Αφηρημένο

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστεί η

in vitro

και

δραστικότητα in vivo

αντικαρκινικά και φαρμακολογικές ιδιότητες του 3,4-dimethoxy-

N

-[(2,2-dimethyl-

2H

-chromen-6-yl)methyl]-

N

-phenylbenzenesulfonamide, KCN1. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η

in vitro

δραστικότητα του KCN1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την κατανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος, χρησιμοποιώντας τους προσδιορισμούς ΜΤΤ και BrdUrd, και κυτταρομετρία ροής. Η

in vivo

αντικαρκινικές επιδράσεις του KCN1 αξιολογήθηκαν σε δύο διαφορετικά μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου του παγκρέατος. Έχουμε επίσης αναπτύξει μία μέθοδο HPLC για την ποσοτικοποίηση της ένωσης, και εξετάστηκε η σταθερότητα του σε πλάσμα ποντικού, δεσμευτικές πρωτεΐνες του πλάσματος, και αποδόμηση από ποντίκι S9 μικροσωμικά ένζυμα. Επιπλέον, εξετάσαμε τη φαρμακοκινητική του KCN1 μετά από ενδοφλέβια ή ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε ποντίκια. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, KCN1 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

in vitro

, και έδειξε

in vivo

αντικαρκινική αποτελεσματικότητα σε ποντίκια που φέρουν Panc -1 ή Mia Paca-2 ξενομοσχεύματα όγκου. Η μέθοδος HPLC παρέχεται γραμμική ανίχνευση KCN1 σε όλες τις μήτρες στην περιοχή από 0,1 έως 100 μm, και είχε ένα κατώτερο όριο ανίχνευσης του 0.085 μΜ σε πλάσμα ποντικού. KCN1 ήταν πολύ σταθερό σε πλάσμα ποντικού, εκτενώς πλάσμα δεσμεύεται, και μεταβολίζονται από S9 μικροσωμικά ένζυμα. Οι φαρμακοκινητικές μελέτες έδειξαν ότι KCN1 μπορούσε να ανιχνευτεί σε όλους τους ιστούς που εξετάστηκαν, οι περισσότεροι για τουλάχιστον 24 ώρες. Εν κατακλείδι, προκλινικά δεδομένα μας δείχνουν ότι KCN1 είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για τον καρκίνο του παγκρέατος, παρέχοντας μια βάση για τη μελλοντική ανάπτυξη της

Παράθεση:. Wang W, Ao L, Rayburn ER, Xu Η Ζανγκ Χ, Ζανγκ Χ, et al. (2012) KCN1, μια νέα συνθετική σουλφοναμιδών αντικαρκινικός παράγοντας:

In Vitro

και

In Vivo

Anti-καρκίνο του παγκρέατος Δραστηριότητες και Προκλινικά Φαρμακολογίας. PLoS ONE 7 (9): e44883. doi: 10.1371 /journal.pone.0044883

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Φλεβάρη του 2012? Αποδεκτές: 15 του Αυγούστου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Σεπτεμβρίου 2012 |

Copyright: © Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο υποστηρίχθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης R01 CA116804 (σε EGVM). RZ υποστηρίχθηκε επίσης από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί R01 CA112029 και R01 CA121211. EGVM υποστηρίχθηκε επίσης από EmTechBio, η Επιτροπή Πανεπιστήμιο Ερευνών του Πανεπιστημίου Emory, το Ίδρυμα όγκο στον εγκέφαλο για τα παιδιά, και το V Ίδρυμα για την Έρευνα του Καρκίνου. HW υποστηρίχθηκε από τις Εκατό Ταλέντα Πρόγραμμα, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φύση Επιστήμη (30870513, 31070680, 91029715 και 81025017) και του Υπουργείου Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας (2007CB947100), Εθνικό Επιστήμης και Τεχνολογίας μεγάλο έργο Key Νέο φάρμακο Δημιουργία και Παραγωγή Προγράμματος 2009ZX09102-114, 2009ZX09301-011). MW υποστηρίχθηκε από Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης R01 CA91980. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος εξακολουθεί να αποτελεί μείζον πρόβλημα δημόσιας υγείας σε όλο τον κόσμο. Υπάρχουν αυξανόμενες προ-κλινικά και κλινικά ευρήματα που έχουν βελτιώσαμε την πρόγνωση για τους ασθενείς που διαγιγνώσκονται με καρκίνο, ειδικά καρκίνου του μαστού και του προστάτη. Αντίθετα, υπήρξαν μόνο ελάχιστες βελτιώσεις στην έκβαση για ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Ο καρκίνος του παγκρέατος χαρακτηρίζεται από επεμβατική φύση της, την ικανότητα να αποφύγει επιθετική θεραπεία, και η συχνή όψιμου σταδίου διάγνωση [1]. Το ποσοστό θνησιμότητας για τον καρκίνο του παγκρέατος παραμένει υψηλή, με μέση επιβίωση μόλις & lt? 10 μήνες μετά τη διάγνωση [1] – [4]. Υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων αποτελεσματικών και ασφαλών παράγοντες για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

