Αφηρημένο

14-3-3 πρωτεΐνες εκφράζονται παντού διμερείς πρωτεΐνες προσαρμογέα που έχουν προκύψει ως μεσολαβητές κλειδιά πολλών οδών σηματοδότησης κυττάρου σε πολλαπλούς τύπους κυττάρων. Τα αποτελέσματα της διαμεσολαβείται κυρίως μέσω σύνδεσης με επιλεκτικές πρωτεΐνες φωσφοσερίνης /θρεονίνης. Η σημασία της 14-3-3 πρωτεΐνες στον καρκίνο έχουν αρχίσει μόνο να γίνουν εμφανείς και ακριβής ρόλος του στην πρόοδο του καρκίνου καθώς και οι μηχανισμοί με τους οποίους οι πρωτεΐνες 14-3-3 μεσολαβούν λειτουργία των καρκινικών κυττάρων παραμένουν άγνωστα. Ενώ η πρωτεΐνη 14-3-3σ είναι ευρέως αποδεκτή ως καταστολέας όγκου, 14-3-3ζ, β και γ ισομορφές έχουν δειχθεί ότι έχουν αποτελέσματα προώθηση όγκου. Παρά τη σημασία της 14-3-3 οικογένειας στη διαμεσολάβηση διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, ο ακριβής ρόλος και ο μηχανισμός της 14-3-3ζ παραμένουν ανεξερεύνητα. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο της πρωτεΐνης σε προστάτη 14-3-3ζ κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και δια-ενδοθηλιακή μετανάστευση με βιοχημικές, μοριακής βιολογίας και προσεγγίσεις ανίχνευσης αντίσταση ηλεκτρικό κύτταρο-υπόστρωμα, καθώς και κυτταρικές λειτουργικές δοκιμασίες που βασίζονται. Η μελέτη μας έδειξε ότι η έκφραση με την πρωτεΐνη άγριου τύπου 14-3-3ζ σημαντικά ενισχυμένη δραστηριότητα Rac στα κύτταρα PC3. Σε αντίθεση, η έκφραση του διμερούς ανθεκτικών μεταλλαγμένη πρωτεΐνης 14-3-3ζ (DM-14-3-3) ανέστειλαν δραστικότητα Rac και συνδέονται φωσφορυλίωση της ρ21 ενεργοποιημένη κινάση-1 και 2. Έκφραση με άγριου τύπου 14-3-3ζ ή μόνιμα ενεργό Rac1 αυξημένη εξωκυττάρια μήτρα αναγνώριση, σχηματισμός ελασματοπόδια, η μετανάστευση των κυττάρων και trans-μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων από PC3. Σε αντίθεση, η έκφραση με DM 14-3-3ζ ή DN-Rac1 σε κύτταρα PC3 ανέστειλε σημαντικά αυτές τις λειτουργίες των κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι 14-3-3ζ ενισχύει τον καρκίνο του προστάτη αλληλεπιδράσεις κυττάρου-μήτρας, κινητικότητα και ενδοθηλίου μετανάστευση

in vitro

μέσω ενεργοποίησης του Rac1-ΟΤΡάσης και είναι ένας σημαντικός στόχος για θεραπευτικές παρεμβάσεις για τον καρκίνο του προστάτη .

Παράθεση: Goc Α, Abdalla Μ, Al-Azayzih Α, Somanath PR (2012) Rac1 ενεργοποίηση Καθοδηγείται από 14-3-3ζ διμερισμός Προωθεί τον καρκίνο του προστάτη κυττάρου-μήτρας, την κινητικότητα και την ενδοθηλιακή μετανάστευση. PLoS ONE 7 (7): e40594. doi: 10.1371 /journal.pone.0040594

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 14 Μαρ του 2012? Αποδεκτές: 11 Ιουν του 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουλίου 2012 |

Copyright: © 2012 Goc et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Ταμεία ήταν παρέχεται από το Πανεπιστήμιο του Ιδρύματος Γεωργίας Ερευνών, Wilson Ίδρυμα Φαρμακευτικής και UGA College of Pharmacy μέσω τειχών επιχορηγήσεις σε PRS, και εν μέρει από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης (R01HL103952) και American Heart Association Ανάπτυξης Grant Επιστήμονας (0830326N) στην PRS. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα επτά μέλη της οικογένειας 14-3-3 (επίσης γνωστή ως πρωτεΐνες YWHA) είναι γνωστό ότι αλληλεπιδρούν με περισσότερους από 100 βασικά μόρια σηματοδότησης σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα και να ρυθμίσει ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών διαδικασιών [1] , [2]. Σε γενικές γραμμές, 14-3-3 ισομορφές να δεσμεύονται με δύο εξαρτώμενο από φωσφορυλίωση μοτίβα πρόσδεσης υψηλής συγγένειας όπως RSXpSXP και RXXXpSXP [3], [4]. Δεδομένου ότι η πρωτεΐνη αλληλεπιδράσεις με αυτή την πρωτεΐνη προσαρμογέα εξαρτώνται από την ίδια θέση σχετικά με πρωτεΐνη 14-3-3 [5], γιατί 14-3-3 απαιτείται σε τόσες πολλές διαφορετικές ισομορφές είναι μια μακροχρόνια ερώτηση. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα 14-3-3 ισομορφές σχηματίζουν ομοδιμερή

in vivo

, μια εξήγηση για την απαίτηση των διαφόρων 14-3-3 πρωτεϊνών είναι να αποτελούν ξεχωριστές ετεροδιμερή με μοναδικά μοτίβα αναγνώρισης των ειδικών συνδετήρων. Ωστόσο, ενώ πολλαπλές ισομορφές 14-3-3 μπορούν να σχηματίσουν ετεροδιμερή

in vitro

, ένας συνδυασμός 14-3-3 ε και ζ είναι το μόνο γνωστό ετεροδιμερές που σχηματίζεται

in vivo

[ ,,,0],6].

