση στους πνεύμονες των κυττάρων μελανώματος στην υιοθετούμενη ανοσοθεραπεία μοντέλο. Καθώς τα κύτταρα Β ανθρώπινου αίματος μπορεί να διαδοθεί ως κύτταρα iGB χρησιμοποιώντας συνθήκες καλλιέργειας παρόμοιες με τις κυτταρικές καλλιέργειες iGB ποντικού, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι θα είναι δυνατό για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο που φέρουν από την υιοθετούμενη μεταφορά του καρκίνου-αντιγόνου-ειδικών iGB κύτταρα επιλέγονται vitro. Αυτή η νέα θετή ανοσοθεραπεία πρέπει να είναι μια εναλλακτική λύση για την επίπονη ανάπτυξη του Μωάβ φαρμάκων κατά των καρκίνων για τους οποίους υπάρχουν σήμερα υπάρχουν αποτελεσματικές θεραπείες

Παράθεση:. Moutai Τ, Yamana Η Nojima Τ, Κιταμούρα D (2014) A Novel και αποτελεσματική Καρκίνος Ανοσοθεραπεία Μοντέλο Ποντικού Χρησιμοποιώντας αντιγόνου-ειδικά κύτταρα Β επιλεγεί in vitro. PLoS ONE 9 (3): e92732. doi: 10.1371 /journal.pone.0092732

Επιμέλεια: Yoshiki Akatsuka, Fujita Πανεπιστήμιο Υγείας, Ιατρική Σχολή, Ιαπωνία

Ελήφθη: 28 Δεκέμβρη 2013? Αποδεκτές: 24 Φλεβάρη, 2014? Δημοσιεύθηκε: 19 Μαρτίου, 2014

Copyright: © 2014 Moutai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Επιστήμης Takeda, επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Β) (22390097) από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs) και επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την επιστημονική έρευνα σε τομείς προτεραιότητας (22021042) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (MEXT) (για να DK), καθώς και από επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για JSPs Fellows (σε TM). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η ανοσοθεραπεία έχει γίνει πρόσφατα πιο ευρέως αποδεκτή ως ένα αποτελεσματικό μέσο για τη θεραπεία ασθενών με καρκίνο. Ο κύριος παίκτης στην μεσολάβηση κυττάρων ανοσοθεραπεία καρκίνου ήταν κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα (CTLs) που κατευθύνονται εναντίον των καρκινικών κυττάρων, τα οποία αναγνωρίζουν μέσω του υποδοχέα Τ-κυττάρων τους (TCR) ένα συγκεκριμένο πεπτίδιο που προέρχεται από ένα αντιγόνο όγκου (Ag) που παρουσιάζεται από MHC Ι για την κύτταρα όγκου. Τέτοια Τ κύτταρα από αποκομμένες ιστούς όγκου ή αίμα ασθενών επεκτείνονται επιλεκτικά in vitro σε συγγενικά κύτταρα που παρουσιάζουν Ag (APC) που εκφράζει τον όγκο Ag με κυτοκίνες όπως η IL-2 και στη συνέχεια μεταφέρονται πίσω στους ασθενείς [1], [2]. Σχετικά μη συγκεκριμένες εκδόσεις του κυτταρική ανοσοθεραπεία έχουν επίσης δοκιμαστεί κλινικά, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που χρησιμοποιούν τα κύτταρα Τ και ΝΚ κυττάρων επεκτάθηκε μέσω διέγερσης με IL-2 και αντι-CD3 αντισώματα (ABS), με /χωρίς επιπρόσθετες κυτοκίνες [3], [4] . Πρόσφατα, επεκτάθηκε in-vitro δενδριτικά κύτταρα (DCs), οι οποίες είναι πολύ αποδοτικό APC, έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί για την τόνωση της όγκο-Ag-ειδικά CTLs καθώς και CD4

+ Τ κύτταρα in vivo [5] – [7]. Αυτές οι θεραπείες βασίζονται σε θετή μεταφορά κυττάρων δεν έχουν μέχρι στιγμής γίνει ευρέως υιοθετηθεί ως επιλογή για τη θεραπεία του καρκίνου από την κλινική επιτυχία τους έχει περιοριστεί, ενώ θα απαιτούν χρονοβόρα εργασία στο εργαστήριο, συμπεριλαμβανομένου του πολιτισμού μεμονωμένο κύτταρο για αρκετές εβδομάδες σε ένα ποιοτικό έλεγχο καθαρό δωμάτιο .

από την άλλη πλευρά, Ab-based ανοσοθεραπεία έχει αυξάνεται με ταχείς ρυθμούς ως μια πολλά υποσχόμενη ανοσοθεραπεία του καρκίνου. Πράγματι, πάνω από δώδεκα μονοκλωνικά Abs (MoAbs) επί του παρόντος εγκριθεί για τη θεραπεία του καρκίνου στον άνθρωπο [8] – [10]. Ως αντικαρκινικό φάρμακο, MoAbs έχουν τεράστια πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τη χημειοθεραπεία, δεδομένου ότι στοχεύουν μόνο τα κύτταρα που εκφράζουν συγκεκριμένες Ags. Η βιοχημική φύση και βιολογικά χαρακτηριστικά του κάθε ισότυπου Abs είναι καλά γνωστές, και έτσι είναι οι μηχανισμοί με τους οποίους μεσολαβούν λύση κυττάρου-στόχου, δηλαδή, Ab-εξαρτώμενη κυτταρική κυτταροτοξικότητα (ADCC) και κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από συμπλήρωμα (CDC) [11], [12]. Όπως φυσικά υπάρχουσες πρωτεΐνες σε όλα τα άτομα, Abs αναμένεται να έχουν λιγότερες παρενέργειες και, ως εκ τούτου, είναι πιο εύκολο να προβλέψουμε τις επιδόσεις τους ως φάρμακο. Σε σύγκριση με τις μεσολάβηση κυττάρων ανοσοθεραπείες που περιγράφεται παραπάνω, Ab-μεσολάβηση ανοσοθεραπεία είναι απλούστερο να εκτελέσει εάν η παράδοση του MoAb είναι επαρκής. Ωστόσο, τα φάρμακα MoAb έχουν επίσης μειονεκτήματα: είναι ακριβά και η ανάπτυξή τους εξακολουθεί να είναι δύσκολη, απαιτώντας σημαντικό χρόνο και κόστος, από την ανοσοποίηση των ζώων, μέσω της διαλογής υβριδωμάτων, την κλωνοποίηση και ανασυνδυασμός μεθόδους γονιδιακής για εξανθρωπισμό τους, η οποία είναι απαραίτητη για να αποφευχθεί μια ανοσολογική απόκριση από τον αποδέκτη [10], [13]. Όγκου Ags ότι στοχεύουν MoAb φάρμακα είναι συνήθως διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες είναι συχνά δύσκολο να προετοιμαστούν ως διαλυτή ανοσοποιητικό. Επιπλέον, ακόμη και με εξανθρωπισμένα MoAbs, τα υπολείμματα προερχόμενα από ποντικό τμήματα της περιοχής V μπορεί να είναι αντιγονικά σε ανθρώπους και επάγουν ανθρώπινα αντι-ποντικού Abs [14]. Λόγω αυτών των ζητημάτων, οι φαρμακευτικές εταιρείες τείνουν να περιορίσουν τους στόχους MoAb με αυτές που εκφράζονται από σχετικά κοινούς καρκίνους.