Έχουμε ενδιαφέρονται για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων του καρκίνου για ανθρώπινους καρκίνους χωρίς ρεύμα αποτελεσματική θεραπεία, όπως όγκου στον εγκέφαλο και τον καρκίνο του παγκρέατος. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του συμπαγών καρκίνων είναι ότι η ταχεία ανάπτυξή τους έχει συχνά ως αποτέλεσμα μειωμένη διαθεσιμότητα οξυγόνου λόγω του σχηματισμού του ανεπαρκούς ή παρεκκλίνουσα αγγειακό σύστημα [5]. Η υποξική κλάσμα στερεών όγκων είναι ανθεκτικό σε ακτινοθεραπεία [6] και συμβατική χημειοθεραπεία [7] – [10], και υποξία συσχετίζεται με φτωχή θεραπευτικό αποτέλεσμα [7], [8], [11], [12]. Σε μοριακό επίπεδο, ο παράγοντας μεταγραφής υποξία επαγώγιμοι παράγοντας-1 (HIF-1) έχει ταυτοποιηθεί ως το βασικό ενορχηστρωτή της βιολογικής απόκρισης στην υποξία λόγω τρανσενεργοποίηση του γονίδια που εμπλέκονται σε πολλές πτυχές της ανάπτυξης κακοήθων όγκων από την κυτταρική επιβίωση και το μεταβολισμό για αγγειογένεση και εισβολή [13] – [16]. Η υπερέκφραση του HIF-1 έχει ως αποτέλεσμα την συστατική ενεργοποίηση των οδών του στόχου [13] – [18]. HIF-1 είναι ένας ετεροδιμερικός παράγοντας μεταγραφής που αποτελείται από δύο υπομονάδες, HIF-1α, η οποία είναι οξυγόνο-ρυθμιζόμενη, και HIF-1β, η οποία εκφράζεται ιδιοσυστατικώς. Αρκετοί αναστολείς που στοχεύουν την έκφραση του HIF-1α ή δραστηριότητές της έχουν σχεδιαστεί για τη θεραπεία των καρκίνων? Ωστόσο, καμία από αυτές τις ενώσεις έχει ακόμη επιτυχής λόγω τοξικότητας της ένωσης, περιορισμένη δραστηριότητα, ή κακή φαρμακολογικές ιδιότητες [18] – [25]. Έχουμε αναπτύξει πρόσφατα μια νέα συνθετική αρύλ σουλφοναμιδίου, που ονομάζεται KCN1 (Εικ. 1Α) που αρχικά νομιζόταν ότι στοχεύουν μονοπάτι HIF-1α. Ωστόσο, σε πρόσφατες μελέτες, KCN1 έχει δειχθεί ότι εξασκούν αντικαρκινικές δραστηριότητες στο πλαίσιο των δύο νορμοξικές και υποξικές συνθήκες σε ανθρώπινο καρκίνο γλοιώματος κυτταρικές γραμμές [26] – [31]. μετέπειτα μηχανιστικές μελέτες μας έχουν δείξει ότι KCN1 έχει σημαντική HIF-1α-ανεξάρτητο κυτταροστατικά δραστηριότητες. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να προσδιοριστεί η

in vitro

και

in vivo

αντικαρκινική δράση των KCN1 στον παγκρεατικό καρκίνο και φαρμακολογικές ιδιότητες.

(Α) Χημική δομή του KCN1. δραστικότητα ανασταλτική (Β) Η κυτταρική ανάπτυξη του KCN1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις KCN1 για 72 ώρες, ακολουθούμενη από μια δοκιμασία ΜΤΤ. ανασταλτική δραστικότητα (Γ) Η κυτταρική ανάπτυξη του KCN1 σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε KCN1 για διαφορετικά χρονικά σημεία, που ακολουθείται από μία δοκιμασία ΜΤΤ. (D) Αναστολή της αγκύρωσης ανάπτυξη ανεξάρτητη από KCN1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις KCN1 σε μαλακό άγαρ. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν στον επωαστήρα για δύο εβδομάδες, στη συνέχεια, αποικίες κυττάρων παρατηρούνται και βαθμολογούνται κάτω από ένα μικροσκόπιο. (Ε) Αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των KCN1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις KCN1 για 24 ώρες, που ακολουθείται από μέτρηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με χρήση του προσδιορισμού BrdUrd. Ο δείκτης πολλαπλασιασμού υπολογίστηκε έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. αποτέλεσμα (F) Η αποπτωτική KCN1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις KCN1 για 48 ώρες, ακολουθούμενη από μέτρηση της απόπτωσης από μία δοκιμασία αννεξίνης V. Η αποπτωτική δείκτης υπολογίστηκε έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (

# p & lt? 0,05, * ρ & lt? 0,01).

Η

Επειδή η διανομή και διάθεση ενός παράγοντα μέσα στο σώμα είναι ζωτικής σημασίας για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας και την τοξικότητά του, στις αρχές φαρμακοκινητικές μελέτες είναι μεγάλη σημασίας για την ανάπτυξη φαρμάκων [32], [33]. Τέτοιες μελέτες μπορούν να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με την πιο αποτελεσματική οδός και η συχνότητα χορήγησης, καθώς επίσης και ένδειξη του πόσο αποτελεσματική είναι η παράγοντα θα είναι κατά των όγκων σε διαφορετικά σημεία μέσα στο σώμα. Μπορούν επίσης να δείχνουν τα δυνατά σημεία της συσσώρευσης του φαρμάκου και /ή τοξικότητα [32], [33]. Στην παρούσα μελέτη, επιχειρήσαμε να χαρακτηριστούν οι φαρμακολογικές ιδιότητες των KCN1 σε προκλινικές περιβάλλον, όσον αφορά την σταθερότητα του πλάσματος της, δεσμευτικές πρωτεΐνες του πλάσματος, τη βιοδιαθεσιμότητα και τη διανομή μετά από συστηματική χορήγηση σε ποντικούς. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν την αποτελεσματικότητα κατά των όγκων και ευνοϊκές φαρμακολογικές ιδιότητες αυτού του νέου μέσου, που υποστηρίζουν την περαιτέρω ανάπτυξή της προς την κατεύθυνση δοκιμές κλινική.

Αποτελέσματα

KCN1 έχει

in vitro

Anti- καρκίνος δραστηριότητα Ενάντια παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Αναστολή της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων.