Ενώ η παγκόσμια κάτω ρύθμιση έκφρασης 14-3-3 διαμεσολαβεί την καταστολή των όγκων, η έκφραση πρωτεϊνών 14-3-3 είναι σημαντικά αυξημένος σε πολλαπλές καρκίνους [7], [8], [9] , [10], [11], [12]. Ενώ υπερέκφραση 14-3-3 β και γ σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 έχουν δείξει να επάγουν ογκογόνο μετασχηματισμό [10], [13], το β, γ, ε, ζ και θ 14-3-3 γονιδιακή έκφραση έχει δειχθεί ότι να είναι αυξημένα σε μόνος καρκίνο του πνεύμονα [14]. Ωστόσο, όλα τα γονίδια 14-3-3, 14-3-3 σ και ζ έχουν πλέον άμεσα συνδέεται με τον καρκίνο. Πρωτεΐνη 14-3-3 σ και ζ προκαλούν αντίθετα αποτελέσματα σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού [15]. Πρωτεΐνη 14-3-3σ πιστεύεται ότι λειτουργεί ως καταστολέας όγκου μέσω επαγωγής μιας G2-M διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε περισσότερες μορφές καρκίνου [16]. Η έκφρασή του ρυθμίζεται προς τα κάτω σε επεμβατικές ουροποιητικό καρκίνους όπως της ουροδόχου κύστης [17], του προστάτη [18], και η ωοθήκη [19]. Σε αντίθεση, η αυξημένη έκφραση του 14-3-3ζ, ένα Drosophila ομόλογο του «Leonardo», έχει συνδεθεί με την αυξημένη ογκογένεση και προβάλλεται ως προγνωστικός δείκτης και θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο [20].

Μια συσχέτιση μεταξύ αυξημένη έκφραση 14-3-3ζ και αυξημένη επιβίωση των κυττάρων, έχει αναφερθεί σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [21]. Δύο ανεξάρτητες μελέτες έχουν επίσης υποδείξει μια σχέση μεταξύ αυξημένης εκφράσεως 14-3-3ζ και συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του προστάτη σε ανθρώπους [22], [23]. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος των 14-3-3s στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Αν και οι επιδράσεις της 14-3-3s στον πολλαπλασιασμό, του κυτταρικού κύκλου και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων είναι ευρέως μελετηθεί, είτε δεν είναι 14-3-3s απαραίτητες για τη μετάβαση των οποιωνδήποτε τύπων καρκινικών κυττάρων και οι μηχανισμοί που οδηγούν σε 14-3 -3-διαμεσολαβούμενη κατευθυντική μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων παραμένει να προσδιοριστεί. Προηγούμενες μελέτες μας σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 έχουν δείξει ότι η πρωτεΐνη 14-3-3 υπερ-έκφραση οδηγεί στην ενεργοποίηση του Rac1 και ρ21 ενεργοποιημένη κινάση (Pak) μονοπατιού σηματοδότησης μετανάστευση μεσολάβηση κυττάρων [24]. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε τον ειδικό ρόλο των 14-3-3ζ και διμερισμού της στην ρύθμιση του καρκίνου του προστάτη (PC3) αλληλεπιδράσεις κυττάρου-μήτρας, σχηματισμός ελασματοπόδια, κινητικότητα σε διάφορα εξωκυττάρια μήτρα (ECM) πρωτεΐνες και ενδοθηλίου μετανάστευση μέσω ενεργοποίησης της Rac1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αναστολή της 14-3-3ζ μπορεί να είναι μια δυνητική θεραπευτική στρατηγική για τον καρκίνο του προστάτη.

Αποτελέσματα

Η έκφραση πρωτεΐνης 14-3-3ζ αυξάνεται με την ογκογόνο μετασχηματισμό σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

Προηγούμενες μελέτες έχουν καθιερώσει μια σχέση μεταξύ της αυξημένης έκφρασης του 14-3-3ζ και αυξημένη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του προστάτη στους ανθρώπους [22], [23]. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να συγκριθούν τα επίπεδα έκφρασης του 14-3-3ζ μεταξύ διαφόρων ποντικού (TRAMP) και κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι αν και 14-3-3ζ εκφράζεται σε μη-ογκογόνα (TR-C2D) TRAMP (διαγονιδιακά αδενοκαρκινώματος του προστάτη Mouse) κυτταρική γραμμή, η έκφρασή του είναι σημαντικά υψηλότερο σε ογκογόνα (TR-C2) και μεταστατικό (Τr C2N) TRAMP κυτταρικές γραμμές (

ρ

& lt? 0,05) (Σχήμα 1Α και Β). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην έκφραση 14-3-3ζ μεταξύ μη μεταστατικό LNCaP και μεταστατικών LNCaP C4-2 ή κύτταρα PC3.

ζ έκφραση αυξάνει με ογκογόνο μετασχηματισμό σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. (Α) Ποντικού TRAMP (TR-C2D, TR-C2 και TR-C2N), ανθρώπινη ορμόνη ανταποκρίνεται LNCaP καθώς ορμόνη αναίσθητη λύματα κυττάρων LNCaP C4-2 και του καρκίνου του προστάτη PC3 υποβλήθηκαν για Western Blot συγκριτική ανάλυση για την 14-3- 3ζ έκφρασης. (Β) Ποσοτικοποίηση των παραπάνω στοιχείων με ανάλυση δείχνει πυκνομετρίας μπάντα αυξημένη έκφραση 14-3-3ζ σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη σε σύγκριση με μη ογκογόνα κύτταρα TRC2D ποντικού. (Ο-Ε) Κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με τον φορέα ελέγχου, WT-14-3-3ζ και DM-14-3-3ζ και υποβλήθηκαν σε βιωσιμότητα (Trypan blue δοκιμασία), πολλαπλασιασμό (δοκιμασία ΜΤΤ) και δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, αντίστοιχα. (*

σ

& lt? 0.001? Δ

σ

& lt? 0,01? #

σ

& lt? 0,05? N = 3).

