Αφηρημένο

Παρά το γεγονός ότι απαραίτητη βιταμίνη, φυλλικό οξύ έχει ενοχοποιηθεί για την ενίσχυση της ανάπτυξης του όγκου, όπως αποδεικνύεται από τις εκθέσεις σχετικά με υπερέκφραση του υποδοχέα φολικού άλφα (FRα) σε καρκινώματα. Ο ρόλος του άλλου φυλλικό οξύ μεταφορέα, μεταφορέα ανηγμένου φολικού (RFC), είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Αυτή η μελέτη ερεύνησε τους ρόλους του φυλλικού οξέος, FRα και RFC σε καρκίνους των ωοθηκών. Δείξαμε FRα mRNA και πρωτεΐνης υπερέκφραση και μειωμένη έκφραση RFC σε συνδυασμό με ενίσχυση γονιδίου FRα και υπερμεθυλίωση RFC υποκινητή, αντίστοιχα. FRα υπερέκφραση συνδέθηκε με την εξέλιξη του όγκου ενώ η έκφραση RFC πραγματοποιήθηκαν ευνοϊκή κλινική έκβαση. Τέτοια πρότυπο αμοιβαία έκφραση παρατηρήθηκε επίσης σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών. Φυλλικό οξύ δείχθηκε να προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου, τη μετανάστευση και εισβολή

in vitro

, και ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση Ε-καδερίνης. Αυτή η επίδραση έχει αποκλειστεί μετά είτε σταθερά νοκ ντάουν της FRα ή έκτοπη υπερέκφραση του RFC. Αυτό μέχρι τώρα λαθραία φαινόμενο δείχνει ότι, RFC μπορεί να χρησιμεύσει ως μια εξισορρόπηση εταίρος της FRα και παρέχουν μια προστατευτική επίδραση σε ασθενείς με υψηλή καρκινώματα των ωοθηκών FRα εκφράζουν, όπως αποδεικνύεται από την παρατεταμένη συνολική και ελεύθερη νόσου επιβίωση τους. Εν κατακλείδι, έκθεση σχετικά με την παράδοξη επίδραση της FRα (υποθετικό ογκογόνο) και RFC (υποθετική κατασταλτική του όγκου) σε ανθρώπινες κακοήθειες. FRα και RFC μπορεί ενδεχομένως να διερευνηθούν ως θεραπευτικό στόχο ή προγνωστικός δείκτης, αντίστοιχα. Σας συνιστούμε προσοχή και πρόσθετη έρευνα σχετικά με τα συμπληρώματα φυλλικού οξέος σε ασθενείς με καρκίνο

Παράθεση:. Siu MKY, Κονγκ DSH, Chan ΗΥ, Wong ΕΣΥ, Ip ΔΕΗ, Jiang L, et al. (2012) Παράδοξη επίδραση δύο Φυλλικό οξύ υποδοχείς, FRα και RFC, στον καρκίνο των ωοθηκών: επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εισβολή και την κλινική έκβαση. PLoS ONE 7 (11): e47201. doi: 10.1371 /journal.pone.0047201

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 1 του Ιούνη 2012? Αποδεκτές: 10 Σεπ 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Siu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τη χρηματοδότηση από το αμερικανικό Ινστιτούτο για τον Καρκίνο Βραβείο Έρευνας Μεταδιδακτορική και το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ Seed χρηματοδότησης, και της Διάσκεψης και Έρευνας Grant από το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ωοθηκών καρκινώματα αντιπροσωπεύουν την υψηλότερη θνησιμότητα μεταξύ όλων των γυναικολογικών καρκίνων στον κόσμο [1], [2]. Ενώ η συχνότητα εμφάνισης των ωοθηκών καρκινώματα ποικίλλει μεταξύ των διαφόρων εθνοτικών ομάδων, τη συχνότητά του στις χώρες της Ασίας βρίσκεται σε ανοδική τάση [3], [4]. Οι λόγοι γι ‘αυτό παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες ή αμφιλεγόμενη. Αρκετοί παράγοντες κινδύνου του τρόπου ζωής έχουν εμπλακεί. Αυτές περιλαμβάνουν τη διατροφή, την παχυσαρκία, τη γονιμότητα και καταστάσεις ισοτιμίας. Από την άλλη πλευρά, έχει έγινε μια γενική πεποίθηση ότι η υψηλή πρόσληψη μικροθρεπτικών, όπως φυλλικό οξύ, βιταμίνη C, βιταμίνη Ε μπορεί να προστατεύσει από καρκίνους [5]. Ως εκ τούτου, η καλύτερη κατανόηση των επιπτώσεων των διατροφικών στοιχείων για καρκινογένεση είναι σημαντικό να βελτιωθούν οι στρατηγικές για την πρόληψη και τη διαχείριση του καρκίνου.

Το φολικό οξύ είναι μια υδατοδιαλυτή βιταμίνη Β βρέθηκαν στα περισσότερα λαχανικά. Μια υψηλή διαιτητική πρόσληψη φυλλικού οξέος έχει αναφερθεί να συνδέσει με χαμηλότερο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνων των ωοθηκών, ιδίως εκείνες που καταναλώνουν αλκοόλ [6], [7], [8], [9]. Είναι στενά συνδεδεμένη με τη λειτουργία της για τη σύνθεση του DNA και τη συμμετοχή της στη σχετική μεθειονίνη μεταβολική οδό απαραίτητη για μεθυλίωση ΟΝΑ. Ως εκ τούτου, φολικού οξέος ανεπάρκεια θα οδηγεί σε υπομεθυλίωση του DNA, αλλοιωμένη γονιδιακή έκφραση και την λανθασμένη ενσωμάτωση της ουρακίλης στο DNA, οδηγώντας σε βλάβη χρωμόσωμα, όλα εκ των οποίων, είναι βασικοί παράγοντες για την καρκινογένεση [10], [11]. Φαίνεται ότι το φυλλικό οξύ είναι μια σημαντική βιταμίνη απαραίτητη φυσιολογική λειτουργία των κυττάρων, και για την πρόληψη της έναρξης του καρκίνου. Ωστόσο, υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις να δείχνουν ότι το φυλλικό οξύ μπορεί στην πραγματικότητα να ενισχύσει την εξέλιξη του καρκίνου σε καθιερωμένες καρκινώματα του παχέος εντέρου και του ορθού, του μαστού και του προστάτη [12], [13], [14].