Δεδομένων των ανωτέρω πλεονεκτήματα του Μωάβ τα ναρκωτικά και το βάσιμο των θετών θεραπείες μεταφορά κυττάρων ως κυρίως παραγγελία και κοστίζουν λιγότερο για την ανάπτυξη, φαίνεται εύλογο να αναπτύξουν μια θεραπεία για να μεταφέρει τα κύτταρα του πλάσματος που λαμβάνονται από ασθενή που παράγουν ογκο-Ag-ειδική, πλήρως ανθρώπινο Ab. Ωστόσο, δεν είμαστε ενήμεροι για κάθε περίπτωση κατά την οποία μια τέτοια θεραπεία ήταν επιτυχής. Τα κύτταρα πλάσματος είναι τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα και έτσι δεν είναι σε θέση να αναπτυχθούν σε καλλιέργεια. Αντ ‘αυτού, τα κύτταρα Β, ένας άμεσος πρόδρομος των κυττάρων του πλάσματος, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη μεταφορά. Ωστόσο, ακόμη και Β κύτταρα έχουν αποδειχθεί ότι είναι δύσκολο να επεκταθεί σε επαρκή αριθμό για την θεραπεία μεταφοράς. Επιπλέον, δεν έχει τεκμηριωθεί αν και σε ποιο βαθμό οι μεταφέρεται Β κύτταρα μπορούν να επιβιώσουν και να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα πλάσματος in vivo.

Συνήθως, τα MoAbs που λαμβάνονται από Ag-ειδικά υβριδώματα, υβριδικών κυττάρων μεταξύ σπληνικά Β κύτταρα από επανειλημμένα ανοσοποιημένα ζώα και πλασμακυτώματος κυτταρική γραμμή συνεργάτη σύντηξης. Στο ζώο ανοσοποιείται με ένα δεδομένο Ag, τα Ag-δεσμεύονται Β κύτταρα ενεργοποιούνται και πολλαπλασιάζονται για να σχηματίσουν βλαστικά κέντρα (GCS) στις σπλήνες ή λεμφαδένες. Στην GCs, τα Β κύτταρα υφίστανται μεταγωγή ισοτύπου και σωματική υπερμετάλλαξη των γονιδίων ανοσοσφαιρίνης για την αύξηση της συνάφειας των υποδοχέων τους Ag (υποδοχέα Β-κυττάρων, BCR). Μεταξύ αυτών, τα Β κύτταρα που εκφράζουν BCR ειδικά για το ανοσοποιημένο Ag επεκτείνονται επιλεκτικά και να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα μνήμης Β ή μακρόβιων κυττάρων πλάσματος (LLPCs) [15], [16]. Μετά μια τελική αναμνηστική ανοσοποίηση, τα Ag-ειδική μνήμη Β κύτταρα ενεργοποιούνται και πολλαπλασιάζονται για να γίνει plasmablasts, η οποία συνήθως σχηματίζουν τα Ag-ειδικά υβριδώματα. Έτσι, αν και Ag-ειδικά κύτταρα μνήμης Β μπορούν να βρεθούν σε μεγάλο αριθμό σε ανοσοποιημένα άτομα, αντιγόνου-ειδικά Β κύτταρα είναι συνήθως σπάνια σε μη ανοσοποιημένα άτομα. Ως εκ τούτου, οποιαδήποτε θεραπεία Β-κυττάρων θετή μεταφορά αυτή θα απαιτούσε μια μέθοδο για να επεκτείνει επιλεκτικά τις σπάνιες όγκου-Ag-ειδικά Β κύτταρα από τις εξαιρετικά πολυκλωνικά περιφερικά Β κύτταρα των ασθενών.

Για να αναπτύξει ένα σύστημα για την επέκταση επιλεκτικά όγκου -Αγ-ειδικά Β κύτταρα για επίκτητη θεραπεία μεταφοράς, χρησιμοποιήσαμε την επαγόμενη GC Β (iGB) σύστημα κυτταρικής καλλιέργειας που αναφέρθηκε πρόσφατα [17]. Σε αυτό το σύστημα, το ποντίκι αφελείς Β κύτταρα καλλιεργούνται διαδοχικά με IL-4 και IL-21 σε έναν τροφοδότη κυτταρική γραμμή που εκφράζει CD40L και BAFF (40 lb), με αποτέλεσμα την εκτεταμένη πολλαπλασιασμό (μέχρι 10.000 φορές σε 8 ημέρες) από ταξικές μεταγωγής Β κύτταρα με φαινότυπο GC, ονομάζονται κύτταρα iGB. Μετά από καλλιέργεια με IL-21 και να μεταφέρει σε ακτινοβολημένα ποντίκια, τα κύτταρα iGB διαφοροποιούνται σε κύτταρα πλάσματος και τείνουν να αποικίσουν τον μυελό των οστών (ΒΜ) και εκκρίνουν Abs [17]. Με την προσαρμογή αυτού του συστήματος για την ανθρώπινη Β κύτταρα, θα είναι δυνατή η παρασκευή μεγάλου αριθμού των ανθρώπινων Β κυττάρων που θα παράγουν πλήρως ανθρώπινα Abs όταν μεταφέρονται σε ασθενείς. Προς το στόχο της δημιουργίας μας Β-κύτταρα θετή θεραπεία μεταφοράς για τον καρκίνο, έχουμε αξιολογηθεί σε ένα μοντέλο ποντικού πόσο και για πόσο χρονικό διάστημα τα μεταβιβαζόμενα κύτταρα iGB παράγουν Ab σε μη ακτινοβολημένα ποντίκια, και κατά πόσον αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων ότι εκφράζουν ένα Ag που αναγνωρίζεται από το ίδιο Ab in vivo. Επιπλέον, με την εφαρμογή της τεχνικής καλλιέργειας iGB, έχουμε αναπτύξει ένα σύστημα για την επιλογή σχετικά σπάνια κύτταρα Β που δεσμεύονται σε ένα δεσμευμένο σε μεμβράνη Ag, και έδειξαν ότι τα επιλεγμένα Β κύτταρα είναι αποτελεσματικά στο μοντέλο ανοσοθεραπεία καρκίνου υιοθετούμενη μεταφορά.