Ο

in vitro

αντικαρκινική δράση του KCN1 εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τέσσερα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (HPAC, Panc-1, BxPC3, και Mia Paca-2) καλλιεργήθηκαν με την ένωση σε διάφορες συγκεντρώσεις κυμαινόμενες από 0-100 μΜ για 72 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε. Οι ανασταλτικές επιδράσεις της ένωσης επί της ανάπτυξης των κυττάρων που απεικονίζεται στο Σχ. 1Β. KCN1 ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αντιπροσωπεύοντας το 83% (Ρ & lt? 0,01), 53% (Ρ & lt? 0,01), 81% (Ρ & lt? 0,01) και 61% (Ρ & lt? 0,01) αναστολή σε 100 μΜ σε η HPAC, Panc-1, BxPC3, και τα κύτταρα Mia Paca-2, αντίστοιχα. Η κυτταρική γραμμή Panc-1 είναι γνωστό ότι εκφράζουν το πολυφαρμάκου σχετιζόμενες με την αντοχή Protein 1 (MRP1) και είναι γνωστό ότι παρουσιάζουν αντίσταση σε αρκετές καρκινικές θεραπευτικά φάρμακα. Αυτό μπορεί να είναι ο λόγος που ήταν πιο ανθεκτικά στην θεραπεία KCN1 σύγκριση με άλλα κύτταρα. Σύκο. 1C έδειξε την χρονική πορεία της αναστολής της ανάπτυξης με αγωγή KCN1 στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές, γεγονός που υποδηλώνει την αντίστοιχη ευαισθησία στην ένωση ως BxPC3 & gt? HPAC & gt? Mia Paca-2 & gt? Panc-1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1D, HPAC και Panc-1cells αιωρήθηκαν σε μαλακό άγαρ και οι αποικίες απαριθμήθηκαν μετά από 14 ημέρες επώασης KCN1. KCN1 μειώθηκε ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν σε κύτταρα HPAC και Panc-1 με 4- και 3 φορές, αντίστοιχα.

Αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων.

Η δοσοεξαρτώμενη επίδραση του KCN1 επί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων εξετάσθηκε με μία δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdUrd (Εικ. 1 Ε). Τα αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές. Σε συγκέντρωση 50 μΜ, KCN1 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό κατά περίπου 80% (Ρ & lt? 0,01), 56% (Ρ & lt? 0,01), 88% (Ρ & lt? 0,01) και 60% (Ρ & lt? 0,01) στην HPAC, Panc- 1, BxPC3, και τα κύτταρα Mia Paca-2, αντίστοιχα. κύτταρα BxPC3 ήταν πιο ευαίσθητα στη θεραπεία KCN1 στην υψηλότερη συγκέντρωση από ό, τι τις άλλες τρεις κυτταρικές σειρές.

Επιδράσεις επί της απόπτωσης.

Επίσης examinedwhetherKCN1 είχε επίδραση επί της κυτταρικής απόπτωσης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (Σχ . 1F). Μετά από θεραπεία 48 ώρες, KCN1 έδειξαν αμελητέα ή ασθενής αποπτωτικά αποτελέσματα μετά από έκθεση σε μια συγκέντρωση 50 μΜ της ένωσης. KCN1 ήταν σε θέση να διεγείρει απόπτωση μόνο στα κύτταρα HPAC (αποπτωτικό δείκτη: 1,4 φορές). Το φάρμακο δεν έδειξαν ανιχνεύσιμη αποπτωτική δραστικότητα στις άλλες τρεις κυτταρικές γραμμές. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επαγωγή της απόπτωσης μπορεί να μην είναι οι κύριοι μηχανισμοί αντικαρκινικά για KCN1.

σύλληψη του κυτταρικού κύκλου σε φάση G1.

Στα τέσσερα διαφορετικά παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, μετά από 24 ώρες θεραπεία, KCN1 σημαντικά επαγόμενη διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G1 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με αρχικές επιδράσεις που αρχίζει από 5 μΜ σε HPAC (Ρ & lt? 0,01), BxPC3 (Ρ & lt? 0,01), και Mia Paca-2 (Ρ & lt? 0,01 ) κύτταρα, και 12.5 μΜ σε Panc-1 (Ρ & lt? 0,01) κύτταρα (Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επαγωγή της σύλληψης του κυτταρικού κύκλου μπορεί να είναι ένας σημαντικός μηχανισμός κατά του καρκίνου για KCN1.

Η

KCN1 ρυθμίζει την έκφραση των πρωτεϊνών του κυττάρου συνδέονται με τον κύκλο

Ερευνήσαμε τους πιθανούς μηχανισμούς υπεύθυνη για τις αντι-πολλαπλασιαστικές και του κυτταρικού κύκλου ρυθμιστικές επιδράσεις των KCN1 αξιολογώντας τα αποτελέσματά της επί του επιπέδου έκφρασης διαφόρων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (Σχ. 2). Και στις τέσσερις κυτταρικές γραμμές, η θεραπεία με KCN1 (12 ώρες και 24 ώρες) οδήγησε σε διάφορα επίπεδα μειωμένη έκφραση ρυθμιστών κυτταρικού κύκλου E2F1, CDK2, CDK4, CDK6, cdc25C, κυκλίνη D1, και Κυκλίνη Ε Σε αντίθεση, η έκθεση στο KCN1 αύξησε την έκφραση ρ21 και ρ27 σε όλες τις τέσσερις κυτταρικές σειρές. Αυτές οι πρωτεΐνες που εμπλέκονται κατά κύριο λόγο στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και το check-σημείο ελέγχου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν περαιτέρω ότι KCN1 εξασκεί αντικαρκινική δράση της μέσω διακοπή του κυτταρικού κύκλου.

HPAC, Panc-1, Mia Paca-2 και BxPC3 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις της ένωσης για 12 ή 24 h, και στη συνέχεια στοχεύουν πρωτεΐνες που σχετίζονται με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου εξετάστηκαν με κηλίδωση Western.