Το φυλλικό οξύ πρόσληψη περιλαμβάνει διάφορα μεταφορείς , όπως υποδοχείς φολικού, και ο φορέας ανηγμένου φολικού (RFC) [15], [16]. άλφα υποδοχέα φυλλικού οξέος (FRα), μια ενιαία αλυσίδα γλυκοζυλο-αγκυροβολημένα πρωτεΐνη μεμβράνης, ενισχύει την πρόσληψη φυλλικού οξέος μέσω ενδοκυττάρωσης. υπερέκφραση του έχει αναφερθεί σε καρκίνους των ωοθηκών, υπονοώντας ότι μπορεί να προωθεί την ανάπτυξη του όγκου [17], [18], [19], [20]. RFC είναι ένα εκφράζεται παντού μεταφορέα για τα φυσικά φολικά και κλασική αντιφολικά, και μπορεί να ελέγξει την πρόσληψη φολικού σε μια αμφίδρομη τρόπο [16]. Απώλεια RFC με επακόλουθη συνέπειες της ανεπάρκειας φυλλικού οξέος βρέθηκε να προωθήσει εξέλιξης του καρκίνου σε καρκίνο του παχέος εντέρου [16], [21]. Επομένως, θα ήταν λογικό να υποθέσουμε ότι οι δύο αυτές φολικού μεταφορείς, FRα και RFC, ασκούν διαφορετικές επιπτώσεις στην εξέλιξη του καρκίνου.

Αν και έχει καθιερωθεί υπερέκφραση FRα σε καρκίνους των ωοθηκών, η κατάσταση έκφρασης και λειτουργικούς ρόλους του RFC παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε την έκφραση, γενετικών και επιγενετικών προφίλ των FRα και RFC στο φυσιολογικό επιθήλιο των ωοθηκών και του καρκίνου των ωοθηκών, και συσχετίστηκε με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. λειτουργικούς ρόλους τους και τις πιθανές κατάντη στόχοι στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή σε σχέση με το φυλλικό οξύ στον καρκίνο των ωοθηκών αξιολογήθηκαν επίσης. Εμείς προσπαθήσαμε να κατανοήσουμε καλύτερα τους ρόλους του φυλλικού οξέος και μεταφορέων της στην ωοθηκική καρκινογένεση, και να διερευνήσει τις πιθανές επιπτώσεις της πρόσληψης φυλλικού οξέος σε ασθενείς με καρκίνο.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα και κυτταρικές σειρές

εκατόν πενήντα τριών φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα των όγκων των ωοθηκών, συμπεριλαμβανομένων 11 κύστεις ένταξη /καλοήθη cystadenomas (22-63 ετών? μέση ηλικία, 50 ετών), 19 οριακά όγκους (20~46 χρόνια? μέση ηλικία , 30 ετών), 83 καρκινώματα (34 έως 83 ετών? μέσος όρος 51 χρόνια) των διαφόρων ιστολογικών υποτύπων και 44 αντίστοιχες μεταστατικές εστίες (Πίνακας 1), συλλέχθηκαν από το Τμήμα Παθολογίας, Νοσοκομείο Queen Mary, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση και 67 ασθενείς με καρκίνους των ωοθηκών υπέστησαν επίσης αγωγή με χημειοθεραπεία συμπεριλαμβανομένης της πλατίνας /paclitaxel. Η περίοδος παρακολούθησης κυμαινόταν από πέντε έως 209 μηνών (μέση τιμή 63 μήνες). Τριάντα τρία τυχαία επιλεγμένα κλινικά δείγματα όγκων ωοθηκών και αντίστοιχο φυσιολογικό αντίστοιχά τους, συμπεριλαμβανομένων των σαλπίγγων και /ή ετερόπλευρο ωοθήκες, με διαθέσιμα κατεψυγμένων όγκων ήταν επίσης ανακτηθεί. Ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η χρήση αυτών των κλινικών δειγμάτων εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ /Νοσοκομείο Αρχής του Χονγκ Κονγκ West Cluster (HKU /ΗΑ HKW IRB) (αριθμός Institutional Review Board: UW10-129) . Αιματοξυλίνη ηωσίνη τομές των κατεψυγμένων μπλοκ του κάθε δείγματος επανεξετάστηκαν από δυο μας (ANYC και PPCI) για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση και να διασφαλίσει ότι περισσότερο από το 80% καρκινικών κυττάρων ήταν παρόντες στα μπλοκ του όγκου.