Η

έχει προηγουμένως δειχθεί ότι 14-3-3ζ διμερισμός απαιτείται για τη δραστηριότητά του στα κύτταρα [26]. Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε αν η έκφραση και /ή το διμερισμό των πρωτεϊνών μπορούν να μεσολαβήσουν 14-3-3ζ κυτταρικές λειτουργίες του καρκίνου του προστάτη όπως ο πολλαπλασιασμός, η βιωσιμότητα και το σχηματισμό αποικιών. Η μελέτη μας έδειξε ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης 14-3-3ζ άγριου τύπου (WT-14-3-3ζ) σε κύτταρα PC3 σημαντικά ενισχυμένο πολλαπλασιασμό (

σ

& lt? 0.001), τη βιωσιμότητα (

σ

& lt? 0,01) και ο σχηματισμός αποικίας (

σ

& lt? 0,05), σε σύγκριση με εκείνους που εκφράζουν φορέα ελέγχου μόνο (Σχήμα 1C-Ε). Σε αντίθεση, τα κύτταρα που εκφράζουν μεταλλαγμένη πρωτεΐνη 14-3-3ζ διμερές ανθεκτικό (DM-14-3-3ζ), η οποία αποτρέπει τον διμερισμό του σε PC3 κύτταρα * οδήγησε σε σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού (

ρ

& lt? 0,01 ), η βιωσιμότητα (

ρ

& lt? 0,01) και ο σχηματισμός αποικίας (

ρ

& lt? 0,01), σε σύγκριση με εκείνα τα κύτταρα PC3 που εκφράζουν φορέα ελέγχου (Σχήμα 1C-Ε). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η έκφραση και ο διμερισμός του 14-3-3ζ είναι απαραίτητη για τη λειτουργία του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών

in vitro

.

Protein 14-3-3ζ διμερισμός Δίσκοι την Rac1 ΟΤΡάσης Δραστηριότητα στην PC3 κύτταρα

προηγούμενη μελέτη μας σε ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες έδειξε ότι η πρωτεΐνη 14-3-3 είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της Rac1 και ενεργοποιημένων ρ21 κινάσες 1 και 2 (Pak 1/2) [24]. Στην παρούσα μελέτη, προσδιορίσαμε αν υπερ-έκφραση και διμερισμού πρωτεΐνης 14-3-3ζ οδηγεί σε Rac1 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΡΑΚ1 /2 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Η μελέτη μας έδειξε ότι η υπερέκφραση των κυττάρων PC3 με WT-14-3-3ζ σημαντικά αυξημένη ενεργοποίηση Rac1 όπως αποδεικνύεται από τα αυξημένα επίπεδα της GTP-δεσμεύεται Rac1, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα που εκφράζει (

σ

& lt? 0,01) (Σχήμα 2Α και Β). Ωστόσο, η έκφραση με DM-14-3-3ζ σε κύτταρα PC3 ανέστειλε σημαντικά GTP-δεσμευμένη επίπεδα Rac1 σύγκριση με τον έλεγχο (

ρ

& lt? 0,05) (Σχήμα 2Α και Β). Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε αν 14-3-3ζ έκφρασης και διμερισμού είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση της με την Rac1. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι ενώ ανοσοκαταβύθιση 14-3-3ζ από τα κύτταρα PC3 εκφράζουν WT-14-3-3ζ συν-κατακρημνίζεται Rac1 (

σ

& lt? 0.01), η αλληλεπίδραση αυτή είχε καταργηθεί κατά την έκφραση των κυττάρων PC3 με DM-14-3-3ζ (Σχήμα 2C και D). Αλληλεπίδραση μεταξύ 14-3-3ζ και Rac1 στα κύτταρα PC3 επιτεύχθηκε επίσης με EGF (

σ

& lt? 0,05). (Σχήμα 2Ε και F)

ζ έκφρασης και διμερισμού οδηγεί στην ενεργοποίηση των rac1 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. (Α) WT-14-3-3ζ και DM-14-3-3ζ πλασμίδια έκφρασης μαζί με τον φορέα ελέγχου επιμολύνθηκαν σε κύτταρα PC3 και λύματα κυττάρων υποβλήθηκαν σε δοκιμασία δραστικότητας Rac1 χρησιμοποιώντας Pak-PBD-γλουταθειόνης σεφαρόζης σφαιρίδια. (Β) Ποσοτικοποίηση των παραπάνω στοιχείων με ανάλυση πυκνομετρίας μπάντα που δείχνει μια θετική σχέση μεταξύ 14-3-3ζ έκφρασης, διμερισμό και τη δραστηριότητα Rac1. Μπαρ απεικονίζουν δραστηριότητα Rac1 όπως μετράται από τις GTP δεσμεύονται επίπεδα Rac1. (C) WT-14-3-3ζ και DM-14-3-3ζ πλασμίδια έκφρασης μαζί με τον φορέα ελέγχου επιμολύνθηκαν σε κύτταρα PC3 και λύματα κυττάρων υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση 14-3-3ζ και συν-κατακρήμνιση της Rac1 αναλύθηκε . (D) Ποσοτικός προσδιορισμός των παραπάνω δεδομένων με ανάλυση πυκνομετρίας μπάντα. Μπαρ απεικονίζουν δραστηριότητα Rac1 όπως μετράται από τις GTP δεσμεύονται επίπεδα Rac1. κύτταρα (Ε) στερήθηκαν ορού PC3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ του EGF για 12 ώρες και τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε ανοσοκαταβύθιση 14-3-3ζ και συν-κατακρήμνιση της Rac1 αναλύθηκε. (F) Ποσοτικοποίηση των παραπάνω δεδομένων από ανάλυση πυκνομετρίας μπάντα. Μπαρ απεικονίζουν δραστηριότητα Rac1 όπως μετράται από τις GTP δεσμεύονται επίπεδα Rac1. (*

σ

& lt? 0.001? Δ

σ

& lt? 0,01? #

σ

& lt? 0,05? N = 3).