η

KCN1 αναστέλλει την ανάπτυξη των ξενομοσχεύματος Όγκων

για να προσδιοριστεί αν η ένωση ήταν αποτελεσματική ενάντια

in vivo

όγκους, αξιολογήσαμε την επίδραση κατά των όγκων συστηματική χορήγηση του KCN1 ενάντια στο Panc-1 και Mia Paca-2 μοντέλα ξενομοσχεύματος υποδόρια σε

ηυ /ηυ

ποντικούς. Συστημική ενδοπεριτοναϊκή (ε.π.) κατεργασία με KCN1 (30 ή 60 mg /kg σε ένα 1:01 cremophor: σκευάσματος αιθανόλη? 5 ημέρες /εβδομάδα) άρχισε μόλις ο όγκος του όγκου έφθασε -100 mm

3

. Η ένωση μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη των παγκρεατικών ξενομοσχεύματος όγκων σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Στο μοντέλο ξενομοσχεύματος Panc-1, η ανάπτυξη του όγκου αναστολή περίπου 46% (Ρ & lt? 0,01) παρατηρήθηκε στη δόση των 30 mg /kg και του 61% (Ρ & lt? 0,01) σε δόση 60 mg /kg την Ημέρα 21 (Σχ . 3Α1). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν στο μοντέλο ξενομοσχεύματος Mia Paca-2. Το μοντέλο αυτό φαίνεται να είναι σχεδόν εξίσου ευαίσθητων στο φάρμακο, με τη χαμηλή δόση (30 mg /kg) και υψηλή δόση (60 mg /kg) μείωση της ανάπτυξης του όγκου κατά περίπου 43% (Ρ & lt? 0,01) και 57% (Ρ & lt? 0,01 ), αντίστοιχα (Εικ. 3Β1). Επιπλέον, δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στα βάρη σώματος μεταξύ των ελέγχων και των ζώων που έλαβαν θεραπεία με KCN1 και στα δύο μοντέλα ξενομοσχεύματος (Σχ. 3Α2 και Β2), υποδεικνύοντας καθόλου προφανής τοξικότητα ξενιστή σε θεραπευτικές δόσεις KCN1.

KCN1 χορηγήθηκε από ip ένεση σε γυμνούς ποντικούς που φέρουν Panc-1 (Α1) ή Mia Paca-2 (Β1) ξενομοσχεύματος όγκους. KCN1 χορηγήθηκε με ί.ρ. ένεση σε δόσεις των 30 και 60 mg /kg /d, 5 ημέρες /εβδομάδα για 3 εβδομάδες για Panc-1 μοντέλο ξενομοσχεύματος και 6 εβδομάδες για την Mia μοντέλο ξενομοσχεύματος Paca-2, αντίστοιχα. Οι ομάδες ελέγχου έλαβαν μόνο όχημα. όγκοι Οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε τρεις ημέρες. Τα ζώα παρακολουθήθηκαν επίσης για αλλαγές στο σωματικό βάρος ως υποκατάστατος δείκτης για την τοξικότητα όταν χορηγήθηκε σε γυμνούς ποντικούς που φέρουν (Α2) Panc-1 ή (Β2) Mia Paca-2 όγκους ξενομοσχεύματος.

Η

Ένα HPLC μέθοδος για ΚΟΝ-1 Η ανάλυση αναπτυχθεί και επικυρωθεί

Η μέθοδος HPLC έδωσε μια γραμμική καμπύλη βαθμονόμησης στο πλάσμα του ποντικιού για την περιοχή ερευνήθηκε συγκέντρωση των 0.1-100 μΜ. Ο συντελεστής συσχέτισης μέση (

r

2) για την καθημερινή καμπύλες βαθμονόμησης ήταν = 1.000. Καμπύλες βαθμονόμησης έχουν επίσης παραχθεί σε ομογενοποιήματα διάφορους ιστούς ποντικού, συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου, των σκελετικών μυών, των νεφρών, πνεύμονες, σπλήνα, και η καρδιά, η οποία είχε συντελεστές συσχέτισης τουλάχιστον 0.992 για τις ίδιες συγκεντρώσεις. Η ακρίβεια, ακρίβεια, εντός της ημέρας και μεταξύ των ημερών παραλλαγές ήταν αποδεκτές, με συντελεστές μεταβλητότητας (CV) μεταξύ 4,25% και 12,62%, και το κατώτερο όριο ανίχνευσης (LOD) στο πλάσμα ήταν 0,085 μΜ. Η ανάκτηση της ένωσης σε διάφορα μήτρες κυμαινόταν από -96% έως -107%. Αντιπροσωπευτικά χρωματογραφήματα του τυφλού πλάσματος ποντικού, πλάσμα ποντικού ελέγχου εμβολιάζεται με 1, 5, 25, και 50 μΜ KCN1 φαίνονται στα Σχ. 4Α-Ε. Παρόμοια χρωματογραφήματα ελήφθησαν για τους άλλους ιστούς που εξετάστηκαν (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Η ιδιαιτερότητα αυτή καταδεικνύεται από την απουσία οποιασδήποτε ενδογενούς παρέμβαση στα βιολογικά δείγματα στο χρόνο κατακράτησης των κορυφών των KCN1.

(Α) KCN1 τον έλεγχο (χωρίς φάρμακο) στο πλάσμα του ποντικιού και πλάσματος ποντικού εμπλουτίστηκε ώστε να περιέχει 1, 5, 25, και 50 μΜ KCN1? Ένα τυφλό δείγμα πλάσματος ποντικιού και πλάσμα ποντικού δείγμα εμπλουτίστηκε με 1 μΜ (Β), 5 μΜ (C), 25 μΜ (D), και 50 μΜ (Ε) KCN1.

Η

KCN1 είναι σταθερό σε Mouse Plasma σε διάφορες θερμοκρασίες για εκτεταμένες διάρκειες

KCN1 ήταν σταθερό σε πλάσμα ποντικού σε 37 ° C, με περισσότερο από το 80% της ένωσης που απομένει μετά από επώαση 8 ωρών τόσο για την χαμηλή (1 μΜ) και υψηλή ( 10 μΜ) συγκεντρώσεις. Βρήκαμε επίσης ότι KCN1 μπορούν να αποθηκευτούν στους 4 ° C για τουλάχιστον 24 ώρες με περισσότερο από το 90% της ένωσης που απομένει (Εικ. 5Α1), ή στους 37 ° C για τουλάχιστον 8 ώρες με περισσότερο από το 85% της ένωσης απομένουν (Εικ. 5A2), ή στους -80 ° C για έως και 4 εβδομάδες με περισσότερο από το 92% της ένωσης που απομένει (Εικ. 5A3).