Η

Δύο απαθανάτισε επιθηλιακών κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, ΣΩΛΗΝΑ 6-3 και ο εύκαμπτος σωλήνας 17-1, και εννέα κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, SKOV-3, OVCAR-3, OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626 (ATCC? Manassas, VA). καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], [23]

πραγματικού χρόνου PCR (qPCR)

Ολικό RNA από κατεψυγμένα κλινικά δείγματα και καρκινικές κυτταρικές σειρές ήταν εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen). Γονιδιωματικό DNA μόλυνση απομακρύνθηκε με κατεργασία με ϋΝάση Ι αγωγή (Invitrogen). 2.5 μg ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα με αντίστροφης μεταγραφάσης SuperScript (Invitrogen, San Diego, CA). Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας φαινόλη /χλωροφόρμιο (Invitrogen). qPCR διεξήχθη με ΑΒΙ Prism σύστημα ανίχνευσης ακολουθίας 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA), όπως περιγράφεται [22], [23], [24]. Primer αλληλουχίες για την αξιολόγηση της έκφρασης του mRNA του FRα, RFC και GAPDH (ως εσωτερικός έλεγχος) ήταν ως ακολούθως: FRα αίσθηση, 5′- AAGTGCGCAGTGGGAGCT -3 ‘, και αντινόημα, 5′-CATTGCACAGAACAGTGGGTG -3′? RFC νόημα, 5’-CGAAACCTCGGCTTCGGAGC -3 ‘, και αντίθετης φοράς, 5′-GCACGTAGTAGACCACCAGG -3′? GAPDH έννοια, 5’- TCCATGACAACTTTGGTATCGTG -3 ‘, και αντινόημα, 5′-ACAGTCTTCTGGGTGGCAGTG -3’. Το PCR καθαρότητα επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής. Primer αλληλουχίες (αίσθηση, 5′- GTATGCATGGCTTCCTGCAGG -3 ‘, και αντινόημα, 5′-ACTTGTTAAACCCTGTAGAGAGG -3’) για την αξιολόγηση FRα αριθμού αντιγράφων γονιδίου σχεδιάστηκαν επί τη βάσει της γονιδιωματικής αλληλουχίας του ιντρονίου 3 και 4 του ιντρονίου FRα (Ensemble βάση δεδομένων). TRAT1 χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς [25]. Ωοθηκών δείγματα καρκίνου που έχουν ≥ διπλάσια αύξηση από αντίστοιχο φυσιολογικό αντίστοιχά τους θεωρήθηκαν ως θετικά για ενίσχυση γονιδίου FRα.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με ρυθμιστικό λύσης (0,125 Μ Tris, ρΗ 6,8 σε 22 ° C που περιέχει 1% ΝΡ-40 (ν /ν), 2 mM EDTA, 2 mM Ν-αιθυλμηλεϊμιδίου, 2 mM PMSF, 1 mM ορθοβαναδικό νάτριο και 0.1 μΜ okadate νάτριο], και καθαρίστηκε με φυγοκέντρηση στους 4 ° C. Protein συγκέντρωση προσδιορίστηκε από την DC (απορρυπαντικό συμβατό) δοκιμασία πρωτεΐνης (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 20 μg πρωτεΐνης αναλύθηκε με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου, και υβριδοποιήθηκε με αντισώματα ειδικά προς FRα (1:1000.? Αλέξης Βιοχημικές, San Diego, CA? ALX-804-439), RFC (1:1000? Affinity Bioreagents? Χρυσή, CO? PA1-9553), E-cadherin (1:5000? BD Biosciences? Palo Alto, CA? 610,182 ) και ακτίνη (1:1000? Sigma, St. Louis, ΜΟ?. A5060) και κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) Τα στυπώματα αναπτύχθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL) Plus σύστημα ανίχνευσης (Amersham, Arlington Heights, Ηνωμένο Βασίλειο), και οπτικοποιούνται με φιλμ ακτίνων-Χ (Γαληνός Ιατρική Ομάδα, Chattanooga, TN) [22], [23], [24].

Η ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημική χρώση ήταν εκτελέστηκε όπως περιγράφεται στις προηγούμενες εκθέσεις [22], [23], [24]. Για FRα ανοσοϊστοχημεία, τομές παραφίνης υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αντίσωμα κατσίκας αντι-υποδοχέα φολικού συζευγμένο με υπεροξειδάση ραδικιού (1:200? Abcam? Cambridge, ΜΑ? Ab20572). Δεδομένου ότι το αντίσωμα αντι-FRα από Alexis Biochemical χρησιμοποιούνται για ανοσοκηλίδωση απέτυχαν να έχουν ικανοποιητικό αποτέλεσμα στην ανοσοκηλιδώσεως με χρησιμοποίηση τομές παραφίνης, χρησιμοποιήθηκε μια άλλη αντισώματος από Abcam. Παρά το γεγονός ότι αυτό το αντίσωμα μπορεί να αναγνωρίσει άλλες ισομορφές του FR, οι βήτα και φάσματος, ισομορφές του FR είχαν αναφερθεί ότι εκφράζεται κυρίως σε πλακούντα και αιμοποιητικά κύτταρα αλλά όχι σε άλλους ιστούς [26], [27]. Αυτό το αντίσωμα μπορεί επομένως να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση FRα ανοσοαντιδραστικότητα σε καρκίνους των ωοθηκών. Για RFC ανοσοϊστοχημεία, αντίσωμα-RFC αντι κοτόπουλου (1:200? Affinity Bioreagents) εφαρμόστηκε, ακολουθούμενο από IgG αντι-κοτόπουλου βιοτίνης-κουνελιού (Η + L). υπεροξείδιο 3-διαμινοβενζιδίνη-υδρογόνο χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο. ανάκτηση αντιγόνου μικροκυμάτων χρησιμοποιώντας κιτρικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 6,0) διεξήχθη. Η παράλειψη ή υποκατάσταση του πρωτεύοντος αντισώματος με προάνοσο ορό IgG χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Ένταση στο χρωματισμένο επιθηλιακά κύτταρα βαθμολογήθηκε ως 0 (αρνητική), 1 (αχνό), 2 (μέτρια) και 3 (ισχυρή). Το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται βαθμολογήθηκε ως 0 (& lt? 5%), 1 (5% -25%), 2 (26% -50%), 3 (51% -75%) και 4 (& gt? 75%) . Η ανοσοαντιδραστικότητα εκτιμήθηκε από τον πολλαπλασιασμό του ένταση χρώσης με το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται για να δώσει ένα σύνθετο ένα σύνθετο «Histoscore» [22], [23]. Υψηλά και τα χαμηλά επίπεδα FRα και RFC ορίστηκαν από «HistoScores» κόψει σε μέση.