Αποτελέσματα

iGB κύτταρα αποικίζουν το μυελό των οστών και παράγουν Ab μετά την μεταφορά σε μη ακτινοβολημένα ποντίκια

Όπως έχει ήδη αναφερθεί, τα περισσότερα iGB κύτταρα μετά την δευτερογενή καλλιέργεια με IL-21 έχουν υποστεί μεταστροφή τάξης και εκφράζουν είτε IgG1 ή IgE από την ημέρα 8. Πολύ λίγοι από αυτούς εκφράζουν IgM, IgG2b ή IgA, και σχεδόν καμία ρητή IgG2c ή IgG3 (Εικόνα 1Α). Δείξαμε προηγουμένως ότι τα κύτταρα iGB διαφοροποιούνται σε κύτταρα πλάσματος στο μυελό των οστών (ΒΜ), όταν μεταφέρθηκαν σε ακτινοβολημένα ποντίκια. Εδώ αξιολογήσαμε την παραγωγή Ab από τα iGB προερχόμενα κύτταρα πλάσματος σε μη ακτινοβολημένα ποντίκια. Τα κύτταρα iGB παρήχθησαν από Hy10 ποντίκια, τα οποία φέρουν ένα λυσοζύμη αυγού κότας (HEL) -ειδικές βαριά αλυσίδα (VDJ9) και ελαφριάς αλυσίδας (κ5) γονίδια σε knock-in διαγονιδιακά και διαμορφώσεις, αντίστοιχα [18]. Μεταξύ των κυττάρων iGB, IgE

– CD138

– (HEL

+) κύτταρα HEL-πρόσδεσης FACS καθαρίστηκαν και μεταφέρθηκαν σε μη ακτινοβολημένα C57BL /6 (Β6) ποντίκια, τα οποία υποβλήθηκαν σε αφαίμαξη εβδομαδιαίως για τη μέτρηση η συγκέντρωση του IgG 1 αντι-ΗΕί. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 Β, ένα υψηλό επίπεδο HEL ειδικών IgG1 ανιχνεύθηκε στους ορούς μία εβδομάδα μετά τη μεταβίβαση, και στη συνέχεια σταδιακά μειώθηκε σε ένα χαμηλό, αλλά ακόμα ανιχνεύσιμο επίπεδο (& gt? 1 μg /ml) από 10 εβδομάδες. Αντι-HEL IgG1 ήταν ανιχνεύσιμη στον ορό των ποντικών ελέγχου που έλαβαν κύτταρα iGB προέρχονται από WT ποντίκια Β6. Σημαντικοί αριθμοί αντι-ΗΕί κύτταρα IgG1 Ab που παράγουν (APCs) ανιχνεύθηκαν στο ΒΜ, αλλά πολύ λίγοι στον σπλήνα, των ποντικών που έλαβαν τα Hy10 προερχόμενα κύτταρα iGB 4 εβδομάδες νωρίτερα (Σχήμα 1 C). Αντι-HEL Ab του IgG2b κατηγορίας, αλλά όχι από IgG2c ή IgG3 (τα δεδομένα δεν φαίνονται), ήταν επίσης ανιχνεύσιμη μία εβδομάδα μετά την μεταφορά με Hy10 προερχόμενα κύτταρα iGB αλλά όχι με κύτταρα WT iGB (Εικόνα 1D). Αν και η ακριβής συγκέντρωση του IgG2b αντι-ΗΕί δεν μπορούσε να εκτιμηθεί λόγω της έλλειψης ενός προτύπου ισότυπο αντι-HEL Ab, ο τίτλος IgG2b ήταν πολύ χαμηλότερη από εκείνη του αντι-ΗΕί IgG1 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα δεικνύουν ότι in-vitro που δημιουργούνται κύτταρα iGB είναι ικανά να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα πλάσματος που αποικίζουν το ΒΜ μη ακτινοβολημένων ποντικών και μπορεί να συνεχίσει να παράγει Ab εκεί για τουλάχιστον 4 εβδομάδες.

(Α ) σπληνικά Β κύτταρα από C57BL /6 ποντικούς καλλιεργήθηκαν για 4 ημέρες με IL-4, έπειτα για 4 ημέρες με IL-21 σε 40 κύτταρα LB. Η έκφραση της Ig ισοτύπων, CD19 και CD138 στα επεκταθεί κύτταρα iGB αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τα κύτταρα μέσα στην πύλη λεμφοκυττάρων που ορίζεται από το πλάι και προς τα εμπρός σκέδαση. Οι αριθμοί δείχνουν τα ποσοστά των κυττάρων iGB στα τεταρτημόρια ή παράθυρα. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) αφελής, HEL-δεσμευτική ή σύνολο Β κύτταρα από τις σπλήνες Hy10 ή WT ποντικοί C57BL /6, αντίστοιχα, καλλιεργήθηκαν όπως στο (Α). Μετά την καλλιέργεια, τα κύτταρα iGB συλλέχθηκαν και CD138