Σταθερότητα της KCN1 σε πλάσμα ποντικού σε 37 ° C ( Α1), 4 ° C (Α2), και -80 ° C (Α3). (Β) Υποβάθμιση των KCN1 από απομονωμένα κλάσματα ήπατος S9 ποντίκι.

Η

KCN1 συνδέεται με τις πρωτεϊνες του πλάσματος Εκτενώς

KCN1 δεσμεύεται εκτεταμένα με τις πρωτεΐνες στο πλάσμα του ποντικιού, με τη χαμηλή (1,0 μΜ) και υψηλή (10,0 μΜ) συγκεντρώσεις επιδεικνύοντας 90,96% και το 99,32% της δέσμευσης με τις πρωτεΐνες του πλάσματος ένωση, αντίστοιχα.

ΚΟΝ-1 μεταβολίζεται από S9 ένζυμα (Φάση Ι)

Επειδή KCN1 εμφανίστηκε να μεταβολίζονται ή να αποικοδομούνται στο πλάσμα ποντικού εκτενώς, πραγματοποιήσαμε μια προκαταρκτική μελέτη του δυναμικού μηχανισμού (-ών) με την οποία KCN1 μεταβολίζεται χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία S9. Αυτή η δοκιμασία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να καθοριστεί αν η ένωση μεταβολίζεται

μέσω

φάσης Ι (συστήματα NADPH-αναγέννησης) ή ένζυμα που προέρχονται από μικροσώματα ποντικού φάσης ΙΙ (UDPGA και Δημόσιας Διοίκησης και Προσωπικού). Οι μελέτες έδειξαν ότι S9 KCN1 έχει σχετικά μεγάλο χρόνο ημιζωής στην παρουσία της φάσης ενζύμων II (σύζευξη) μικροσωματικής. Ωστόσο, υπήρξε μία μείωση άνω του 60% της ποσότητας του KCN1 παρατηρήθηκε όταν επωάστηκε με φάση Ι ποντικού (οξείδωση) ένζυμα (Σχ. 5Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι πιθανό μεταβολίζεται από τη φάση Ι ένζυμο (-α).

KCN1 έχει μεγάλο χρόνο ημιζωής και ευρεία κατανομή ιστών σε ποντικούς μετά από ενδοφλέβια και ενδοπεριτοναϊκή διοικήσεων

Ανάλυση των δειγμάτων πλάσματος που συλλέχθηκαν από ποντικούς δοσολογήθηκε με KCN1 (35 mg /kg) έδειξαν ότι οι συγκεντρώσεις του το πλάσμα ένωση ήταν ακόμη ανιχνεύσιμη για τα δύο στελέχη τουλάχιστον 6 ώρες μετά από ενδοφλέβια (IV) ενέσεις, και ήταν ανιχνεύσιμα για ακόμα 24 ώρες μετά από ενδοπεριτοναϊκή (ΙΡ) χορήγηση (Σχ. 6Α και 6Β). Μετά Ι.ν. bolus χορήγηση, οι συγκεντρώσεις στο πλάσμα ήταν μεγαλύτερη από 5 μg /mL στα 5 λεπτά και για τις δύο CD-1 (9.98 μg /mL) και γυμνά ποντίκια (5,19 μg /mL). Αυτά τα επίπεδα μειώθηκαν σε & lt? 0,3 μg /mL σε 6 ώρες μετά τη χορήγηση και στα δύο στελέχη. Μετά από ενδοπεριτοναϊκή δοσολογία, τα επίπεδα στο πλάσμα φθάσει στο μέγιστο τους στα 30 λεπτά σε CD-1 ποντίκια και σε 2 ώρες σε γυμνούς ποντικούς. Συνολικά, Ε.Ι. διοίκηση έδωσε υψηλότερη AUC πλάσματος και C

max τιμές, αλλά χαμηλότερες Τ

1/2 τιμές σε σύγκριση με το I.P. οδό χορήγησης (Πίνακας 2).

καμπύλες συγκέντρωσης πλάσματος-χρόνου για KCN1 εξής (Α) IV και (Β) ΙΡ ένεση 35 mg /kg σε CD-1 και nude (ηυ /ηυ) ποντικούς. Χρονικά εξαρτώμενη κατανομή των KCN1 σε διάφορους ιστούς μετά από (C) IV χορήγηση ή (D) χορήγηση ΙΡ 35 mg /kg της ένωσης. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν γυμνούς ποντικούς, ενώ οι πυραμίδες αντιπροσωπεύουν CD-1 ποντίκια.

Η

Ενδιαφέρον, KCN1 μπορούσε να ανιχνευθεί στην πλειονότητα των ιστών του δείγματος (καρδιά, πνεύμονες, ήπαρ, σπλήνα, νεφρά , και σκελετικό μυ? Εικ. 6C και 6D) των δύο στελεχών για τουλάχιστον 24 ώρες μετά τη χορήγηση από οποιαδήποτε οδό. Ωστόσο, η ένωση δεν μπορούσε να ανιχνευθεί μετά από 6 ώρες στον εγκέφαλο είτε στέλεχος ποντικών ακόλουθα είτε οδό χορήγησης. Οι φαρμακοκινητικές παράμετροι υπολογίστηκαν για το πλάσμα και στους διάφορους ιστούς (Πίνακας 2). Οι υψηλότερες τιμές AUC και σε γυμνά και CD 1 ποντίκια μετά από ε.φ. ένεση ήταν στους πνεύμονες, το ήπαρ και τη σπλήνα, και οι ιστοί με τις χαμηλότερες τιμές AUC μετά από ί.ν. ένεση ήταν το πλάσμα, τον εγκέφαλο και τους σκελετικούς μύες. Η υψηλή συγκέντρωση που παρατηρήθηκε στους πνεύμονες μετά από ί.ν. ένεση ήταν πιθανόν να οφείλεται σε συσσώρευση του καταβυθισμένου φαρμάκου, αν και αυτό δεν επαληθεύτηκε πειραματικά. Σε αμφότερα τα στελέχη ποντικών, η σπλήνα είχε την υψηλότερη AUC έπειτα από ί.ρ. ένεση, ακολουθούμενη από το ήπαρ. Το πλάσμα και τον εγκέφαλο είχαν τις χαμηλότερες τιμές AUC για αμφότερα τα στελέχη εξής Ι.Ρ. ένεση.