Η

στη συνέχεια, αναλύσαμε εάν 14-3-3ζ-Rac1 αλληλεπίδραση μπορεί να οδηγήσει στην διαμόρφωση της δράσης Rac1-ΟΤΡάσης. Στη μελέτη μας, η υπερέκφραση μόνιμα ενεργών Rac1 οδήγησε σε αυξημένη μετανάστευση των PC3 κυττάρων σε διάφορες πρωτεΐνες μήτρας. Ομοίως, η έκφραση με WT-14-3-3ζ οδήγησε επίσης σε αυξημένη φωσφορυλίωση του ΡΑΚ1 /2 (

ρ

& lt? 0.001) (Σχήμα 3Α και Β). Δεδομένου ότι τα βασικά επίπεδα φωσφορυλιωμένου ΡΑΚ1 /2 σε φορέα ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα PC3 ήταν πολύ χαμηλό, η υπερέκφραση με DN-Rac1 ή DM-14-3-3ζ δεν έδειξαν καμία σημαντική αλλαγή στην /2 φωσφορυλίωση ΡΑΚ1 (Σχήμα 3Α και Β ). Ενώ συν-έκφραση DM-14-3-3ζ με CA-Rac1 σε κύτταρα PC3 παρουσίασαν σημαντική αύξηση στην /2 φωσφορυλίωση ΡΑΚ1 σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου φορέα που εκφράζουν (

ρ

& lt? 0.001), συν-έκφραση του DN-Rac1 με WT-14-3-3ζ απομειωθεί σημαντικά /2 φωσφορυλίωση ΡΑΚ1 (

σ

& lt? 0.001). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση των Rac1 είναι κατάντη του 14-3-3ζ διμερισμού.

(Α) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) και DN-Rac1 (N

17) πλασμίδια έκφρασης και φορέα, μόνος ή σε συνδυασμούς, επιμολύνθηκαν σε κύτταρα PC3 και λύματα κυττάρων υποβλήθηκαν σε Western ανάλυση φωσφορυλιωμένων ΡΑΚ1. (Β) Ποσοτικοποίηση των παραπάνω δεδομένων από ανάλυση πυκνομετρίας μπάντα. Ράβδοι απεικονίζουν ΡΑΚ1 δραστικότητα όπως μετριέται από τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης. (*

σ

& lt? 0.001? Δ

σ

& lt? 0,01? #

σ

& lt? 0,05? N = 3).

Η

η αλληλεπίδραση μεταξύ πρωτεΐνης 14-3-3ζ και Rac1 Βελτιώνει Matrix Αναγνώριση από τα PC3 κύτταρα

από Rac-GTPases είναι master ρυθμιστές του κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση σε απάντηση νύξεις από το εξω-κυτταρικό μικροπεριβάλλον, μελετήσαμε αν διαμόρφωσης της πρωτεΐνη 14-3-3ζ-Rac1 σηματοδότηση στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη θα έχει καμία επίδραση στην ικανότητα τους να αναγνωρίζουν και να δεσμεύονται σε πρωτεΐνες ECM όπως ινωδονεκτίνη (FN), βιτρονεκτίνη (VN), κολλαγόνο Ι (COLL-I) και λαμινίνη (Ι_Ν ), τα οποία εκφράζονται σε αφθονία σε διάφορους ιστούς που φέρουν κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Η μελέτη μας έδειξε ότι ενώ η έκφραση με την WT-14-3-3ζ και CA-Rac1 ενισχυμένη κύτταρα PC3 πρόσφυση σε αυτές τις πρωτεΐνες ECM, η έκφραση με DM-14-3-3ζ ή DN-Rac1 απομειωθεί σημαντικά τη διαδικασία αυτή (Εικόνα 4Α-Δ) . Ενώ μειωμένη προσκόλληση με έκφραση DM-14-3-3ζ διασώθηκε με συν-έκφραση με CA-Rac1, συν-έκφραση του WT-14-3-3ζ σε DN-Rac1 κύτταρα που εκφράζουν PC3 δεν σώσει την εξασθενημένη κυτταρική προσκόλληση (Εικόνα 4A-D), υποδεικνύοντας ότι 14-3-3ζ δρα ανοδικά της ενεργοποίησης rac1 στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-μήτρας PC3.

(AD) WT-14-3-3ζ, DM-14-3- 3ζ, CA-Rac1 (L

61) και DN-Rac1 (N

17) πλασμίδια έκφρασης και φορέα, μόνος ή σε συνδυασμούς, επιμολύνθηκαν σε κύτταρα PC3 και τα κύτταρα στερήθηκαν ορού υποβλήθηκαν σε δοκιμασία κυτταρικής προσκόλλησης στην εξωκυττάρια πρωτεΐνες μήτρας όπως ινωδονεκτίνη (FN), κολλαγόνο τύπου Ι (COLL-1), λαμινίνη (Ι_Ν) και βιτρονεκτίνη (VN), αντίστοιχα, με μία κυτταρική πυκνότητα 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε παρουσία 10 % FBS. Ράβδοι απεικονίζουν αριθμός των κυττάρων PC3 τηρούνται ειδικές πρωτεΐνες ECM. (*

σ

& lt? 0.001? Δ

σ

& lt? 0,01? #

σ

& lt? 0,05? N = 3 τετραπλούν).