– IgE

– iGB κύτταρα (2 × 10

7 κύτταρα /ποντίκι) καθαρίστηκαν και μεταφέρθηκαν ενδοφλεβίως σε μη-ακτινοβολημένα C57BL /6 ποντίκια. PBS εγχύθηκε επίσης ως έλεγχος. Αυτοί οι ποντικοί αφαιμάχθηκαν στις ενδεικνυόμενες εβδομάδες μετά την μεταφορά και την αντι-ΗΕί συγκέντρωση IgG1 στον ορό προσδιορίσθηκε με ELISA. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± S.D. των μεμονωμένων ορό ποντικών (n = 5 για κάθε ομάδα). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. (C) HEL-δέσμευσης ή ολική Β κύτταρα καλλιεργήθηκαν και μεταφέρθηκε σε μη ακτινοβολημένα ποντίκια όπως στο (Β). Τέσσερις εβδομάδες μετά τη μεταφορά, οι αριθμοί των AFCs εκκρίνουν HEL-δεσμευτική IgG1 μεταξύ σπλήνας ή μυελού των οστών τα κύτταρα προσδιορίστηκαν με δοκιμασία ELISPOT. Ο μέσος αριθμός ± S.D. της AFCs σε 10

6 σπλήνας ή κύτταρα ΒΜ υποδεικνύεται από κάθε γραμμή. Ορατή είναι συλλογικά δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε ένα χρησιμοποιώντας 3 ποντίκια δέκτη ανά ομάδα. * P & lt? 0.001. Μ.π. Δεν .: εντοπιστεί. Οι τίτλοι (D) Αντι-HEL IgG2b στα δείγματα ορού (10-φορές αραιώσεις) που λαμβάνεται στο 1 εβδομάδα στο (Β) προσδιορίστηκαν με ELISA. Κάθε τιμή είναι η μέση ± S.D. των δειγμάτων (η = 5 ανά κάθε ομάδα). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

iGB κύτταρα Αναστέλλουν μετάσταση στους πνεύμονες του ποντικιού μελάνωμα κύτταρα in vivo

Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν μια πιθανή εφαρμογή του συστήματος κυτταρικής καλλιέργειας iGB με την κλινική χρήση, δηλαδή σε Ab μεσολάβηση θεραπεία του καρκίνου. Δοκιμάσαμε αυτή τη δυνατότητα με μια καλά μελετημένη μοντέλο ποντικού της μετάστασης του όγκου χρησιμοποιώντας την κυτταρική γραμμή μελανώματος Β16 ποντικού. Χρησιμοποιήσαμε Β16 κύτταρα με μία μεμβράνη-αγκυρωμένο μορφή HEL (mHEL) [19] ως υποκατάστατο του όγκου Ag, και δημιουργείται ένα κλώνο επιμόλυνσης με ομοιογενή έκφραση HEL πάνω στην κυτταρική επιφάνεια, που ονομάζεται Β16-mHEL (Σχήμα 2Α). Δοκιμάσαμε αν iGB κύτταρα HEL-ειδικά θα μπορούσε να αναστείλει τη μετάσταση και την ανάπτυξη των κυττάρων Β16-mHEL in vivo με την παραγωγή αντι-ΗΕί Abs. Δεδομένου ότι το HEL-συγγένεια δέσμευσης των Hy10 σπλήνας Β κύτταρα είναι γνωστό ότι είναι ετερογενή [18], ταξινομήσαμε εκείνα έντονα δεσμευτικός HEL από Hy10 σπλήνα Β κύτταρα και τους καλλιεργήθηκαν επί 40 τροφοδοτικά κύτταρα LB για 3 ημέρες με IL-4 και στη συνέχεια για 3 ημέρες με IL-21 για να κάνει τα κύτταρα iGB. Σπληνικά Β κύτταρα από WT ποντίκια Β6 ήσαν επίσης καλλιεργήθηκαν παράλληλα. IgE

– CD138

– Β κύτταρα διαλέγεται από το Hy10 iGB (Hy10-iGB) ή WT iGB κύτταρα (WT-iGB), ή με PBS μόνο ως έλεγχος, στη συνέχεια εγχύθηκαν ί.ν. σε μη ακτινοβολημένα Β6 ποντίκια που είχαν λάβει Β16-mHEL 24 ώρες πριν (Σχήμα 2Β). Πνεύμονες των ποντικών δεκτών ελέγχθηκαν τρεις εβδομάδες αργότερα. Οι πνεύμονες των ποντικών που έλαβαν κύτταρα WT iGB ή PBS μόνο, είχε πολλές συστάδες του διαδίδονται ευρέως κυττάρων όγκου, ως επί το πλείστον με σύντηξη μεταξύ τους για να σχηματίσουν δυσδιάκριτες μάζες. Αντίθετα, μόνο μερικές μικρές μάζες των καρκινικών κυττάρων βρέθηκαν σε ποντίκια που είχαν λάβει κύτταρα Hy10 iGB (Σχήμα 2C). Ως μάρτυρας, ποντίκια που εμβολιάστηκαν με γονικά κύτταρα Β16 ανέπτυξαν πολυάριθμα όγκων του πνεύμονα, ακόμη και όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με κύτταρα Hy10 iGB (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Εκφραση του HEL Ag επί των κυττάρων μελανώματος Β16 επιμολυσμένα με μια έκφραση mHEL φορέας (B16-mHEL). κύτταρα Β16-mHEL χρωματίστηκαν με αντι-ΗΕί IgG1 MoAb (μαύρη γραμμή) ή ισότυπο ελέγχου MoAb (σκιασμένη), που ακολουθείται από ΑΡΟ-συζευγμένο αντι-ποντικού IgG1 Ab και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Ο αριθμός δείχνει το ποσοστό των mHEL-εκφράζοντα κύτταρα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Πειραματική στρατηγική. IgE

– CD138

– iGB κύτταρα (2 × 10

7 κύτταρα /ποντίκι) που προέρχεται από HEL-δεσμευτική σπληνός Β κύτταρα Hy10 ποντίκια (Hy10-iGB) ή ολική σπληνός Β κύτταρα WT C57BL /6 ποντικούς (WT-iGB), ή PBS μόνο μεταφέρθηκαν iv σε μη ακτινοβολημένα ποντίκια C57BL /6, τα οποία είχαν μεταφερθεί ί.ν. με Β16-mHEL (C, D, E) ή Β16-mHEL-GFP (F, G) κύτταρα (2 χ 10