απομεθυλίωση θεραπεία

SKOV-3 και OVCA420 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 0, 5 ή 10 μΜ 5- Aza-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dc, ένας αναστολέας μεθυλίωσης DNA) για 72 ώρες [28]. Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε αγωγή με ίσο όγκο διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO). Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα. Η δραστηριότητα μεταγραφή του RFC προσδιορίστηκε με qPCR.

παρασκευή DNA, την κατεργασία όξινου θειώδους και μεθυλίωσης-ειδική PCR (MSP) ανάλυση

Γονιδιωματικό DNA από κατεψυγμένα κλινικά δείγματα εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας φαινόλη /χλωροφόρμιο. Κατεργασία όξινου θειώδους διεξήχθη όπως περιγράφεται [28]. Εκκινητές ειδικά για την μεθυλιωμένο (έννοια, 5′- TTCGTCGTAGTTTGCGAATG -3 ‘, και αντινόημα, 5′-CAACACGTACCTAAACGCGA -3′) και μη μεθυλιωμένη (αίσθηση, 5’- TTTGTTGTAGTTTGTGAATGG -3 ‘, και αντινόημα, 5′-ACAACACATACCTAAACACAA -3’ ) RFC υποστηρικτής Α έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [29]. Η θερμοκρασία ανόπτησης ήταν 52 ° C και 56 ° C για μεθυλιωμένο και μη-μεθυλιωμένων υποκινητή Α αντίστοιχα. προϊόντα MSP ανιχνεύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2% με χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο. Κανονική DNA λεμφοκυττάρων μεθυλιώθηκε με SSSL μεθυλοτρανσφεράσης χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Τα ανεπεξέργαστα γονιδιωματικό DNA και νερό κενά χωρίς DNA χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι.

Σταθερό knockdown του FRα, έκτοπη υπερέκφραση RFC και φυλλικό οξύ θεραπεία σε SKOV-3

SKOV-3, ένα καρκινικό κύτταρο ωοθηκών σύμφωνα με σχετικά υψηλή FRα και χαμηλή έκφραση RFC, χρησιμοποιήθηκε. Για σταθερή knockdown FRα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με ένα σύνολο shRNA κατασκευασμάτων κατά της ανθρώπινης FRα, PRS-sh FRα (ΟηΟεηε, Rockville, MD), που επιλέγεται με πουρομυκίνη (1,5 μg /ml) [22], [23], [24] . Ο φορέας pRS χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρες. Για παροδική υπερεκφράζουν RFC, pcDNA3-RFC πλασμίδιο (ευγενώς από Prof L Matherly, Michigan Ίδρυμα Καρκίνου) και του φορέα άδειο pcDNA3 (έλεγχος) μετασκευάστηκε σε έλεγχο SKOV-3 κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) [22], [23] , [24]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Μέσο 199 (Invitrogen) /MCDB 105 (Sigma) μέσο που περιέχει 22,7 ηΜ φολικό οξύ και συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS) [22], [23]. κύτταρα shFRα και RFC κύτταρα που υπερεκφράζουν (2 ημέρες μετά την επιμόλυνση) υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με φολικό-ελεύθερο RPMI 1640 (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% διαλυμένο FBS που περιέχει 0.6 ηΜ φολικό οξύ (Invitrogen) για 2 ημέρες, trysinized, μετρήθηκαν, επιστρώθηκαν για λειτουργικές δοκιμασίες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές δόσεις του φολικού οξέος, ενός συνθετικού φολικού, συμπεριλαμβανομένου του 0, 6, 12 και 60 ηΜ. Οι συγκεντρώσεις φολικού οξέος που χρησιμοποιείται βασίζεται στο φυσιολογικό εύρος στο πλάσμα, η οποία κυμαίνεται από & lt? 7 nM σε άτομα με αρνητικό ισοζύγιο φυλλικό οξύ σε & gt? 50 nM σε άτομα με & gt? 400 μg /d του φυλλικού οξέος κατανάλωσης [30], η οποία είναι η εκτιμώμενη πρόσληψη φυλλικού οξέος από τους μη χρήστες συμπλήρωμα στη Βόρεια Αμερική [13]. Η συγκέντρωση φολικού οξέος που επιλέγεται ανεπάρκεια (12 ηΜ) βασίστηκε στην παρατήρηση ότι η εν λόγω συγκέντρωση είναι η χαμηλότερη απαίτηση για την ανάπτυξη των κυττάρων [31]. Η πρωτεΐνη εκχυλίζεται 2 ημέρες μετά τη θεραπεία.

ΜΤΤ (3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο) δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με ΜΤΤ δοκιμασία (Sigma) όπως περιγράφεται [22], [24]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων με 2000 κύτταρα /φρεάτιο. Σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία, 10 μΐ ΜΤΤ προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες, ακολουθούμενο από την προσθήκη 100 μΐ DMSO σε κάθε φρεάτιο για την εκχύλιση βαφή. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης των δειγμάτων στα 570 nm με 630 nm ως μήκος κύματος αναφοράς.

In vitro

μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες

In vitro

δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολής διεξήχθησαν όπως περιγράφεται [22], [23], [24]. 1,25 × 10

5 κύτταρα απλώθηκαν στην άνω πλευρά ενός Transwell ένθετο και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν μέσω μιας μεμβράνης με μέγεθος πόρων 8-μm (δοκιμασίες μετανάστευση) ή εισβάλλουν μέσω Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη (δοκιμασίες εισβολή). Τα κύτταρα στην άνω πλευρά της μεμβράνης απομακρύνθηκαν και τα μετεγκατεστημένα ή εισέβαλαν κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός σε 5 τυχαία πεδία μετά από 24 ώρες ή 48 ώρες, αντίστοιχα.