Η

πρωτεΐνη 14-3-3ζ-Rac1 Σηματοδοσίας Ρυθμίζει ελασματοπόδια Σχηματισμός σε PC3 κύτταρα

περαιτέρω ανάλυση μας χρησιμοποιώντας χρώση phalloidin των PC3 κυττάρων που χρωματίζει συγκεκριμένα πρόσφατα πολυμερισμένο κυτταροσκελετού της ακτίνης έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση με WT-14- 3-3ζ ή CA-Rac1 οδήγησε σε ενισχυμένο σχηματισμό ελασματοπόδια σε πρόσφατα εξάπλωση κυττάρων σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα που εκφράζει μη-κατεργασμένα κύτταρα PC3 με την παρουσία 10% FBS (Σχήμα 5Α). Σε αντίθεση, η έκφραση με DM-14-3-3ζ ή DN-Rac1 οδήγησε σε μειωμένο σχηματισμό ελασματοπόδια σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 5Α). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν επίσης σε κύτταρα που μεταναστεύουν PC3 αναλύονται για χρώση phalloidin. Κύτταρα PC3 που εκφράζουν σχηματισμός ενισχυμένη ελασματοπόδια WT-14-3-3 ή CA-Rac1exhibited σύγκριση με τα κύτταρα που εκφράζουν το φορέα (Σχήμα 5Β). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ένωση 14-3-3ζ-Rac1 εμπλέκεται στο σχηματισμό ελασματοπόδια στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

ζ-Rac1 συνεργασία ρυθμίζει το σχηματισμό ελασματοπόδια στα κύτταρα PC3. (ΑΒ) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) και DN-Rac1 (N

17) πλασμίδια έκφρασης και φορέα, μόνος ή σε συνδυασμούς, επιμολύνθηκαν σε κύτταρα PC3, απλώθηκαν σε θαλάμους καλλιέργειας κυττάρων παρουσία 10% FBS και καθορίζεται σε 40 λεπτά (Α) ή 16 ώρες (Β) μετά την επίστρωση. Παραφορμαλδεΰδη σταθεροποιημένα κύτταρα βάφτηκαν με Alexa Fluor (Κόκκινο) επισημαίνονται phalloidin να ανιχνεύσει πρόσφατα πολυμερισμένο κυτταροσκελετού της ακτίνης και ελασματοπόδια.

Η

Η συνεργασία μεταξύ Πρωτεΐνη 14-3-3ζ και Rac1 Βελτιώνει EGF-διεγείρεται PC3 κυττάρων Directional Μετανάστευση και ενδοθηλίου μετανάστευση

στη συνέχεια, εξετάσαμε αν 14-3-3ζ παίζει ένα ρόλο στην μετανάστευση του προστάτη καρκινικών κυττάρων. Για να το κάνουμε αυτό επιμολυσμένα κύτταρα LNCaP που αποκρίνονται στο ανδρογόνο και τα κύτταρα PC3 ανδρογόνα αναίσθητη με WT-14-3-3ζ και DM-14-3-3ζ και τους υπέβαλαν για δοκιμασία μετανάστευσης σε πλάκες 24 φρεατίων υπό την παρουσία και απουσία του EGF. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ενώ η έκφραση και των δύο LNCaP και PC3 κυττάρων με WT-14-3-3ζ σημαντικά ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν τον φορέα ελέγχου (

ρ

& lt? 0,05) με την παρουσία του EGF, της έκφρασης με DM-14-3-3ζ οδήγησε σε διαταραχή της κυτταρικής μετανάστευσης μετά από 24 ώρες (

σ

& lt? 0.01 για τα κύτταρα PC3 και

σ

& lt? 0.05 για τα κύτταρα LNCaP) (Εικόνα 6Α και C) . Αν και μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε στην απουσία του EGF, τα δεδομένα δεν ήταν στατιστικώς σημαντική (Σχήμα 6Β και D).

LNCaP και PC3 κυτταρική μετανάστευση. (Α-Δ) WT-14-3-3ζ και DM-14-3-3ζ πλασμίδια έκφρασης ή φορέα ελέγχου επιμολύνθηκαν σε LNCaP και PC3 κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων μέσω ενός μηδέν γίνεται στη μονοστιβάδα των κυττάρων. Ράβδοι απεικονίζουν τη μετανάστευση των κυττάρων PC3, όπως μετράται με την ανάκτηση μηδέν του. (*

σ

& lt? 0.001? Δ

σ

& lt? 0,01? #

σ

& lt? 0,05? N = 4 τετραπλούν).

Η

στη συνέχεια προσδιορίστηκε αν 14-3-3ζ-Rac1 συνεργασία είναι αναγκαία για την δια μέσω του ενδοθηλίου μετανάστευση, καθώς και κατευθυντική μετανάστευση των κυττάρων PC3 σε απόκριση προς EGF σε διάφορες πρωτεΐνες ECM που είναι άφθονα σε ιστούς που φέρουν καρκινικά κύτταρα προστάτη κατά τα διάφορα στάδια της ανάπτυξης του όγκου, εισβολή, ενδοθηλίου μετανάστευση και μετάσταση σε ιστούς όπως οστό. Η ανάλυσή μας έδειξε ότι ενώ η έκφραση με την WT-14-3-3ζ και CA-Rac1 ενίσχυσε σημαντικά τη μετανάστευση PC3 κυττάρων σε πρωτεΐνες ECM, όπως FN, VN, LN, Bone σιαλοπρωτεϊνη (BSP? οστεοποντίνη) και SPARC (Οστεονεκτίνη), έκφρασης με DM-14-3-3ζ ή DN-Rac1 απομειωθεί σημαντικά κατευθυντική μετανάστευση των κυττάρων PC3 (Εικόνα 7Α-F). Ομοίως, ενώ η έκφραση με WT-14-3-3ζ ή CA-Rac1 ενισχυθεί σημαντικά ενδοθηλίου μετανάστευση των κυττάρων PC3, έκφρασης με DM-14-3-3ζ ή DN-Rac1 σημαντικά μειωμένη ενδοθηλίου μετανάστευση από τα κύτταρα PC3 (Εικόνα 8Α-C) . Λαμβάνοντας υπόψη ότι η μειωμένη κυτταρική μετανάστευση PC3 από DM-14-3-3ζ έκφραση διασώθηκε από την συν-έκφραση με την CA-Rac1, μειωμένη κινητικότητα και ενδοθηλίου μετανάστευση από DN-Rac1 κύτταρα που εκφράζουν PC3 δεν διασώθηκε από την συν-έκφραση με WT-14-3 -3ζ (Σχήμα 8Α-C). Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν το ρόλο της 14-3-3ζ στη μεσολάβηση ενεργοποίησης Rac1 απαραίτητα για τη μετανάστευση PC3 κυττάρων και δια μέσω του ενδοθηλίου μετανάστευση.