5 κύτταρα /ποντικό) 24 ώρες πριν. (C) Φωτογραφίες από τους πνεύμονες των ποντικών δεκτών που περιγράφονται στο (Β) 3 εβδομάδες μετά τη μεταβίβαση. Οι εικόνες δύο ποντικών επιλέγονται τυχαία από δέκα ανά ομάδα απεικονίζεται. Όταν είναι δυνατόν, οι πνεύμονες των υπολοίπων των ποντικών επιθεωρούνται οπτικά κατά την ημέρα του θανάτου. Στα μη-επεξεργασμένα ομάδες, υπήρχε συγχώνευση των μεμονωμένων μεταστάσεων σε πολύ μεγάλες μάζες όγκου, καθιστώντας νόημα να μετρήσει τον αριθμό των όγκων. ρυθμού (D) Επιβίωση του ίδιου συνόλου των ομάδων ποντικών (η = 10 ανά ομάδα) όπως στο (Β) συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας το τεστ logrank. * P & lt? 0.001. (Ε) Συγκέντρωση της αντι-ΗΕί IgG1 στον ορό στα ίδια ποντίκια που χρησιμοποιήθηκαν σε (D) προσδιορίστηκε με ELISA στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Ανοικτού και κλειστού σύμβολα δείχνουν τις τιμές των επιμέρους δείγματα και οι μέσοι όροι της κάθε ομάδας, αντίστοιχα. Τα δεδομένα σε (D) και (Ε) είναι αντιπροσωπευτικά τεσσάρων παρόμοια πειράματα. (F) σύνδεση του αντι-HEL IgG1 να B16-mHEL κυττάρων στον πνεύμονα ποντικών που φέρουν όγκο. Πνεύμονες ποντικών που είχαν λάβει κύτταρα Hy10 iGB (μαύρη γραμμή) ή PBS (σκιασμένο) και τα κύτταρα Β16-mHEL-GFP (2 × 10

5 κύτταρα /ποντικό) όπως στο (Β) αποκόπηκαν 3 εβδομάδες μετά την μεταφορά. Ενιαία κυτταρικά εναιωρήματα από τους πνεύμονες χρωματίστηκαν με αντι-ποντικού IgG1-APC και αναλύθηκαν με FACSCantoII. Εκπρόσωπος ιστογράμματα των δειγμάτων με περίφραξη σε GFP είναι

+ κύτταρα εμφανίζονται. (G) Σύνοψη των πειραμάτων φαίνονται στο (F). Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέσους όρους ± Τ.Α. γεωμετρικών μέσων (Geom. Η μέση) του APC ένταση φθορισμού του GFP

+ κύτταρα από ποντίκια από κάθε ομάδα (η = 3). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. ** P & lt?. 0.05

Η

Η μακροχρόνια παρατήρηση του ίδιου συνόλου των ποντικών αποκάλυψε ότι τα ποντίκια που μεταφέρονται με τα κύτταρα Hy10 iGB επέζησαν σημαντικά περισσότερο από εκείνες που μεταβιβάστηκαν με WT κύτταρα iGB ή μόνο PBS (Σχήμα 2D ). Μεταξύ αυτών των ποντικών, ο ορός αντι-ΗΕί IgG1 ανιχνεύθηκε σε σχετικά υψηλή συγκέντρωση στην πρώιμη περίοδο της χρονικής πορείας μόνο στα ποντίκια μεταφέρθηκαν με κύτταρα Hy10 iGB, αν και η συγκέντρωση Ab σταδιακά μειώθηκε (Σχήμα 2Ε). Θα μπορούσαμε να δείξουμε με κυτταρομετρία ροής ότι η αντι-HEL IgG1 συνδέθηκε στα κύτταρα Β16-mHEL λαμβάνονται από όγκους του πνεύμονα ex vivo 3 εβδομάδες μετά την μεταφορά των κυττάρων Hy10 iGB (Σχήμα 2F και 2G). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα δεικνύουν ότι το HEL-ειδική Abs που παράγονται από κύτταρα του πλάσματος iGB-κυττάρων που προέρχεται απευθείας ανέστειλε τον αποικισμό και /ή την ανάπτυξη των Β16-mHEL κύτταρα στον πνεύμονα και παρατεταμένη επιβίωση των ποντικών δεκτών. Οι πιθανοί μηχανισμοί για την Ab μεσολάβηση καταστολή του όγκου και τις πιθανές αιτίες για την ενδεχόμενη θάνατο των ποντικών αντιμετωπίζονται συζητούνται παρακάτω.

Ανάπτυξη ενός συστήματος καλλιέργειας για τη Διεύρυνση Επιλεκτικά Αγ ειδικά iGB κύτταρα

Ο αποτελέσματα αυτών των in vivo μελέτες πρότειναν ότι θα μπορούσε να είναι δυνατή η χρήση θεραπεία όγκου iGB-μεσολάβηση κυττάρων σε ανθρώπους. Προς το σκοπό αυτό, θα ήταν απαραίτητη η επιλογή προφανώς σπάνια κύτταρα Β με ειδικότητα για ένα δεδομένο όγκο Ag. Ως εκ τούτου, πρώτα προσπάθησαν να αναπτύξουν ένα σύστημα μοντέλο για τον εμπλουτισμό και την επέκταση Ag-ειδικά Β-λεμφοκύτταρα ποντικού υπάρχει σε χαμηλά επίπεδα στην πισίνα πολύκλωνα Β κυττάρων. Σχεδιάσαμε ένα σύστημα που βασίζεται σε Fas /FasL απόπτωση που διαμεσολαβείται, αφού ουσιαστικά όλα τα κύτταρα εκφράζουν iGB Fas [17] και είναι ευαίσθητα σε Fas απόπτωση που διαμεσολαβείται (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, τα κύτταρα iGB καθίστανται ανθεκτικά σε Fas απόπτωση που διαμεσολαβείται όταν IgG1 BCR τους συνδέεται με δεσμευμένο σε μεμβράνη Ag (τα δεδομένα δεν φαίνονται), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για την ενεργοποιημένη IgM

+ Β κύτταρα [20]. Ως εκ τούτου, μόνο Ag δέσμευσης κυττάρων iGB πρέπει επιβιώνουν υπό συνθήκες όπου Fas εμπλέκεται (Σχήμα 3Α). Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, έχουμε ετοιμάσει ένα πρότυπο σύστημα και δημιουργούνται δύο νέες τροφοδότη κυτταρικές σειρές, 40 κύτταρα LB που εκφράζουν σταθερά ένα υποκατάστατο Αγ mHEL (40 lb-mHEL) και εκείνων που εκφράζουν σταθερά mHEL και FasL (40 lb-mHEL-FasL). Ξεκινήσαμε τις κυτταρικές καλλιέργειες iGB σε συμβατικά τροφοδοτικά κύτταρα 40 LB με μίγμα σπλήνας Β κύτταρα από CD45.1