Στατιστική ανάλυση

η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS 15.0 για Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). Mann-Whitney test χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση μεταξύ δύο ομάδων ενώ δοκιμή rank Kruskal-Wallis χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση μεταξύ πολλαπλών ομάδων. ανάλυση επιβίωσης πραγματοποιήθηκε με ανάλυση Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank. ανάλυση παλινδρόμησης Cox χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση πολλαπλών μεταβλητών επιβίωση.

P

τιμές & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση του FRα συνδέθηκε με την εξέλιξη του όγκου των ωοθηκών

Με qPCR, σημαντικά υψηλότερο FRα mRNA βρέθηκε σε δείγματα καρκίνου όταν συγκρίνονται με τις αντίστοιχες ομολόγους μη-όγκου μετά από κανονικοποίηση με ΟΑΡϋΗ (

P

= 0,015) (Σχήμα 1Α). Με ανοσοϊστοχημεία, ισχυρή ανοσολογική FRα παρατηρήθηκε σε καρκίνους των ωοθηκών, σε αντίθεση με μέτρια χρώση FRα σε οριακές όγκους και αδύναμα ή απουσία χρώσης σε καλοήθεις cystadenomas /κύστεις ένταξη (Σχήμα 1C). Πράγματι, σημαντικά υψηλότερα ανοσοαντιδραστικότητα FRα ανιχνεύθηκε σε καρκίνους των ωοθηκών και οριακά όγκους σε σχέση με καλοήθη cystadenomas /κύστεις ένταξη (όλα

P

& lt? 0,05, Πίνακας 1). Σε επίπεδο κυτταρικές σειρές, έξι από τα εννέα κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών έδειξε επίσης ρύθμιση προς τα πάνω του FRα mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης με SKOV-3, OVCAR-3 και SW626 παρουσιάζει έντονη έκφραση, ενώ OVCA 420, Dov13 και TOV21G έδειξαν ασθενή έκφραση, σε σύγκριση με δύο φυσιολογικό επιθήλιο κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, στις οποίες κανένα mRNA FRα και έκφραση πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε (Εικόνα 1Β).

(Α) qPCR ανάλυση FRα mRNA σε όγκους των ωοθηκών και τα αντίστοιχα των ομολόγων μη-όγκου. (Β) mRNA (άνω φωτογραφία) και πρωτεΐνες (κάτω πίνακας) έκφραση FRα σε δύο απαθανάτισε ωοθηκών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών, ΣΩΛΗΝΑ 6-3 και ο εύκαμπτος σωλήνας-17-1, και εννέα κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, OVCAR-3, SKOV-3 , OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626, όπως αξιολογείται με qPCR και ανοσοστύπωση αντίστοιχα. (Γ) Ανοσοαντιδραστικότητα FRα σε ορώδες (α) και βλεννώδες (ε) καλοήθη cystadenomas ωοθηκών, ορώδες (β) και βλεννώδες (στ) οριακά όγκους των ωοθηκών και ορώδες (γ), βλεννώδες (g), διαυγές κυττάρων (δ) και ενδομητριοειδές (h) ωοθηκικών καρκινωμάτων. Κλίμακα bar = 100 μm. (Δ) κατά Kaplan-Meier συνολικά (αριστερό πάνελ) και οι καμπύλες επιβίωσης για τους ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών με υψηλά και χαμηλά επίπεδα FRα (αποκοπεί στην μέση) ελεύθερο νόσου (δεξιά πλευρά).

Η

Σε κλινικές δείγματα, υψηλή έκφραση mRNA FRα και ανοσοαντιδραστικότητα βρέθηκαν να σχετίζονται σημαντικά με προχωρημένα στάδια της νόσου και η κακή ιστολογική βαθμολογία, παράγοντες που σχετίζονται με την επιθετικότητα του όγκου (πίνακες 1 και 2). Ωστόσο, καμία σημαντική διαφορά από FRα ανοσοαντιδραστικότητος βρέθηκε μεταξύ των χημειοευαίσθητων και στη χημειοθεραπεία περιπτώσεις (Πίνακας 1). Kaplan-Meier επιβίωσης αναλύσεις επίσης δεν αποκάλυψε συσχέτιση μεταξύ υψηλή έκφραση FRα και τη συνολική ή ελεύθερη νόσου επιβίωση (Σχήμα 1D).

Η

RFC ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε καρκίνους των ωοθηκών και συσχετίστηκε με καλή πρόγνωση ασθενείς

σε αντίθεση με FRα, δείγματα καρκίνου των ωοθηκών εμφανίζεται σημαντικά χαμηλότερη RFC mRNA όταν συγκρίνονται με τις αντίστοιχες ομολόγους μη-όγκου όπως αξιολογήθηκε από qPCR (

P

= 0,001) (Σχήμα 2Α). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε επίσης ισχυρή ανοσοαντιδραστικότητα RFC σε κύστεις συμπερίληψης /καλοήθων cystadenomas και ασθενής έκφραση σε καρκίνους των ωοθηκών (Σχήμα 2C). Έξι από τα εννέα κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών εμφανίζεται επίσης ρύθμιση προς τα κάτω του RFC mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης σε σύγκριση με δύο φυσιολογικό επιθήλιο κυτταρικές γραμμές ωοθηκών (Σχήμα 2Β).