ζ μεσολάβηση της μετανάστευσης PC3 κυττάρων. (AF) WT-14-3-3ζ,, CA-Rac1 (L

61) και DN-Rac1 (N

17) πλασμίδια έκφρασης DM-14-3-3ζ και φορέα, μόνος ή σε συνδυασμούς, επιμολύνθηκαν σε κύτταρα PC3 και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων σε πλαστικό ή πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας όπως ινονεκτίνη (FN), λαμινίνη (Ι_Ν) και βιτρονεκτίνη (VN), Οστεονεκτίνη (SPARC) και των οστών σιαλοπρωτεΐνη (BSP? οστεοποντίνη), αντίστοιχα . Ράβδοι απεικονίζουν τη μετανάστευση των PC3 κυττάρων σε διάφορες πρωτεΐνες ECM, όπως μετράται με την ανάκτηση μηδέν του. (*

σ

& lt? 0.001? Δ

σ

& lt? 0,01? #

σ

& lt? 0,05? N = 4 τετραπλούν).

Η

ζ-μεσολαβητική ενεργοποίηση Rac1 ρυθμίζει PC3 μετανάστευση των κυττάρων δια μέσω του ενδοθηλίου. (ΑΒ) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) και DN-Rac1 (Ν

17) πλασμίδια έκφρασης, τον έλεγχο των φορέων, καθώς και ένας συνδυασμός του DN-Rac1 και WT-14-3-3ζ, επιμολύνθηκαν σε κύτταρα PC3 και τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δια-ενδοθηλιακή δοκιμασία μετανάστευσης

in vitro

χρησιμοποιώντας ECIS. (C) Ανάλυση του ενδοθηλίου μετανάστευση των κυττάρων PC3 σε 1,5 ώρα μετά την εισαγωγή των κυττάρων σε ενδοθηλιακά μονοστιβάδα σε ECIS συστοιχία τσιπ που αποδεικνύουν το ρόλο της 14-3-3ζ διμερισμού για την ενεργοποίηση του Rac1 στην μεσολάβηση του ενδοθηλίου μετανάστευση των κυττάρων PC3 (Δ

σ

& lt? 0,01? #

σ

& lt? 0,05? n = 5)

Η

Συζήτηση

Η κύρια παρατήρηση από την παρούσα μελέτη μας είναι ότι. έκφρασης με πρωτεΐνη 14-3-3ζ σε PC3 κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα ενισχυμένη αλληλεπιδράσεις κυττάρου-ECM, σχηματισμός ελασματοπόδια, η μετανάστευση των κυττάρων και ενδοθηλίου μετανάστευση μέσω ενεργοποίησης του Rac1-ΟΤΡάσης. Αναφέραμε προηγουμένως ότι η υπερ-έκφραση των αποτελεσμάτων πρωτεΐνης 14-3-3β σε ενισχυμένη δραστηριότητα Rac1 και Pak σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3, με αποτέλεσμα αυξημένη ενεργοποίηση ιντεγρίνης, σχηματισμός ελασματοπόδια, κυτταρική μετανάστευση και συναρμολόγηση εξωκυττάριας μήτρας [24]. Δείξαμε επίσης ότι η ενεργοποίηση του Rac1-ΡΑΚ1 /2 μονοπάτι εμπλέκεται σε ογκογόνο μετασχηματισμό των κυττάρων Rat-1α [25], υποδηλώνοντας ότι παρόμοιος μηχανισμός με 14-3-3ζ σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να ενισχύσει την ανάπτυξη του όγκου, ενδοθηλίου μετανάστευση και τη μετάσταση. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η έκφραση με WT-14-3-3ζ σε κύτταρα PC3 οδήγησε σε αυξημένη προσκόλληση και τη μετανάστευση με διάφορες πρωτεΐνες ECM, τα οποία είναι άφθονα σε ιστούς που φιλοξενούν τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη κατά τη διάρκεια των διαφόρων σταδίων εισβολή των καρκινικών κυττάρων, trans-αγγειακή μετανάστευση και την μετάσταση στα οστά. Ωστόσο υπερ-έκφραση ενός μεταλλαγμένου του 14-3-3ζ (DM-14-3-3ζ), το οποίο έχει προηγουμένως δειχθεί να αποτραπεί ο διμερισμός του [26], σε PC3 κύτταρα δεν εμφανίζουν αυτά τα αποτελέσματα, αντί σαν αποτέλεσμα εξασθενημένη κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου PC3. Ενώ WT-14-3-3ζ έκφραση οδήγησε σε ενισχυμένο σχηματισμό ελασματοπόδια και την αυξημένη δραστηριότητα της Rac1-ΟΤΡάσης όπως αποδεικνύεται από την αυξημένη φωσφορυλίωση του ΡΑΚ1 /2, η έκφραση με DM-14-3-3ζ αντίθετος αυτά τα αποτελέσματα. Περαιτέρω, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι ο διμερισμός των πρωτεϊνών 14-3-3ζ είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της Rac1, το οποίο με τη σειρά του, ρυθμίζει την κινητικότητα του και του ενδοθηλίου μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Συνολικά, η μελέτη μας δείχνει μια άμεση συσχέτιση μεταξύ της πρωτεΐνης 14-3-3ζ και Rac1 στη ρύθμιση της ECM αλληλεπίδραση με τα κύτταρα PC3, την κινητικότητα τους και ενδοθηλιακής μετανάστευσης, και ότι η πρόληψη διμερισμός του 14-3-3ζ μπορεί να αναστείλει αυτά τα αποτελέσματα.