Από το 35 mg /kg του KCN1 χορηγούνται ενδοφλεβίως, λιγότερο από το 1% της συνολικής δόσης KCN1 ανακτήθηκε ως γονικό KCN1 από τα ούρα τόσο του CD-1 και γυμνούς ποντικούς κατά τη διάρκεια των πρώτων 24 ωρών , με λιγότερο από 0,5% να ανακτηθεί από αμφότερα τα στελέχη εξής IP ένεση. Περίπου 1% της αρχικής δόσης της γονικής ένωσης ανακτήθηκε στα κόπρανα των ποντικών έπειτα από ί.ρ. ένεση, και λιγότερο από 1% ανακτήθηκε μετά από ί.ν. ένεση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Συζήτηση

αναστολείς HIF οδού αντιπροσωπεύουν μια νέα στοχευμένη θεραπευτικό μέσο. Παρά το γεγονός ότι η επιτυχία έχει παρατηρηθεί με τη χρήση παραγόντων που στοχεύουν μεμονωμένα μόρια (π.χ. Herceptin, Gleevec), αυτοί οι παράγοντες τυπικά περιορίζονται σε σχέση με τους τύπους καρκίνου, και σε υπο-τάξεις εντός των τύπων καρκίνου, που μπορεί να αντιμετωπιστεί. Επειδή KCN1 αναστέλλει μία φυσιολογική διαδικασία (υποξία) που είναι σύμφυτη με το σχηματισμό όγκων, παρά ένα στόχο ειδικού τύπου καρκίνου, ο παράγοντας μπορεί δυνητικά να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία μιας ποικιλίας διαφορετικών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων για τα οποία δεν υπάρχει επί του παρόντος καμία αποτελεσματική θεραπείες, ο καρκίνος του παγκρέατος ιδιαίτερα.

Η ένωση τεστ KCN1 είχε αρχικά σχεδιαστεί ως ένα HIF-1α-αναστολέα, αλλά ανασταλτικές επιδράσεις της στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την ανάπτυξη μας οδήγησε να σκεφτεί αν θα μπορούσε να έχει ένα αποτέλεσμα σύμφωνα με ορθοξικές κατάσταση. HIF-1α παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Υπό συνθήκες υποξίας, γίνεται σταθεροποιήσει την ηγετική της για την επιβίωση του όγκου

μέσω

αυξημένη αγγειογένεση και αναερόβια γλυκόλυση. Παραδόξως, HIF-1α επίσης ρυθμίζει προς τα γονίδια που προάγουν διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, όπως ρ21, ρ27, ρ53 [34], [35]. Με βάση τα ανωτέρω, τα οφέλη της HIF-1α αναστολή στη θεραπεία του καρκίνου φαίνεται αμφισβητήσιμη διότι μπορεί να αναιρέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου κάτω από συνθήκες υποξίας και την πρόληψη του κυτταρικού θανάτου. Αυτά τα αντικρουόμενα αποτελέσματα μπορούν να περιορίσουν την αντικαρκινική επίδραση του HIF-1α αναστολείς [34], [35]. Ωστόσο, εάν οι αναστολείς HIF-1α έχουν το πρόσθετο αποτέλεσμα να επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή κυτταρικό θάνατο, θα μπορούσαν να είναι καλύτερα προτάσεις ως αντι-καρκινικοί παράγοντες. Έτσι, είναι επιτακτική ανάγκη παράλληλα με την ανάπτυξη αναστολέων της HIF-1α ως αντι-καρκινικοί παράγοντες για να αξιολογήσει τις επιπτώσεις τους επί του κυτταρικού θανάτου του κυτταρικού κύκλου και.

Η παρούσα μελέτη είναι η πρώτη που διερευνά συστηματικά το

in vitro

και

in vivo

κατά του όγκου αποτελέσματα των KCN1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σε ένα HIF-1α-ανεξάρτητο τρόπο. Παρατηρήσαμε ότι KCN1 μειώθηκε σημαντικά παγκρέατος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό, και οδήγησε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου κάτω ορθοξικές (20% O

2) συνθήκες καλλιέργειας. Μετά την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της ένωσης στο

in vitro

πολλαπλασιασμό, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι διακοπή του κυτταρικού κύκλου ήταν ο κύριος μηχανισμός με τον οποίο η ένωση εξασκεί κυτταροστατικά αποτελέσματά του σε κυτταρική καλλιέργεια. διακοπή του κυτταρικού κύκλου είναι μία από τις πιο αποτελεσματικές στρατηγικές για την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου [36]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι KCN1 μεσολάβηση αναστολή του κυτταρικού κύκλου επιτεύχθηκε