ανάλυση (Α) qPCR του RFC mRNA σε όγκους των ωοθηκών και τα αντίστοιχα των ομολόγων μη-όγκου. (Β) mRNA (άνω φωτογραφία) και πρωτεΐνες (κάτω πίνακας) έκφραση του RFC σε δύο απαθανάτισε ωοθηκών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών, ΣΩΛΗΝΑ 6-3 και ο εύκαμπτος σωλήνας-17-1, και εννέα κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, SKOV-3, OVCAR-3 , OVCA 420, OVCA433, OC316, Dov13, ES-2, TOV21G, SW626, όπως αξιολογείται με qPCR και ανοσοστύπωση αντίστοιχα. (Γ) Ανοσοαντιδραστικότητα RFCin κύστη ένταξης (α) και ορώδες καρκίνωμα ωοθηκών (β). Κλίμακα bar = 100 μm. (Δ) κατά Kaplan-Meier συνολικά (αριστερό πάνελ) και οι καμπύλες επιβίωσης για τους ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών με υψηλά και χαμηλά επίπεδα RFC (αποκοπεί στην μέση) ελεύθερη νόσου (δεξιά πλευρά). (Ε) Kaplan-Meier συνολικά (αριστερό πάνελ) και οι καμπύλες επιβίωσης για υψηλή FRα ελεύθερη νόσου (δεξιά πλευρά) εξέφρασε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών με υψηλά και χαμηλά επίπεδα RFC (αποκοπεί στην μέση).

Η

RFC mRNA και ανοσοδραστικότητα δεν συσχετίζονται με στάδια της νόσου, ιστολογικές και ιστολογικές βαθμού υποτύπους (πίνακες 1 και 2). Είναι ενδιαφέρον, υπήρχε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ χαμηλής έκφρασης των RFC, και μικρότερη συνολική (

P

= 0,034) και ελεύθερη νόσου (

P

= 0,011) επιβίωσης (Σχήμα 2D). Επιπλέον, μεταξύ των ωοθηκών καρκίνοι με υψηλή FRα έκφραση, η συνολική (

P

= 0,007) και ελεύθερη νόσου (

P

= 0,008), η επιβίωση ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε άτομα με υψηλή έκφραση RFC (Σχήμα 2Ε).

FRα ενίσχυση γονιδίου και μεθυλίωση υποστηρικτής RFC συνέβαλαν στην απορυθμισμένη γονιδιακή έκφραση σε καρκίνους των ωοθηκών

με qPCR, 11 από τα 33 (33,3%) δείγματα καρκίνου που εμφανίζεται γονίδιο FRα (FOLR1, χρωμόσωμα 11q13.3) ενίσχυση σε σύγκριση με τις αντίστοιχες ομολόγους μη-όγκου. Όλα τα ενισχυμένα περιπτώσεις έδειξαν έκφραση αυξημένα mRNA. FRα ενίσχυση συσχετίστηκε με την έκφραση του mRNA της (

P

& lt? 0,001, ακριβής δοκιμή Fisher) (Πίνακας 3)

Η

Από την άλλη πλευρά, μειωμένη έκφραση του RFC σε καρκίνους των ωοθηκών. σχετιζόταν με υπερμεθυλίωση. Μετά την επεξεργασία του SKOV-3 και OVCA420 τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών από την 5-αζα-dc, έναν αναστολέα μεθυλίωσης DNA, δύο φορές και 2,5-φορές αύξηση της έκφρασης του γονιδίου RFC ανιχνεύθηκε αντιστοίχως (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, υπερμεθυλίωση προαγωγού του γονιδίου RFC (χρωμόσωμα 21q22.2) βρέθηκε σε 14 από 33 (42,4%) δείγματα καρκίνου των ωοθηκών από MSP. Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα MSP δείχθηκαν στο Σχήμα 3Β. Αντίθετα, μόνο 3 από 33 (9%) των δειγμάτων μη-όγκου έδειξε υπερμεθυλίωση. Μη μεθυλιωμένων αλληλίων ανιχνεύθηκαν σε όλα τα δείγματα όγκου και μη όγκου. Υποστηρικτής υπερμεθυλίωση RFC σημαντικά αντιστρόφως ανάλογη με την έκφραση του mRNA της (

P

= 0,005, ακριβής δοκιμασία του Fisher) (Πίνακας 3). Με MSP, ανιχνεύσαμε επίσης υπερμεθυλίωση προαγωγού RFC σε πέντε κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών SKOV-3, OVCA 420, OVCA433, TOV21G και SW626 (σχήμα 3Β), όλοι τους έδειξαν τα κάτω ρυθμισμένα RFC mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης (Σχήμα 2Β). Σε αντίθεση, δεν μεθυλιωμένα αλλήλια ανιχνεύθηκαν (Σχήμα 3Β) στην κανονική γραμμή ΣΩΛΗΝΑ επιθήλιο των κυττάρων των ωοθηκών 6-3 και δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου OVCAR-3 και OC316, το οποίο εμφανίζεται RFC mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης (Σχήμα 2Β),

(Α) Η σχετική έκφραση του mRNA του RFC σε SKOV-3 και OVCA 420 μετά από αγωγή 5-αζα-dc με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις για 72 ώρες. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν. Μπαρ, μέσα φορές μεταβολής ± SD. *,

P

& lt? 0,05. (Β) Εκπρόσωπος των ωοθηκών (CA) (άνω τμήμα) και κυτταρικές σειρές των ωοθηκών (κάτω τμήμα) της MSP για την κατάσταση RFC μεθυλίωσης. Μ, δείκτης DNA? Ρ, θετικός έλεγχος? Ν, αρνητικός έλεγχος? Μ, μετουσιωμένες αλληλόμορφα? U, μη μεθυλιωμένων αλληλίων.