Αν και ο ρόλος των πρωτεϊνών 14-3-3 στην κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό έχει μελετηθεί εκτενώς, ο ειδικός ρόλος της 14-3-3s στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-μήτρας, κινητικότητα και διαενδοθηλιακή εισβολή και μοριακών μηχανισμών που ρυθμίζουν τη διαδικασία δεν είναι απολύτως κατανοητή. αλληλεπιδράσεις κυττάρων-μήτρας και η μετανάστευση είναι οι βασικές ιδιότητες των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων, και το πρώτο βήμα στη διαδικασία αυτή εμπλέκει κυτταροσκελετικές αναδιαμόρφωση, ελέγχεται κυρίως από μικρά Rho ΟΤΡάσες [27] Δυνατότητα Internet ανεξάρτητες μελέτες προσδιορίζονται κινάση πρωτεΐνης D (PKD) ως υποψήφια πρωτεΐνη που σχετίζεται με το σχηματισμό F-ακτίνης και αλληλεπιδρά με 14-3-3 στη ρύθμιση της διάταξης κυτταροσκελετικών [28], [29]. Ωστόσο, PKD συμμετείχε σε αρνητική ρύθμιση των ενεργών αναδιαμόρφωσης κυτταροσκελετική στην αιχμή με υπερ-έκφραση του συστατικώς δραστικής PKD με αποτέλεσμα εξασθενημένη κυτταρική μετανάστευση μέσω ενεργοποίησης του RhoA. Άλλοι μηχανισμοί που έχουν ενοχοποιηθεί για την 14-3-3 μεσολάβηση μετανάστευση κυττάρων περιλαμβάνουν τη συμμετοχή της σε απενεργοποίηση του cortactin, μια πρωτεΐνη σύνδεσης ακτίνης, μέσω φωσφορυλίωσης PKD μεσολάβηση στη Ser298, οδηγώντας σε αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης [30].

οι μελέτες κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας έχουν αποκαλύψει τη σημασία των πρωτεϊνών 14-3-3 στην θετική ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης που αφορούν Rac1-GTPases. Αρχική ένδειξη 14-3-3 και σύνδεσης Rac1 αναφέρθηκε για πρώτη φορά σε μοντέλο κυττάρων CHO [31]. εργαστήριο μας έχει δείξει στο παρελθόν ότι 14-3-3β ενεργοποιεί Rac1 και ΡΑΚ1 σηματοδότησης στη ρύθμιση των ΝΙΗ 3Τ3 αλληλεπίδρασης κυττάρου-μήτρας, μετανάστευση και συναρμολόγηση εξωκυττάριας μήτρας μέσω διαμόρφωσης συγγένεια ιντεγκρίνης α

5β

1 [24]. Δείξαμε επίσης ότι η έκφραση με 14-3-3β αποτέλεσμα την μετατόπιση του Rac1 να κυματισμών μεμβράνη δραστικότητα ενίσχυσης ΡΑΚ1 και σχηματισμός ελασματοπόδια σε ΝΙΗ3Τ3. Μετά από αυτό, μια πιο πρόσφατη μελέτη δείχνουν ότι 14-3-3 ελέγχει μηχανική κυττάρων και κυτοκίνηση στο

Dictyostelium

μέσω του συντονισμού των δραστηριοτήτων Rac1, μυοσίνη ΙΙ και μικροσωληνίσκους [32]. Ωστόσο, δεν υπάρχουν άλλες αναφορές σχετικά με τη σύνδεση της 14-3-3 και Rac1-ΟΤΡάσες στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης των οποιωνδήποτε καρκινικών κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η υπερ-έκφραση του WT-14-3-3ζ αποτέλεσμα σχηματισμό ελασματοπόδια στη διάδοση και μεταναστευτικά κύτταρα PC3 είναι παρόμοια με ουσιαστικά δραστική Rac1 εκφράζοντα κύτταρα. Σε αντίθεση, ανέστειλε το σχηματισμό lamelipodia DM-14-3-3ζ. Τα αποτελέσματά μας από την δοκιμασία δραστικότητας Rac1 και φωσφορυλίωση των ΡΑΚ1 /2, μεταγενέστερος υπόστρωμα της Rac-GTPases, τόσο ανέφερε ότι 14-3-3ζ ενεργοποιεί Rac1. Επιπλέον, το γεγονός ότι συν-έκφραση με DM-14-3-3ζ δεν αναστέλλει τη φωσφορυλίωση του ΡΑΚ1 /2 που προκαλείται από την έκφραση με CA-Rac1 δείχνουν ότι 14-3-3ζ διμερισμός είναι ανάντη της ενεργοποίησης Rac1. Αν και ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο 14-3-3ζ ρυθμίζει δραστικότητα Rac1 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη δεν είναι εμφανές από τα αποτελέσματα μας, ένας πιθανός μηχανισμός θα είναι η αλληλεπίδραση του 14-3-3ζ με έναν από τους παράγοντες εναλλαγής νουκλεοτιδίου γουανίνης της (GEF) και παράδοσή του σε Rac1 με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του.

Μεταξύ των 14-3-3 ισομορφές, αυξημένη έκφραση 14-3-3ζ έχει ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας του όγκου σε φάρμακα χημειοθεραπείας, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [21], [33]. Αντίθετα, προς τα κάτω ρύθμιση έκφρασης 14-3-3 ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα [2], [20], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [21], εμπλέκοντας το θεραπευτικό δυναμικό των 14-3-3ζ για τη θεραπεία του καρκίνου. Οι πρόσφατες εξελίξεις στην siRNA που βασίζεται knockdown του 14-3-3 πρωτεΐνες, καθώς και αναστολείς πεπτιδίου πρόληψη του διμερισμού της 14-3-3 όπως R18 (difopein, ένα διμερές R18) [34] ή ενώσεις μικρού μορίου όπως FOBISIN 101 [35 ] δείχνει την υπόσχεση για την ανάπτυξη αντι-14-3-3 θεραπεία για τον καρκίνο.