μέσω

μια διαφοροποίηση του αναστολέα κυκλίνης κινάσης (ΟΚΙ) – cyclin- κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση (CDK) τα μηχανήματα που λειτουργούν στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Μια οικογένεια των συμπλοκών πρωτεΐνης κινάσης ενορχηστρώνει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε ευκαρυωτικά κύτταρα [37]. Κάθε συγκρότημα αποτελείται ελάχιστα από μία καταλυτική υπομονάδα, την cdk, και ουσιαστικό εταίρο ενεργοποίησης της κυκλίνης. Διάφοροι συνδυασμοί κυκλινών και cdks ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο σε διάφορα σημεία [37]. Για παράδειγμα, Κυκλίνη Ε εκφράζεται παροδικά κατά τη διάρκεια της G1 /S μετάβαση και αποικοδομείται ταχέως άπαξ το κύτταρο εισέρχεται φάσης S [38]. Κυκλίνης Ε ρυθμίζει Cdk2 ενώ η κυκλίνη D1 ρυθμίζει Cdk4 και CDK6 [38]. Αυτά τα σύμπλοκα ενεργοποιούνται σε διάφορα σημεία ελέγχου μετά συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, αλλά μπορεί επίσης να προκληθεί και ρυθμίζεται από εξωγενείς παράγοντες [37] – [39]. Οι cdks υποβάλλονται σε αναστολή από την πρόσδεση του CKI, όπως το CIP KIP (p21, ρ27) και ΙΝΚ4 οικογένειες /πρωτεϊνών [37] – [39]. Η μεταγραφή των γονιδίων που απαιτούνται για την G1 /S μετάβαση όπως κυκλίνης Ε και Κυκλίνη D1 αρχίζει με E2F1, η οποία είναι υπό τον έλεγχο του καταστολέα όγκου Rb [37] – [39]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την επίδραση της KCN1 στην έκφραση αρκετών πρωτεϊνών είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες. Και στις τέσσερις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, βρήκαμε μειωμένη έκφραση του κυττάρου cycleproteins, συμπεριλαμβανομένων E2F1, κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, CDK2, CDK4 και CDK6, και αυξημένη έκφραση του ρ21 και ρ27. Ενώ KCN1 επαγόμενη διακοπή κύκλου κυττάρου σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, θα είχε μικρή κυτταροστατική επίδραση επί κυττάρων γλοιώματος και αθανατοποιημένων ινοβλαστών, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα αποτελέσματά της θα μπορούσε να είναι κυτταρικό τύπο-εξαρτώμενη [31]. Για να επιβεβαιώσετε τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα της ένωσης, που ερευνήθηκε επίσης για

in vivo

αποτελέσματα. KCN1 μείωσε την ανάπτυξη και των δύο Panc-1 και Mia Paca-2 όγκους ξενομοσχεύματος.

Επειδή δεν υπάρχουν δημοσιευμένες εκθέσεις σχετικά με τη φαρμακοκινητική, η τοξικότητα ή η βιοδιαθεσιμότητα της KCN1, πραγματοποιήσαμε μια αξιολόγηση αυτών των φαρμακολογικών ιδιοτήτων. Έχουμε αναπτύξει μια κατάλληλη μέθοδο HPLC για την ανίχνευση της KCN1 σε διάφορες βιολογικές μήτρες, και απέδειξε ότι KCN1 είναι σταθερό σε πλάσμα ποντικού (Σχ. 5Α1-Α3), ότι δεσμεύεται εκτεταμένα με τις πρωτεΐνες του πλάσματος, ότι είναι πιθανό μεταβολίζεται από τη φάση Ι ένζυμο (α) (Εικ. 5Β), και ότι διανέμεται σε διάφορους ιστούς ποντικού μετά τόσο IV και I.P. χορήγηση (Σχ. 6 και Πίνακας 2). αρχικές μελέτες φαρμακολογίας μας έφερε στο φως πολλά ενδιαφέροντα χαρακτηριστικά για KCN1. Πρώτον, υπήρχε εκτεταμένη συσσώρευση της ένωσης στους πνεύμονες των ποντικών μετά από ί.ν. ένεση, και στο σπλήνα και το ήπαρ ποντικών μετά από Ι.Ρ. ένεση. Οι μελλοντικές μελέτες για να καθορίσει τους μηχανισμούς για το μοναδικό πρότυπο κατανομής αυτού του φαρμάκου. Είναι χορηγήθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε μία δόση μέχρι 60 mg /kg ημερησίως σε μία cremophor: σκευάσματος αιθανόλης για έως 12 εβδομάδες, και αυτό το σχήμα ήταν καλά ανεκτή από τα ζώα. Δεν υπήρχαν εμφανή σημάδια τοξικότητας σε αυτά τα ζώα, και τη συμπεριφορά και την εμφάνισή τους ήταν δυσδιάκριτες από ζώα ελέγχου. προκαταρκτικές αναλύσεις μας έδειξαν ότι οι τιμές των πληθυσμών αιμοσφαιρίων και χημεία του αίματος ήταν εντός των κανονικών ορίων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, παθολογική εξέταση από τα κύρια όργανα κατά τη νεκροψία δεν έδειξε υπερ-δομικές αλλαγές στον εγκέφαλο, τα νεφρά, ΓΕ οδού ή των πνευμόνων (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ήπαρ είναι το μόνο όργανο όπου παρατηρήθηκε αλλαγή σχετίζονται με τη θεραπεία. Οίδημα παρατηρήθηκε στο συκώτι των ζώων κατά τη νεκροψία, οίδημα των ιστών με χοληδόχου πόρου στάση υποδείχθηκε με παθολογική εξέταση, αλλά χωρίς καμία απόδειξη ηπατοκυττάρων θάνατο. Η παρατηρούμενη διόγκωση του ήπατος αντιστράφηκε στα ποντίκια μέσα σε 2-3 εβδομάδες μετά τη διακοπή της θεραπείας, και μπορεί να έχει προκληθεί από το cremophor:. Διατύπωση αιθανόλη, η οποία μπορεί να επηρεάσει την ηπατική ροή αίματος [40] – [42]