Η

εξόντωση FRα μεταβληθεί πολλαπλασιασμού των κυττάρων φολικού μεσολάβηση σε SKOV-3 κύτταρα

Μετά την επιβεβαίωση της ειδικής knockdown του FRα mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε SKOV-3 κύτταρα (Σχήμα 4Α), προσδιορίσαμε πρώτα τις επιδράσεις της FRα στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων φολικού μεσολάβηση με δοκιμασία ΜΤΤ. Τις ημέρες 2 και 4, δεν παρατηρήθηκε σημαντική μεταβολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων βρέθηκε σε έλεγχο και shFRα SKOV-3 κύτταρα μετά την επεξεργασία φολικού. Μέχρι την ημέρα 6, τα κύτταρα ελέγχου παρουσίασαν πολλαπλασιασμό σε 12 και 60 ηΜ θεραπεία φολικού. Την Ημέρα 8, 6, 12 και 60 ηΜ κύτταρα ελέγχου φολικού αγωγή έδειξαν κάνει εξαρτώμενη πολλαπλασιασμό. Σε αντίθεση, knockdown του FRα μπλοκαριστεί φολικού μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 4Β).

(Α) Σταθερό knockdown του FRα mRNA και πρωτεΐνης σε SKOV-3, όπως ανιχνεύεται με qPCR (αριστερό πάνελ) και ανοσοκηλίδωση (δεξί πάνελ ) αντιστοίχως. **

P

& lt? 0.005. ρυθμό πολλαπλασιασμού (Β) Cell ελέγχου και shFRα κύτταρα SKOV-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 6, 12 και 60 ηΜ φολικού στις 2, 4, 6 και 8 ημέρες, που έδειξαν ως φορές μεταβολής σε σχέση με τον έλεγχο χωρίς θεραπεία φολικού (0 ηΜ). n = 3? *,

P

& lt? 0,05. (C)

In vitro

μετανάστευση (αριστερό πάνελ) και προσδιορισμούς εισβολής (δεξί πάνελ) στον έλεγχο και shFRα κύτταρα SKOV-3 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 0, 12 και 60 ηΜ φολικού χρησιμοποιώντας μεμβράνη Transwell χωρίς ή με επίστρωση Matrigel αντίστοιχα. Άνω πάνελ: αντιπροσωπευτικό εικόνες από τη μετανάστευση ή την εισβολή SKOV-3 κύτταρα. Κάτω πάνελ: Η μετανάστευση των κυττάρων ή εισβολή από SKOV-3 παρουσιάζονται ως ποσοστό του μάρτυρα που έλαβαν θεραπεία με 0 ηΜ φυλλικό οξύ? n = 3? *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0.005. (D) Ανοσοκηλίδωση για FRα και Ε-καδερίνης, χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης πρωτεΐνης που παρασκευάζονται από τον έλεγχο και την shFRα SKOV-3 (αριστερό πάνελ). Σχετικό επίπεδο πρωτεΐνης E-cadherin όπως αναλύεται από λογισμικό ImageJ (US National Institutes of Health)? n = 3? *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt?. 0.005 (δεξιά πλευρά)

Η

Φυλλικό οξύ μέσω FRα που προκαλείται SKOV-3 κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή και κάτω-ρυθμιζόμενη E-cadherin

στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση του φυλλικού οξέος και FRα επί SKOV-3 κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Με βάση τα αποτελέσματα του φολικού οξέος στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, 12 και 60 δόσεις ηΜ επιλέχθηκαν για τη θεραπεία ελέγχου και shFRα κύτταρα SKOV-3. Transwell μετανάστευση και προσδιορισμούς εισβολής έδειξαν ότι 12 και 60 ηΜ φολικού επάγεται σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή σε κύτταρα ελέγχου, ενώ knockdown του FRα μπλοκαριστεί φολικού μεσολάβηση μετανάστευση κυττάρων και εισβολή (Σχήμα 4C). Στη συνέχεια προσδιορίζεται η πιθανή κατάντη στόχο για τη μεσολάβηση φυλλικού οξέος επίδραση στην κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή. Η έκφραση της Ε-καδερίνης, ένα σημαντικό μόριο προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου απαραίτητη για τη ρύθμιση κυτταρική κινητικότητα, βρέθηκε να μειωθεί το κάνει-εξαρτώμενο μετά φολικού αγωγή (Εικόνα 4D). Τέτοια προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης μετά τη θεραπεία φολικού επίσης καταργήθηκε μετά knockdown του FRα.

έκτοπη υπερέκφραση του RFC σε υψηλή FRα εκφράζουν SKOV-3 παρεμπόδισαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων φολικού μεσολάβηση, τη μετανάστευση και την εισβολή και να αποκατασταθεί Ε -cadherin έκφραση

Έχουμε αποδείξει υπερέκφραση FRα και μειωμένη έκφραση του RFC σε καρκίνους των ωοθηκών, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να ασκήσει απέναντι ρόλους στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών. Το πιο σημαντικό, σε ασθενείς με υψηλή FRα, τη συνολική και την ελεύθερη νόσου επιβίωση ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε άτομα με υψηλή έκφραση RFC, εμπλέκοντας τον προστατευτικό ρόλο των RFC σε υψηλή καρκίνους FRα. Για να διαλευκανθεί τέτοιο προστατευτικό ρόλο,

in vitro

λειτουργικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν σε FRα-θετικών κυττάρων SKOV-3 με εκτοπικά εκφραζόμενη RFC μετά φολικού θεραπεία. RFC βρέθηκε να εξουδετερώσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων φολικού μεσολάβηση (Σχήμα 5Α), τη μετανάστευση και εισβολή (Σχήμα 5Β). Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης σε κύτταρα μετά από κατεργασία φολικού επίσης καταργήθηκε μετά υπερεκφράζουν RFC (Σχήμα 5C).