+ ποντίκια Hy10 και CD45.2

+ WT ποντικούς σε αναλογία 1:99. Μετά τη διαδοχική καλλιέργεια με IL-4 και IL-21 επί 40 κύτταρα LB (επέκταση), τα διογκωμένα κύτταρα iGB απλώθηκαν σε 40 κύτταρα τροφοδότες LB-mHEL και καλλιεργήθηκαν για 6 ώρες (Ag-διέγερση), και στη συνέχεια ανακαλλιεργήθηκαν σε 40 LB -mHEL-FasL για 8 ώρες (επιλογή), και τέλος σε 40 LB για 5 ημέρες (ανάκτηση), με IL-21 παρών καθ ‘όλη μετά τη φάση επέκτασης. Αυτές οι ειδικές συνθήκες προσδιορίστηκαν μετά από πολλές δοκιμές με διάφορες ρυθμίσεις (Σχήμα 3Β). Μετά τη φάση επέκτασης, επιβεβαιώσαμε ότι το ποσοστό των CD45.1

+ κυττάρων HEL-δεσμευτική παρέμεινε στο 1% (Εικόνα 3C). Το ποσοστό παρέμεινε η ίδια μετά την κουλτούρα Ag-διέγερση, και έκανε έτσι στην καλλιέργεια ελέγχου σε 40 κύτταρα τροφοδότη LB, καθώς, αν και η ένταση της χρώσης HEL έγινε κάτω στην πρώην πιθανώς επειδή το BCR ήταν εσωτερικεύεται (Σχήμα 3D, «επιλεγμένο «). Μετά τις επόμενες φάσεις επιλογής και ανάκτησης, ωστόσο, η αναλογία των CD45.1

+ HEL δέσμευσης κυττάρων αυξήθηκε έως και -80% κατά μέσο όρο, ενώ δεν εμπλουτισμός παρατηρήθηκε μετά την παράλληλη καλλιέργεια ελέγχου επί 40 κύτταρα LB ( «μη επιλεγέντος «). Τα επιλεγμένα κύτταρα iGB κυρίως εκφράζεται BCR του IgG1 ισοτύπου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Χρησιμοποιώντας το «επιλεγμένο» πρωτόκολλο, κατά μέσο όρο 3 × 10

5 HEL-δεσμευτική Β κύτταρα ανακτήθηκαν από την καλλιέργεια που ξεκίνησε με 10

4 τέτοια κύτταρα μεταξύ 10

6 Β κύτταρα συνολικά (Σχήμα 3Ε και 3F). Έτσι, έχουμε καθιερώσει ένα πρωτόκολλο καλλιέργειας επιλογής που επιτρέπει την αποτελεσματική εμπλουτισμό και την επέκταση του Ag ειδικά Β κύτταρα που είναι παρόν ως ένα μικρό πληθυσμό ανάμεσα σε μια μεγάλη πλειοψηφία των μη-ειδικών πολυκλωνικών Β κυττάρων. Καλούμε αυτό το σύστημα επιλογής το «Fas με τη μεσολάβηση του συστήματος ειδικών για το αντιγόνο επιλογής iGB κυττάρων (Φάις)». Επίσης, έχουμε καταφέρει να εμπλουτισμό κύτταρα iGB ειδικά για το απτένιο 4-υδροξυ-3-νιτροφαινυλ ακετύλιο (ΝΡ), αρχικώς παρούσα σε περίπου 5%, έως περίπου 80% κατά την ίδια ουσιαστικά συστήματος χρησιμοποιώντας τα FasL που εκφράζουν 40 κύτταρα LB που εμφανίζουν NP-συζευγμένη πρωτεΐνη στην επιφάνειά τους (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

(Α) Σχηματική αναπαράσταση της αρχής της σύστημα Fas μεσολάβηση Ag-ειδική κυτταρική επιλογή iGB (Φάις). Μόνο κύτταρα iGB των οποίων BCR προσδένονται με Ag παρουσιάζονται σε κύτταρα τροφοδότη γίνονται ανθεκτικά σε θάνατο μέσω Fas απολίνωση από FasL στα ίδια κύτταρα τροφοδότη. (Β) Πρωτόκολλο για το σύστημα Φάις. Σπληνικά Β κύτταρα από CD45.1

+ ποντίκια Hy10 και CD45.2

+ WT ποντικούς αναμείχθηκαν σε αναλογία 1:99 (1%), και καλλιεργήθηκαν σε 40 LB τροφοδοτικό στρώμα με IL-4 για 3 ημέρες και ακολούθως με IL-21 για 2 ημέρες. Τα προκύπτοντα iGB κύτταρα βαθμηδόν καλλιεργήθηκαν σε τροφοδοτικά στρώματα 40 LB-mHEL για 6 ώρες (Ag-διέγερση), 40 LB-mHEL-FasL για 8 ώρες (επιλογή), και 40 LB για 120 h (ανάκτηση) στο «επιλεγμένο» πρωτόκολλο. Στο «μη-επιλεγμένο» πρωτόκολλο, ο κατάλληλος αριθμός κυττάρων iGB ήταν απλώνονται εκ νέου σε ένα στρώμα τροφοδότη των 40 κυττάρων LB με το ίδιο χρονοδιάγραμμα όπως το «επιλεγμένο» πρωτόκολλο. Σε κάθε στιγμή της επαναφόρτωση κύτταρα iGB απομονώθηκαν από τον τροφοδότη, IgE

+ και CD138

+ κύτταρα σε δύο πρωτόκολλα. (Γ-Ε) προφίλ κυτταρομετρίας Εκπρόσωπος ροής (HEL-δεσμευτική έναντι CD45.1? Περίφραξη σε CD19

+ κύτταρα) των μικτών κυττάρων iGB πριν από τη φάση της Αγ-διέγερσης (0 h? C), μετά την AG- φάση διέγερσης (6 h? D), και μετά τη φάση ανάκτησης (134 h? Ε). Σε κάθε χρονικό σημείο, καθαρισμένα κύτταρα iGB βάφτηκαν με βιοτινυλιωμένα HEL και στρεπταβιδίνη-ΑΡΟ, αντι-CD19 και αντι-CD45.1 Abs και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Τα προφίλ των κυττάρων iGB καλλιεργηθεί από το «επιλεγμένο» (αριστερά) ή «μη-επιλεγμένο» (δεξιά) πρωτόκολλο φαίνονται. Οι αριθμοί σε κάθε παράθυρο αντιπροσωπεύει το ποσοστό των κυττάρων Hy10 iGB (CD45.1