Εν κατακλείδι, έχουμε εντοπίσει 14-3-3ζ και Rac1 ως νέων εταίρων στην οδό ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων του καρκίνου του προστάτη της μήτρας-κυττάρων, την κινητικότητα σε απόκριση σε επεμβατικές και μεταστατικών ερεθίσματα, καθώς και για ενδαγγείωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η 14-3-3 είναι ένας πιθανός στόχος για τις θεραπευτικές παρεμβάσεις στον καρκίνο του προστάτη.

Μέθοδοι

Αντιδραστήρια, Γραμμές κυττάρων και αντισώματα

Ανθρώπινο PC3, LNCaP και LNCaP κύτταρα C4-2 (ATCC, Manassas, VA) χρησιμοποιήθηκαν και διατηρήθηκαν σε DMEM-High γλυκόζη (HyClone, Thermo Scientific, Logan, UT) με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C. Ποντικού TRAMP (TR-C2D, TR-C2 και TR-C2N) κύτταρα προικισμένος από τον Δρ barabara Foster, Baylor College of Medicine, TX. Πρωτογενή αντισώματα έναντι φωσφο-ΡΑΚ1 /2 Ser144 /142, 14-3-3ζ και παν-πρωτεΐνη-14-3-3 αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling (Boston, ΜΑ). Αντι-Rac1 αντισώματα, ινωδονεκτίνη και λαμινίνη ελήφθησαν από την BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Πρωτογενή αντισώματα έναντι β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Sigma, St. Louis, ΜΟ. Όλα τα δευτερογενή αντισώματα ελήφθησαν από την BioRad (Hercules, CA). Alexa Fluor555 σημασμένο φαλλοειδίνη αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Η οστεοποντίνη (Bone σιαλοπρωτεϊνη), οστεονεκτίνη (SPARC) και βιτρονεκτίνη αγοράστηκαν από την R &?. D Systems (Minneapolis, ΜΝ)

παροδικές επιμολύνσεις

Ανθρώπινα κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν παροδικά με pEBG πλασμίδια κ.β. 14-3-3ζ (GST ετικέτα), DM-14-3-3ζ (διμερισμού ανθεκτικά 14-3-3ζ-GST ετικέτα? 14-3-3 E5K, L12AE να Q12QR, Y82Q, K85N, και E87Q), CA -Rac1 (Rac1-L

61), και DN-Rac1 (Rac1-N

17) κατασκευάσματα, αντίστοιχα, ή σε συνδυασμούς των WT-14-3-3ζ με DN-Rac1 (Rac1-Ν

17) κατασκευές και DM-14-3-3ζ με CA-Rac1 (Rac1-L

61), χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 Invitrogen (Carlsbad, CA) αντιδραστήριο επιμόλυνσης σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Πρωτεΐνη 14-3-3 κατασκευάσματα, που αρχικά δημιουργήθηκε από τον Joseph Avruch εργαστήριο, Γενικό Νοσοκομείο της Μασαχουσέτης, Βοστώνη ελήφθησαν από Addgene, Cambridge, MA. Τα κύτταρα μάρτυρες επιμολύνθηκαν παροδικά με κενό φορέα pBabe-πουρομυκίνης. Περίπου ελήφθη 70-80% αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης.

Rac1 Activation Assay

δραστικότητα Rac1 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ προσδιορισμού δραστικότητας Rac από Cytoskeleton (Denver, CO) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, η περιοχή PBD του PAK συντηγμένη με γλουταθειόνη

S

-transferase (GST) και συζευγμένα με σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης 4Β αναμίχθηκαν με 1 mg ολικής πρωτείνης σε λύμα από κύτταρα PC3 παροδικά επιμολυσμένα με WT-14- 3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1, ή DN-Rac1 πλασμίδια ή σε συνδυασμούς του CA-14-3-3ζ με DN-Rac1 και DM-14-3-3ζ με CA-Rac1, που ακολουθείται με επώαση στους 4 ° C για 1 ώρα. Τα σφαιρίδια συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης με αναστολείς πρωτεάσης Complete 1Χ (Roche Applied Science, Indianapolis, ΙΝ) και δύο φορές με 1Χ PBS. Οι πρωτεΐνες εκλούστηκαν με βρασμό χάντρες σε 2Χ Laemmli ρυθμιστικό δείγματος (BioRad, Hercules, CA) για 5 λεπτά, διαχωρίστηκαν σε μια SDS-πολυακρυλαμιδίου 12% και κηλιδώθηκε με Rac1 αντισώματα.

Trypan μπλε αξιολόγηση της βιωσιμότητας

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή σε DMEM με 10% FBS. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα /100 μΐ σε DMEM και αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύκτα. Μετά από αυτό, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αντίστοιχα πλασμίδια και καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες σε συνθήκες ελεύθερες ορού. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα κυανού τρυπάνης (0,04% w /v, Invitrogen, Carlsbad, CA), και μετρώνται με την αιματοκυτταρόμετρο. Σύνολο κύτταρα και trypan blue χρωματισμένα (δηλ, μη βιώσιμα) κύτταρα μετρήθηκαν, και το ποσοστό των μη βιώσιμων κυττάρων υπολογίστηκε.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Ο πολλαπλασιασμός των κυτταρικών γραμμών PC3 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το μη ραδιενεργό δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων BrdU-based (Roche Applied Science) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, επιμολυσμένα κύτταρα PC3 απλώθηκαν σε πλάκες με επίπεδο πυθμένα φρεατίων 96 σε πυκνότητα 5 χ 10

3 κύτταρα ανά 100 μΙ, και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες σε συνθήκες ελεύθερες ορού. PC3 κύτταρα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε μια δοκιμασία 5-βρωμο-2-δεοξυουριδίνη χρησιμοποιώντας το BrdU Labeling και Detection Kit III (Roche Applied Science) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. ενσωμάτωσης BrdU εντός του ϋΝΑ προσδιορίστηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 και 690 nm και σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας ELISA. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± S.D.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

δοκιμασία σχηματισμού αποικίας διεξήχθη χρησιμοποιώντας το πρότυπο πρωτόκολλο [36].