(Α) Cell ρυθμό πολλαπλασιασμού του SKOV-3 κύτταρα με εκτοπικά εκφραζόμενη RFC ή φορέα ελέγχου ( ελέγχου) που έλαβαν θεραπεία με 60 nM φυλλικό οξύ μετά από 5 μέρες εμφανίζεται ως φορές μεταβολή σε σύγκριση με τον έλεγχο χωρίς αγωγή φυλλικού οξέος (0 nM)? n = 3? *,

P

& lt? 0,05. (Β)

In vitro

μετανάστευση (αριστερό πάνελ) και προσδιορισμούς εισβολής (δεξί πάνελ) σε SKOV-3 κύτταρα με εκτοπικά εκφραζόμενη RFC ή φορέα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με 0 και 60 ηΜ φολικού εμφανίζεται ως ποσοστό ελέγχου σε επεξεργασία με 0 nM φυλλικό οξύ? n = 3? *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0.005. (C) Ανοσοκηλίδωση των RFC και Ε-καδερίνης, χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης πρωτεΐνης που παρασκευάζονται από SKOV-3 κύτταρα με εκτοπικά εκφραζόμενη RFC ή φορέα ελέγχου (αριστερό πάνελ). Σχετικό επίπεδο πρωτεΐνης E-cadherin όπως αναλύεται από λογισμικό ImageJ (US National Institutes of Health)? n = 3? **

P

& lt?. 0.005 (δεξιά πλευρά)

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε την προοδευτική αύξηση της FRα mRNA και την έκφραση της πρωτεΐνης από μη καρκινικούς ιστούς, καλοήθεις και οριακά όγκους να καρκινώματα. Επιπλέον, ενίσχυση γονιδίου FRα ως πιθανός μηχανισμός υπερέκφρασης του αποδείχθηκε επίσης για πρώτη φορά σε καρκίνους των ωοθηκών. Η υπερέκφραση του FRα σε καρκίνους των ωοθηκών [19], [20], καθώς και σε καρκίνους του νεφρού, του πνεύμονα και του μαστού έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [32]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι μια υψηλή έκφραση FRα συσχετίζεται με κακή ιστολογική βαθμού και προχωρημένα στάδια της νόσου, γεγονός που υποδηλώνει ρόλους στην πρόοδο του όγκου των ωοθηκών.

Σε αντίθεση με FRα, χαμηλότερη mRNA RFC και η έκφραση πρωτεΐνης σε καρκίνους των ωοθηκών ήταν βρέθηκε κατά τη σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς ή καλοήθεις όγκους. RFC εκφράζεται παντού σε φυσιολογικό ιστό και είναι η κύρια σύστημα φολικού μεταφοράς για τη μεταφορά φυσικού φολικά, όπως 5-μεθυλ ή 5-φορμυλ τετραϋδροφολικού (THF), και αντιφολικά όπως μεθοτρεξάτη (ΜΤΧ) και πεμετρεξίδη [16]. 5-μεθυλ THF είναι ένα απαραίτητο συμπαράγοντα για μεθυλίωσης του DNA τα οποία κανονικά οδηγεί στην καταστολή των ογκογονιδίων [33]. Έτσι, η απώλεια του RFC έχει περιγραφεί να συμβάλει στην κολονική καρκινογένεση [21]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η μειωμένη έκφραση του RFC συσχετίστηκε σημαντικά με μικρότερη συνολική και την ελεύθερη νόσου επιβιώσεις, υποδηλώνοντας ότι η RFC μπορεί να θεωρηθεί ως ένας δείκτης για την καλή πρόγνωση σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Επιπλέον, μεταξύ των ασθενών με υψηλή FRα έκφραση των ωοθηκών, τη συνολική και την ελεύθερη νόσου επιβίωση ήταν σημαντικά καλύτερη σε άτομα με υψηλή έκφραση RFC από εκείνους που δεν, εμπλέκοντας τον προστατευτικό ρόλο του RFC για ασθενείς με αυτούς τους όγκους.

έδειξαν επίσης ότι FRα ενίσχυση και μεθυλίωση προαγωγού RFC συσχετίζεται με την έκφραση του mRNA σε καρκίνους των ωοθηκών. Σε προηγούμενες αναφορές, η μεθυλίωση προαγωγού RFC έχει βρεθεί σε καρκινικά κύτταρα του μαστού [34] και τα πρωτογενή λεμφώματα [35]. Τα ευρήματά μας πρότεινε ότι πάνω ρύθμιση των FRα (ένα υποθετικό ογκογόνο φυλλικό οξύ μεταφορέα) και προς τα κάτω ρύθμιση των RFC (ένα υποθετικό είδος ογκοκατασταλτικό φυλλικό οξύ μεταφορέα) ήταν ελεγχόμενη γενετικά και επιγενετικώς αντίστοιχα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου των ωοθηκών.

Όπως σημειώνεται στην παραπάνω εισαγωγή, φυλλικό οξύ είναι απαραίτητο για τη σύνθεση του DNA [12], [13], [14], εξασκεί με τον τρόπο αυτό έμμεσα επίδρασή της επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η υπερέκφραση του FRα σε ΝΙΗ /3Τ3 κύτταρα έχει αναφερθεί ότι προκαλεί αύξηση της κυτταρικής ανάπτυξης in vitro και in vivo [36]. Χρησιμοποιώντας το φυλλικό οξύ σε διάφορες δοσολογίες κυμαινόμενες από 12 ηΜ (θεωρείται ως διαιτητικά ανεπάρκεια στη Βόρεια Αμερική) έως 60 ηΜ (θεωρείται φυσιολογικό για συμπλήρωμα μη χρήστες), ήμασταν σε θέση να αποδείξουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε FRα-θετικά κύτταρα SKOV-3 [13]. Αντιστρόφως, όταν ο FRα ήταν knockdown με προσέγγιση shRNA, αυτό φολικού μεσολάβηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε SKOV-3 κύτταρα χάθηκε, επιβεβαιώνοντας το γεγονός ότι το φυλλικό οξύ μεταφέρει πράγματι μέσω FRα κατά τη διαδικασία του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.