+, HEL-σύνδεση) μεταξύ των συνολικών CD19

+ iGB κύτταρα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (F) Ο απόλυτος αριθμός (αριστερά) και ποσοστό (δεξιά) των κυττάρων Hy10 iGB μετά την καλλιέργεια ανάκτηση είτε με το μη επιλεγμένο ή επιλεγμένο πρωτόκολλο όπως προσδιορίζεται από την ανάλυση που φαίνεται στο (Ε) παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05. ** P & lt?. 0.01

Η

Στη συνέχεια εξετάστηκε κατά πόσον λιγότερες Ag-ειδικά Β κύτταρα σε μια μη ειδική πισίνα θα μπορούσε να εμπλουτιστεί, προβλέποντας τη δυνατότητα να χρησιμοποιούν αυτό το σύστημα για κλινική εφαρμογή. Αυτή τη φορά, αρχίσαμε τις καλλιέργειες με CD45.1

+ Hy10 σπληνός Β κύτταρα αναμιγνύονται σε συχνότητα 0,1 ή 0,01% σε 1 × 10

6 WT Β6 σπληνικά Β κύτταρα (CD45.2

+) , μια συχνότητα που επιβεβαιώθηκε λίγο πριν από την καλλιέργεια Ag-διέγερση του iGB κυττάρων (Σχήμα 4Α). Κάθε μίγμα Β-κυττάρων καλλιεργήθηκε σύμφωνα με το σύστημα Φάις ( «επιλεγμένο») ή απλώς επί 40 κύτταρα LB ως έλεγχος ( «μη-επιλεγμένο»). Μετά την καλλιέργεια ανάκτησης, οι HEL δέσμευσης κύτταρα iGB εμπλουτίστηκαν σε -40% και -10% όταν ήταν αρχικά παρόν στο 0,1% και 0,01%, αντίστοιχα (Σχήμα 4Β και 4C). Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι πολύ σπάνια Ag-ειδικά Β κύτταρα, τόσα λίγα όσο 1 στους 10

4, θα μπορούσε να εμπλουτιστεί και να επεκταθεί με επανάληψη της πρωτόκολλο καλλιέργειας Φάις.

(Α και Β) σπληνικά Β κύτταρα από ποντίκια CD45.1

+ Hy10 αναμείχθηκαν σε συχνότητα 0,1% ή 0,01% με 1 χ 10

6 CD45.2

+ WT σπληνικά Β κύτταρα. Τα μικτά κύτταρα (1 χ 10

6) καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3Β. Εμφανίζονται τα προφίλ κυτταρομετρίας ροής (HEL-δεσμευτική έναντι CD45.1? Περίφραξη σε CD19

+ κύτταρα) των μικτών κυττάρων πριν από τη φάση της Αγ-διέγερσης (0 h? Α) και μετά τη φάση της ανάκαμψης (134 ώρες? Β ) σε ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. Ο αριθμός αναγράφεται σε κάθε παράθυρο δείχνει το ποσοστό των κυττάρων Hy10 iGB (CD45.1

+, HEL-σύνδεση) μεταξύ των συνολικών CD19

+ iGB κύτταρα. (Γ) Το ποσοστό των κυττάρων Hy10 iGB μετά από καλλιέργεια ανάκτηση είτε μη επιλεγμένων ή επιλεγμένο πρωτόκολλο ξεκίνησε από την αναλογία ανάμιξης 0,1% (αριστερό πάνελ, η = 3) ή 0,01% (δεξιός πίνακας, η = 2), όπως προσδιορίζεται από την ανάλυση που φαίνεται στο (Β), υποδεικνύονται ως μέσοι όροι ± SD ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,01. ** P & lt?. 0.05

Η

In-vitro Επιλεγμένα Αγ ειδικά iGB κύτταρα καταστέλλουν την ανάπτυξη των όγκων in vivo

Τέλος, εξετάσαμε αν οι in-vitro επιλεγμένα κύτταρα iGB είναι ένας αποτελεσματικός θεραπεία αντι-όγκου στο μοντέλο μετάστασης μελανώματος σε ποντικούς. CD45.1

+ HEL δέσμευσης Β κύτταρα από ποντικούς Hy10 αναμίχθηκαν με CD45.2

+ πολύκλωνα Β κύτταρα από WT ποντικούς Β6 σε μία αναλογία 1:99 και καλλιεργήθηκαν στο σύστημα Φάις ή σε 40 κύτταρα LB ως μη επιλεγμένο στοιχείο ελέγχου, όπως περιγράφεται στο σχήμα 3 (Σχήμα 5Α). Μετά την καλλιέργεια ανάκτησης, η συχνότητα των HEL δέσμευσης κυττάρων iGB έφθασε το 85%, ένα εμπλουτισμός πάνω από 400 φορές, αφού η καλλιέργεια Φάις σε σύγκριση με στην καλλιέργεια ελέγχου (Σχήμα 5Β). Μεταφέραμε αυτά iGB κύτταρα (2 × 10

7) είτε επιλεγμένων είτε μη επιλεγμένων, ή μόνο PBS, σε μη ακτινοβολημένα Β6 ποντίκια που είχαν μεταφερθεί με 2 × 10

5 κύτταρα Β16-mHEL. Τρεις εβδομάδες αργότερα, τα κύτταρα Β16-mHEL διαδόθηκαν σε όλη τους πνεύμονες και σχηματίζονται πολλές συστάδες διαφόρων μεγεθών στα ποντίκια που είχαν λάβει μη επιλεγμένα κύτταρα iGB ή PBS. Αντίθετα, μόνο ένας μικρός αριθμός των όγκων, κυρίως μικρές σε μέγεθος, παρατηρήθηκαν στους πνεύμονες των ποντικών που είχαν λάβει τα επιλεγμένα κύτταρα iGB (Σχήμα 5C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι τα κύτταρα iGB επιλεγεί in vitro με βάση την ειδικότητα σύνδεσης τους Ag είναι ακόμα ικανά να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα πλάσματος in vivo και να αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν το ίδιο Ag.

(Α) Πειραματική στρατηγική. Ένα μίγμα 1:99 των σπληνικών Β κυττάρων από CD45.1

+ ποντίκια Hy10 και CD45.2

+ WT ποντικών υποβλήθηκε στο σύστημα Φάις, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 3Β. Οι επιλεγμένες ή μη επιλεγμένα κύτταρα iGB μετά τη φάση της ανάκαμψης, ή PBS μόνο, εγχύθηκαν σε μη-ακτινοβολημένα C57BL /6 ποντίκια που είχαν μεταφερθεί ί.ν. με κύτταρα Β16-mHEL, όπως περιγράφεται στην Εικόνα 2Β. (Β) Εκπρόσωπος προφίλ κυτταρομετρίας ροής (HEL-δεσμευτική έναντι CD45.1) των κυττάρων iGB μετά τη φάση της αποκατάστασης της «επιλεγμένο» και πρωτόκολλα «μη-επιλεγμένο». Οι αριθμοί σε κάθε παράθυρο δείχνουν το ποσοστό των κυττάρων Hy10 iGB (CD45.1

+, HEL-δεσμευτική? Περίφραξη σε CD19

+ κύτταρα) μεταξύ των συνολικών CD19

+ iGB κύτταρα. (C) Οι φωτογραφίες των πνευμόνων των ποντικών που υπέστησαν αγωγή όπως στο (Α) 3 εβδομάδες μετά την μεταφορά. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των δύο ποντίκια από τα τρία που φαίνεται.

Η

Συζήτηση

Με βάση τα αποτελέσματα χρησιμοποιώντας το μοντέλο ποντικού μας, εδώ έχουμε προτείνει ένα νέο σύστημα της ανοσοθεραπείας του καρκίνου θετή μεταφορά χρησιμοποιώντας Β-λεμφοκύτταρα. Με αυτό το σύστημα, μπορεί κανείς να επεκτείνει αφελής Β κύτταρα να παράγουν ένα μεγάλο αριθμό κυττάρων GC-σαν Β (iGB) και από αυτούς, σπάνια Ag-ειδικά Β κύτταρα μπορούν να επιλεγούν και να επεκταθεί περαιτέρω από το σύστημα Φάις για χρήση στη θεραπεία μεταφοράς . Δείξαμε ότι τα μεταβιβαζόμενα κύτταρα iGB αποικίσει τον μυελό των οστών και παρήγαγε Ab, κυρίως της τάξης IgG 1, για αρκετές εβδομάδες. Χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα, δείξαμε ένα παράδειγμα μιας αποτελεσματικής θεραπείας του καρκίνου. Η μεταφορά των κυττάρων iGB ειδικά για ένα υποκατάστατο όγκου Ag (HEL) κατέστειλε μετάσταση και την ανάπτυξη στους πνεύμονες των κυττάρων μελανώματος που εκφράζουν το ίδιο Ag και παρέτεινε την επιβίωση των ποντικών δεκτών. Εάν αυτό το σύστημα μπορεί να προσαρμοστεί για να συνεργαστεί με ανθρώπινα Β κύτταρα, η θετή μεταφορά των Β-κυττάρων πρέπει να είναι μια πολύ ελκυστική εναλλακτική λύση για MoAb σε ανοσοθεραπεία καρκίνου: αυτό θα απαιτήσει ένα μικρότερο χρονικό διάστημα από τον προσδιορισμό ενός όγκου Ag για την έναρξη της θεραπείας των ασθενών από την παραγωγή εξανθρωπισμένου MoAb, ως εκ τούτου, θα χρησιμεύσει ως μια παραγγελία θεραπεία που θα μπορούσε να στοχεύσει ασθένειες της χαμηλής συχνότητας. Επιπλέον, τα ανθρώπινα κύτταρα που προέρχονται από iGB θα πρέπει να παράγουν πλήρες ανθρώπινο Ab στον δέκτη.

Στην παρούσα μελέτη, απομένει να αποδειχθεί επισήμως πως η μεταφορά των κυττάρων iGB είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της ανάπτυξης μελανώματος στους πνεύμονες . Λαμβάνοντας υπόψη το υψηλό τίτλο του HEL-ειδικό IgG 1 υπέστη τουλάχιστον 4 εβδομάδες μετά την μεταφορά (σχήματα 1 Β και 2Ε) του ορού και η σύνδεση αυτών των IgG1 στα HEL-εκφράζοντα κύτταρα μελανώματος ex vivo (Σχήμα 2F και 2G), η καταστολή του όγκου είναι πιθανό να διαμεσολαβείται από την IgG1 αντι-ΗΕί που παράγονται από τις iGB-κυττάρων που προέρχονται από τα κύτταρα του πλάσματος. Έτσι, οι μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την καταστολή του όγκου μπορεί να είναι ADCC ή /και CDC, οι ίδιοι μηχανισμοί αποδίδονται σε MoAb φαρμάκων in vivo [9], [10]. Από αυτή την άποψη, οι προηγούμενες μελέτες που συγκρίνουν διάφορες ισότυποι των MoAbs το ποντίκι για την κατά του όγκου αποτελέσματα τους in vivo, καθώς και in vitro απέδειξαν ότι IgG1 εμφάνισαν μέτριες επιδράσεις in vivo και in ADCC, αλλά όχι σε CDC, ενώ IgG2a ήταν η πιο αποτελεσματική στις περισσότερες περιπτώσεις, με IgG2b και IgG3 είναι μεταβλητό μεταξύ των εκθέσεων χρησιμοποιώντας διαφορετικά σύνολα MoAbs και κυττάρων-στόχων [21] – [24]. Έτσι, η τάση των Β κυττάρων που προέρχονται από το σύστημα iGB κυτταρικής καλλιέργειας ποντικού μας να στραφούν σχεδόν αποκλειστικά είτε IgG1 ή IgE ισότυποι μπορεί να έχει περιορισμένη η αποτελεσματικότητα της θεραπείας σε μοντέλο ποντικού μας? όλα τα ποντίκια, ακόμη και εκείνους που έλαβαν τα Ag-ειδικά κύτταρα iGB, πέθανε τελικά. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η εν λόγω ποντίκια πέθαναν με τεράστιες μάζες όγκων μελανώματος στην περιτοναϊκή κοιλότητα, αλλά μόνο μερικά μικρά όγκοι βρέθηκαν στους πνεύμονές τους, ακόμη και σε θάνατο (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι η αντικαρκινική δραστικότητα του Ab ισοτύπων δύναται