Το δεύτερο σημείο ενδιαφέροντος είναι ότι υπήρχαν διαφορές στη φαρμακοκινητική της KCN1 μεταξύ CD-1 και γυμνούς ποντικούς. Ενώ ορισμένες από αυτές τις διαφορές μπορεί να οφείλεται στις συνήθεις διακυμάνσεις μεταξύ ποντικών, οι διαφορές στην εποχή του έτους (περιόδου), όταν έγιναν οι μελέτες και οι διαφορές οφείλονται στην πηγή των ποντικών (Harlan vs. Frederick), ορισμένα από τα διαφορές μεταξύ των στελεχών των ποντικών ήταν ακόμη αξίζει να σημειωθεί. Για παράδειγμα, τα ποντίκια CD-1 έδειξε μια πολύ υψηλότερη συγκέντρωση στους πνεύμονες από ό, τι τα γυμνά ποντίκια, παρόλο που έλαβαν την ίδια δόση. Ωστόσο, στις περισσότερες περιπτώσεις, η γυμνά ποντίκια εμφάνισαν μια υψηλότερη πρόσληψη του παράγοντα στους διάφορους ιστούς που εξετάστηκαν (ήπαρ, νεφρά, σπλήνα, καρδιά, σκελετικό μυ, και εγκέφαλο). Υπήρχαν επίσης διαφορές στην ενδοπεριτοναϊκή βιοδιαθεσιμότητα KCN1, με την ένωση να απορροφάται πολύ καλύτερα μετά από ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε γυμνούς ποντικούς σε σύγκριση με ποντικούς CD-1. Αυτή η αυξημένη βιοδιαθεσιμότητα πιθανό ήταν υπεύθυνη για την υψηλότερη πρόσληψη ιστού. Εάν τα παρόμοια αποτελέσματα που βρέθηκαν σε επανειλημμένες μελέτες, θα είναι απαραίτητο να διευκρινιστεί ο μηχανισμός (ες) που υπόκεινται σε αυτές τις διαφορές στην πρόσληψη, προκειμένου να καθοριστεί αν τέτοιοι παράγοντες είναι πιθανό να επηρεάσουν τις φαρμακοκινητικές ιδιότητες της KCN1 σε άλλα είδη, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων. Επιπλέον, ενώ οι ποντικοί CD-1 που χρησιμοποιείται συχνά για την αξιολόγηση της φαρμακοκινητικής των νέων ενώσεων, άτριχων ποντικών είναι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενη στέλεχος ποντικού για μελέτες αποτελεσματικότητας αντι-καρκίνου. Διαφορές στη φαρμακοκινητική μεταξύ των στελεχών μπορεί να οδηγήσει σε υπερ- ή υπο-εκτίμηση της αποτελεσματικότητας ή τοξικότητας μιας ένωσης.

Θα σημειωθεί επίσης ότι KCN1 υφίσταται προφανώς εντεροηπατική επανακυκλοφορία. Δεν ήταν μόνο η ένωση εξακολουθεί να υπάρχει σε πολλούς ιστούς, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις ήταν υψηλότερη σε 24 ώρες από ό, τι στους 4 ή 6 ώρες (π.χ. ήπαρ και σπλήνα). Επιπλέον, KCN1 ήταν ακόμη ανιχνεύσιμη σε χαμηλά επίπεδα για τουλάχιστον πέντε ημέρες μετά την ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι μπορεί να είναι δυνατόν να δώσει KCN1 σχετικά σπάνια, αφού η ένωση μπορεί να παραμείνει στον ιστό στόχο για αρκετές ημέρες. Ωστόσο, θα είναι απαραίτητο να διασφαλιστεί ότι η ένωση δεν ασκεί τοξικές επιδράσεις στο ήπαρ, χοληδόχος κύστη ή σε άλλους ιστούς που εκτίθενται σε υψηλή συγκέντρωση της ένωσης για παρατεταμένες χρονικές περιόδους.

Εκτός από τις αλλαγές στη συχνότητα της δοσολογίας για τις μελέτες αποτελεσματικότητας, αλλάζοντας το σκεύασμα μπορεί επίσης να βελτιώσει την δραστικότητα της ένωσης. Αν και η ένωση ήταν αποτελεσματική όταν χορηγήθηκε Ι.Ρ. σε cremophor: αιθανόλη, η σύνθεση δεν είναι ιδανική. Το πιο σημαντικό, ενώ η ίδια KCN1 δεν φάνηκε να ασκεί οποιαδήποτε σημαντική τοξικότητα, το όχημα οδήγησε σε συκώτι πρήξιμο μετά από αρκετές εβδομάδες χορήγησης στα ζώα ελέγχου. Έτσι, η αλλαγή της συνθέσεως θα μπορούσαν να μειώσουν την τοξικότητα της ένωσης, και είναι πιθανό ότι η βελτιστοποίηση της συνθέσεως και τη χορήγηση της ένωσης, θα ενισχύσει επίσης αντικαρκινικές επιδράσεις του.

Περιληπτικά, έχουμε δείξει ότι μπορούμε KCN1 ασκούν ισχυρή κυτταροτοξικότητα και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων επιδράσεις αναστολής προς καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, και οδήγησε σε ρύθμιση προς τα κάτω των σημαντικών ογκογόνο και pro-ανάπτυξη /pro-πολλαπλασιασμού πρωτεΐνες. Έχουμε παρουσιάσει μια έγκυρη μέθοδο για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση KCN1 σε διάφορες μήτρες. Επίσης παρουσιάσαμε αρχικά φαρμακοκινητικά δεδομένα για την ένωση, που δείχνει ότι είναι καλά κατανεμημένη, σταθερό, και ανιχνεύσιμη σε διάφορους ιστούς για μια σχετικά μεγάλη χρονική περίοδο. Οι πληροφορίες που παράγονται σε αυτή τη μελέτη θα είναι χρήσιμο για την περαιτέρω ανάπτυξη της ένωσης.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και Αντιδραστήρια

KCN1 συντέθηκε και καθαρίστηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [ ,,,0],29], [43] – [44], και η δομή επιβεβαιώθηκε με UV, IR, MS, και φασματοσκοπία NMR. Η καθαρότητα της ένωσης προσδιορίσθηκε ότι είναι μεγαλύτερη από 99%.

Όλα τα χημικά και οι διαλύτες που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση προετοιμασία των δειγμάτων και υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) ήταν αναλυτικής ποιότητας. Μεθανόλη (καθαρότητας HPLC) αγοράστηκε από την Fisher Chemicals (Fairlawn, NJ) και τριαιθυλαμίνη αγοράσθηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ).