Abstract

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) και κυκλοοξυγενάση-2 (COX-2) παίζουν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη της νόσου, η υποτροπή και η θεραπευτική αντίσταση του προχωρημένου καρκίνου του προστάτη (PCA). Σε αυτή την εργασία, αξιολογήσαμε, για πρώτη φορά, το θεραπευτικό όφελος του αποκλεισμού EGRF ή /και COX-2 (με τη χρήση gefitinib και NS-398, αντίστοιχα) από την άποψη της βελτίωσης της αποτελεσματικότητας του συμβατικού κλινικής χημειοθεραπευτικό docetaxel φάρμακο in vitro και vivo. Δείξαμε ότι EGFR και η έκφραση COX-2 ήταν υψηλότερα στα μεταστατικά από μη μεταστατικό ιστούς και τα κύτταρα του προστάτη. Docetaxel, μόνη ή σε συνδυασμό με gefitinib ή NS-398, είχε ως αποτέλεσμα μια μικρή μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων. Ο συνδυασμός τριών φαρμάκων μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι μόνο του ή σε συνδυασμό με gefitinib ή NS-398 docetaxel. Docetaxel οδήγησε σε μικρή αύξηση των αποπτωτικών κυττάρων σε μεταστατικούς και μη μεταστατικές κυτταρικές γραμμές. NS-398 σημαντικά ενισχυμένη docetaxel επαγόμενη κυτταρική απόπτωση. Ο συνδυασμός των τριών φαρμάκων προκάλεσε ακόμη εμφανέστερη απόπτωση και οδήγησε σε μεγαλύτερη καταστολή του διηθητικού δυναμικού από μόνη της ή σε συνδυασμό με gefitinib ή NS-398 docetaxel. Ο συνδυασμός όλων των τριών φαρμάκων οδήγησε επίσης σε μια πιο έντονη μείωση της NF-κΒ, ΜΜΡ-9 και τα επίπεδα VEGF σε κύτταρα PC-3M. Αυτά τα in vitro ευρήματα αυτά υποστηρίζονται από in vivo μελέτες δείχνουν ότι η docetaxel σε συνδυασμό με gefitinib και NS-398 ήταν σημαντικά πιο αποτελεσματική από οποιοδήποτε μεμονωμένο παράγοντα. Με βάση την προηγούμενη προκλινική έρευνα, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι, ταυτόχρονα, μπλοκάροντας EGFR και COX-2 με gefitinib και NS-398 ευαισθητοποιεί προηγμένα κύτταρα του προστάτη να docetaxel επαγόμενη κυτταροτοξικότητα.

Παράθεση: Lin J, Wu Η, Shi H, Παν W, Yu H, Zhu J (2013) Συνδυασμένη Αναστολή του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού Factor και της κυκλοοξυγενάσης-2 οδηγεί σε δραστικότητα μεγαλύτερη αντι-όγκου της docetaxel σε προχωρημένους Καρκίνος του προστάτη. PLoS ONE 8 (10): e76169. doi: 10.1371 /journal.pone.0076169

Συντάκτης: Wendy J. Χους, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 Μαρ 2013? Αποδεκτές: 21 του Αυγούστου 2013? Δημοσιεύθηκε: 14 Οκτωβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο έχει υποστηρίξει από την Επιστήμη και την Τεχνολογία του έργου του σχεδιασμού της Nanjing, Κίνα (201.201.088). Η διεύθυνση URL της ιστοσελίδας χρηματοδότης είναι https://202.127.12.44/XMSB/Show_JBXXB.jsp?XMBH=2012sc315043 DJXH=20121069. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνή κακοήθεια, και είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου μεταξύ των ηλικιωμένων ανδρών [1]. Το ποσοστό ανταπόκρισης σε ριζική προστατεκτομή θεραπεία και την ορμονοθεραπεία είναι υψηλή σε ασθενείς που διαγνώστηκαν με εντοπισμένο και ανδρογόνα-εξαρτώμενων καρκίνων. Ωστόσο, η εξέλιξη σε ορμονοάντοχου καρκίνους προστάτη (HRPC) και /ή οστικές μεταστάσεις σχετίζεται με την υποτροπή της νόσου και την κακή επιβίωση του ασθενούς [2-4]. Πράγματι, η πρόοδος του καρκίνου του προστάτη σε ανδρογόνο ανεξαρτησία παραμένει ένα βασικό εμπόδιο για τη βελτίωση της επιβίωσης των ασθενών, δεδομένου ότι σχετίζεται με πολύπλοκες υποκείμενες κυτταρικές αλλαγές.

Docetaxel θεωρείται ως το πρότυπο χημειοθεραπευτικό παράγοντα για ασθενείς με HRPC και σε εκείνες με κλινικές ενδείξεις μεταστάσεων. Έχει αναφερθεί για τη βελτίωση της ποιότητας ζωής και προσφέρει ανακούφιση από τον πόνο, αλλά σχετίζεται με την ελάχιστη διάμεσο ποσοστό επιβίωσης μόνο 12 έως 19 μήνες από την έναρξη της θεραπείας. Αυτό τονίζει την ανάγκη για μελέτες διερεύνησης πώς να βελτιστοποιήσει τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά σχήματα σε ασθενείς με HRPC ή προχωρημένο προστάτη.

Η διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που αποτελούν τη βάση του προστάτη εξέλιξη, θα συμβάλει στον εντοπισμό των πιθανών θεραπευτικών γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στην απόπτωση. Θα βοηθήσει επίσης να διευκρινιστεί ο μηχανισμός που ευθύνεται για την ανάπτυξη και την κυτταρική σηματοδότηση [5-8]. EGFR και COX-2 έχουν αμφότερα δειχθεί ότι συμβάλλουν στην βιώσιμη ανάπτυξη σε προηγμένες HRPC είτε στην απουσία ή την παρουσία χαμηλών συγκεντρώσεων των ανδρογόνων [9-11].

EGFR συχνά υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους καρκίνους. Τα προκλινικά δεδομένα υποδηλώνουν ότι οι οδοί σηματοδότησης EGFR ενεργοποιούν τους υποδοχείς ανδρογόνων σε συνθήκες κλινικής στέρησης ανδρογόνων. Αυτό συνδέεται με τη μετάβαση από το ανδρογόνο αποκρίνεται στην ορμόνη-πυρίμαχων φαινότυπο, με αποτέλεσμα μια πιο επιθετική κλινική έκβαση [10,11]. Ο EGFR επομένως, θεωρείται ότι είναι πρωταρχικής θεραπευτική σημασία, λόγω της υπερέκφρασης του στην προχωρημένη PCa και ο ρόλος της ως ένας στόχος φαρμάκου. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του EGFR ενισχύει την ικανότητα των υποδοχέων των ανδρογόνων για την αύξηση του πολλαπλασιασμού PCa. Αντιθέτως, η αναστολή του EGFR δείχθηκε να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της docetaxel στη θεραπεία του μεταστατικού προστάτη [12,13].

κυκλοοξυγενάσες καταλύουν το σχηματισμό των προσταγλανδινών που εμπλέκονται στην έναρξη ή /και την εξέλιξη του όγκου. Η COX-2 έχει αποδειχθεί ότι προάγει τη φλεγμονή, η οποία μπορεί να συμβάλλουν άμεσα στην ανάπτυξη του προστάτη [14]. Έχει επίσης δειχθεί ότι η COX-2 που προκαλείται από PGE2 ενεργοποιεί κυτταρική σηματοδότηση που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό και προάγει έτσι άμεσα την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου. Άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι η COX-2 υπερεκφράζεται στον προστάτη και ότι το επίπεδο της έκφρασης συσχετίζεται με σκορ Gleason, την εξέλιξη του καρκίνου και στην επανάληψη [15,16]. Τα τελευταία χρόνια, έχουν αναστολείς COX-2 σε συνδυασμό με χημειοθεραπευτικά φάρμακα έχουν αξιολογηθεί σε θεραπεία του προχωρημένου προστάτη. Αυτοί οι παράγοντες αυξάνουν σημαντικά την αποτελεσματικότητα των ανδρογόνων απόσυρσης και την προώθηση της επίλυσης των σκελετικών βλαβών [17,18]. Είναι γενικά αποδεκτό ότι η COX-2 συμβάλλει προς PCA και υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις που να δείχνουν ότι οι αναστολείς COX-2 μπορεί να είναι ευεργετική στη θεραπεία της ΣΕΣΣ.

Προηγούμενες μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι η υψηλή έκφραση COX-2 σε προστάτη συσχετίζεται με αντοχή docetaxel, και ότι η αναστολή της COX-2 επιβραδύνει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και βελτιώνει την αποτελεσματικότητα της docetaxel [19,20]. Με βάση αυτές τις παρατηρήσεις, είναι πιθανό ότι η προσθήκη εκλεκτικοί αναστολείς του EGFR και COX-2 μπορεί να αντιπροσωπεύει μία νέα θεραπευτική προσέγγιση για τη βελτίωση της θεραπείας του μεταστατικού προστάτη. Στην παρούσα μελέτη, υποθέσαμε ότι ταυτόχρονη δέσμευση του EGFR και οδών COX-2 χρησιμοποιώντας gefitinib και NS-398 θα μπορούσε να βελτιώσει τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα του docetaxel σε προχωρημένο PCa in vitro και σε in vivo. Η αντι-πολλαπλασιαστική, αντι-επεμβατική, και επαγωγή απόπτωσης αποτελέσματα των τριών παραγόντων, μεμονωμένα και σε συνδυασμό, προσδιορίστηκαν in vitro και σε in vivo καθώς και οι βασικές μοριακούς μηχανισμούς ερευνήθηκαν.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλα τα πειράματα με ζώα διεξήχθησαν με την έγκριση της Nanjing University Επιτροπής Ιατρικής Δεοντολογίας. Η κλινική έρευνα εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε για όλα τα θέματα πριν από τη συμμετοχή στη μελέτη.

δείγματα όγκων και κυτταρικές σειρές

δείγματα προστάτη από 37 πρωτοβάθμια περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Σε όλες τις περιπτώσεις δύο ανεξάρτητους παθολόγους επανεξέτασε τα δείγματα για τον αποκλεισμό άλλων παθολογικών τύπων. Όλα τα δείγματα που λαμβάνονται με διουρηθρική εκτομή του προστάτη, ριζική προστατεκτομή ή βελόνα βιοψίας στο Nanjing BenQ Νοσοκομείο και Nanjing Πρώτη Νοσοκομείο, μεταξύ 2010 και 2012. Η χειρουργική σταδιοποίηση των όγκων έγινε σύμφωνα με τα κριτήρια Jewett-Whitmore. Η διάμεση ηλικία των ασθενών ήταν 69 έτη (εύρος 58 έως 79 ετών).

Το ανθρώπινο προστάτη καρκινικές κυτταρικές γραμμές LNCaP, PC-3M και DU-145 που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection και διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 μέσο καλλιέργειας που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου, 26 mmol /L Ν &

2CO

3 (ρΗ 7,4), 1% Ε-γλουταμίνη, και αντιβιοτικά (100 IU /mL πενικιλλίνη-100 μg /mL στρεπτομυκίνη) στους 37 ° C σε 5% CO

2. RPMI 1640 και άλλα υλικά καλλιέργειας που παρέχονται από την Gibco.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Gefitinib, NS-398, docetaxel και ΜΤΤ αγοράστηκαν από Sigma. Annexin V-FITC παρασχέθηκε από Gibco. Αντισώματα κατά της ανθρώπινης VEGF και ΜΜΡ-9 ελήφθησαν από R &? D Σύστημα και Bioworld, αντίστοιχα. Αντιανθρώπινο μονοκλωνικό COX-2, μονοκλωνικό EGFR και μονοκλωνικά αντισώματα VEGF λήφθηκαν από Santa Cruz. Αντίσωμα έναντι της ανθρώπινης Ρ65 NF-κΒ αγοράστηκε από Abcam. Τα μονοκλωνικά αντισώματα προς GAPDH (Bioworld) και β-ακτίνης (Sigma) χρησιμοποιήθηκαν ως πειραματικές μάρτυρες.

Ανοσοϊστοχημεία

Οι ιστολογικές τομές (4 μm) σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημική χρώση. Πριν από τη χρώση πρωτογενούς αντισώματος, τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με κιτρικό οξύ ή ρυθμιστικό διάλυμα αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ σε μια χύτρα ταχύτητας για ανάκτηση αντιγόνου. Όλα τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ήταν βιοτινυλιωμένα μονοκλωνικά αντισώματα.

Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποσβέστηκε με χρήση 3% Η

2O

2 αντιδραστήριο αποκλεισμού για 10 λεπτά. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C όλη τη νύκτα, πριν από την ανοσοχρώση με σύμπλεγμα υπεροξειδάσης αβιδίνης-βιοτίνης (100: l). Τα πλακίδια χρωματίστηκαν με διαμινοβενζιδίνη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (ϋΑΚΟ, CA). Οι πλάκες ξεπλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο μετά από κάθε στάδιο χρώση. Οι τομές χρωματίστηκαν με αραίωση 1: του αντισώματος 200 κατά του EGFR (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), και 1: 100 αραίωση του αντισώματος έναντι της COX-2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), αντίστοιχα.

Τα βαμμένα πλακίδια αξιολογήθηκαν ποσοτικά ή ημι-ποσοτικά από δύο ανεξάρτητους παθολόγους που ήταν τυφλοί με τα κλινικά δεδομένα. Ο διάμεσος αριθμός των καρκινικών κυττάρων χρωματίζονται θετικά για την COX-2 και EGFR ήταν 10% σε κάθε περίπτωση. Το ποσοστό των θετικών κυττάρων βάφονται με ειδικά αντισώματα που παρατηρείται από δύο παθολόγους ήταν συνεπή και προσδιορίστηκαν οι μέσες τιμές.

Πολιτισμός και τη βιωσιμότητα των κυττάρων Αναλύσεις

Τα αποτελέσματα των μεμονωμένων παραγόντων, και των διπλών και τριπλών συνδυασμών παραγόντων σε κυτταρικές σειρές DU-145 PC-3M και προσδιορίστηκαν μετά από 48 ώρες έκθεση σε 3- (4,5-dimetylthiazol-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ). Αναπαραγωγιμότητα επιβεβαιώθηκε σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. Για να δοκιμαστεί η βιωσιμότητα μετά την έκθεση στο gefitinib, NS-398 και μόνοι ή σε συνδυασμό ντοσεταξέλη, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα περίπου 5 × 10

4 /mL (σε 100 μL μέσου ανά φρεάτιο) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Με βάση προηγούμενες μελέτες, επιλέξαμε συγκεντρώσεις 20 μmol /L gefitinib, 100 μmol /L) NS-398 και 0.01μmol /L docetaxel για όλες τις δοκιμασίες. Τα κύτταρα εκτίθενται σε DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως δείγματα αναφοράς άνευ αγωγής.

In vitro εισβολή

δοκιμασία

Η επεμβατική δυναμικό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη εκτιμήθηκε από την ικανότητά τους να διεισδύουν ένας θάλαμος εισβολή Matrigel περιλαμβάνει μία μεμβράνη τερεφθαλικού πολυαιθυλενίου μέγεθος 8 μm πόρου, και ένα λεπτό στρώμα Matrigel μήτρα. PC-3M και DU-145 κύτταρα ελέγχου ή τα κύτταρα προηγουμένως εκτέθηκαν για 24 ώρες για να gefitinib (10 μmol /L), NS-398 (50 μmol /L), ή docetaxel (0,005 μmol /L) μόνες ή σε συνδυασμό χρησιμοποιήθηκαν σε η δοκιμασία κύτταρο εισβολή. Σε κάθε πείραμα, 5 × 10

4 κύτταρα /mL ανά φρεάτιο, σε μέσο χωρίς φάρμακα (έλεγχος) ή περιέχουν τα φάρμακα, φορτώθηκαν στην κορυφή του θαλάμου εισβολή Matrigel κυττάρων, ή εντός του θαλάμου ένθετο ελέγχου χωρίς Matrigel, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από επώαση για 24 ώρες στους 37 ° C, τα εισβάλλοντα κύτταρα επίτευξη του κάτω θάλαμο βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν ,, με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Ο αριθμός των κυττάρων που εισβάλλουν εκτιμήθηκε ως ο μέσος αριθμός εισβάλλουν μέσω της Matrigel προστεθεί μεμβράνη σε πέντε τυχαία πεδία μικροσκοπίου.

κυτοφθορομετρικής ροής

αναλύσεις

Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε gefitinib (20 μmol /L) , NS-398 (100 μmol /L), ή docetaxel (0,01 μmol /L), μόνα τους ή σε συνδυασμό. Μετά 24 ώρες επώασης, τόσο η ανάπτυξη και πλένουμε μέσον σώθηκαν, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη. Τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν και τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 400 μΐ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) διάλυμα (50 μg /mL ΡΙ, 0.1% Triton Χ-100, και 0,1% κιτρικό νάτριο σε PBS). Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C στο σκοτάδι πριν από την ανάλυση. Η κυτταρομετρία ροής προσδιορίστηκε ποσοτικά για να προσδιοριστεί το ποσοστό των κυττάρων που περιέχουν αποπτωτικά, νεκρωτικά κύτταρα.

αντίστροφη μεταγραφή και PCR πραγματικού χρόνου

PC-3M και DU-145 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 1% FBS είχαν εκτεθεί για 24 ώρες για να gefitinib (20 μmol /L), NS-398 (100 μmol /L), ή docetaxel (0,01 μmol /L) μόνες τους ή σε συνδυασμό. Τα κύτταρα εκτίθενται σε DMSO ως όχημα, χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ αντιδραστήριο. Ένα μικρογραμμάριο RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ένα σύστημα αντίστροφης μεταγραφής (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Real-time PCR χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης mRNA. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν έχουν ως εξής: ΜΜΡ9 (εμπρός: 5′-TC GAACTTTGACAGCGACAAGA-3 ‘και αντίστροφη 5′-TCAGGGCGAGGACCATAGAG’-3), NF-κΒ (εμπρός: 5′-TGGACCGCTTGGGTAACTCT-3′ και αντίστροφη 5′-GGCTATTGCTCATCA TGGCTAG-3 ‘), VEGF (εμπρός: 5′-CTATCAGCGCAGCTACTGCCAT-3′ και αντίστροφη 5’-GCACACAGGATGGCTTGAAGAT-3 ‘). GADPH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για να διορθώσει το δυναμικό διακύμανση RNA φόρτωσης. Στόχου και GADPH γονίδια λειτουργούν υπό τους ίδιους όρους. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε έναν όγκο 20 μL που περιέχει το cDNA του δείγματος, TaqMan γρήγορη καθολική PCR βασικού μείγματος, εκκινητές και ανιχνευτές. Οι συνθήκες PCR ήταν 40 έως 45 κύκλους στους 95 ° C για 15 s ακολουθούμενο από 1 λεπτό στους κύκλους 59 έως 65 ° C.

Western

δοκιμασία κηλίδος

PC-3M και DU-145 κύτταρα εκτεθειμένα στα φάρμακα που περιγράφονται παραπάνω συλλέχθηκαν με απόξεση από τα φρεάτια και τα εκπλύματα δύο φορές με ψυχρό PBS. Το κυτταρικό ίζημα αιωρήθηκε σε 125 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 6.8), κατεργασία με υπερήχους για 10 s πριν από την προσθήκη ενός ίσου όγκου 4% SDS. Τα προϊόντα λύσης βρασμένο για 10 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία bicinchoninic πρωτεΐνη οξύ (Pierce, Rockford, IL).

Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη, μπλοκάρει, και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα ως εξής: VEGF αραιωμένο 1: 1000 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA, USA), MMP -9 (4 μg /mL, Κ &? D Systems), ΝΡ-κΒ ((Abcam Ltd., UK).), και β-ακτίνη 1: 10.000 (Sigma) /GADPH 1: 10.000 (Bioworld). Η μεμβράνη στη συνέχεια πλύθηκε και επωάστηκε με δευτερεύοντα αντισώματα (Bioworld) συζευγμένο με υπεροξειδάση. ανίχνευση της πρωτεΐνης πραγματοποιείται με τη χρήση ενός συστήματος ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Thermo).

Τα πειράματα σε ζώα

Τέσσερις έως 6-εβδομάδων BALB /c ηυ /ηυ ελήφθησαν από την SLAC Laboratory Animal Co. Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Οι όγκοι αναπτύχθηκαν σε διμερές σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς με υποδόρια ένεση 5 × 10

4-10

5 κύτταρα PC-3M (σε PBS) ανά ζώο. Καθιερωμένη όγκους 0,2 εκατοστά

3 σε διάμετρο ανιχνεύθηκαν μετά από 7 ημέρες. Οι ποντικοί στη συνέχεια τυχαιοποιήθηκαν στις ακόλουθες ομάδες των έξι: μη επεξεργασμένους μάρτυρες, gefitinib (50 mg /kg, qd, ρο), NS-398 (200 mg /kg, qd, ρο), docetaxel (0,05 mg /kg, qd, po), gefitinib και docetaxel, NS-398 και docetaxel, gefitinib, NS-398 και docetaxel.

Οι μετρήσεις του όγκου διεξήχθησαν σε όλη τη διάρκεια των περιόδων θεραπείας και παρατήρησης. Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: π /6 × μεγαλύτερη διάμετρο

×

(μικρότερη διάμετρο)

2. Η χειρουργική επέμβαση πραγματοποιήθηκε υπό κεταμίνη /ξυλαζίνη αναισθησία, και έγινε κάθε δυνατή προσπάθεια για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

Στατιστική Ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του SPSS έκδοση 16.0 του λογισμικού. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται μέσα και οι τυπικές αποκλίσεις (± SD). Ο δείκτης για τη θεραπεία συνδυασμού σε PC-3M και DU-145 κύτταρα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό CalcuSyn. Σύμφωνα με τη μέθοδο αυτή, οι τιμές CI της & lt? 1, 1 και & gt? 1 απεικονίζονται αντίστοιχα συνέργια, προσθετικότητα και τον ανταγωνισμό [21]

in vitro και in vivo δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας έλεγχος τ.. EGFR και COX-2 έκφραση σε μη μεταστατικό και μεταστατικούς ιστούς προστάτη συγκρίθηκε χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square του Pearson του .. Οι τιμές των p & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

EGFR. και COX-2 επίπεδα πρωτεΐνης σε προστάτη καρκινικούς ιστούς

έκφραση EGFR ήταν θετική σε επτά μη μεταστατικό ιστούς προστάτη (43,8%) και σε 18 (85,7%) δείγματα ιστού από ασθενή με μεταστατικό προστάτη (

P

& lt? 0,01). ένταση χρώσης για COX-2 παρατηρήθηκε σε 18 μεταστατικό (85,7%) και εννέα μη μεταστατικού ιστούς προστάτη (56,3%? Ρ = 0,11). EGFR και COX-2 θετικά συνέκφραση βρέθηκε σε 16 μεταστατικούς ιστούς (76,2%) και στις τέσσερις (25,0%) μη μεταστατικού ιστούς προστάτη (Ρ & lt? 0,01). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 1 και τον Πίνακα 1.

Οι τομές εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο, και ανοσοαντιδραστικότητα υποδείχθηκε από σκούρο καφέ χρώση. Αντιπροσωπευτικές τομές των δειγμάτων καρκίνου του προστάτη ιστών που λαμβάνονται στο αρχικό μεγεθύνσεις × 200 και 400 ×.

Η Σκηνή

n

Αριθμός (%) ασθενών

Η EGFR + COX- 2+

EGFR + COX-2

EGFR-COX-2 +

EGFR-COX-2

Α + β164 (25,0%) 3 (18,8%) 5 (31,2%) 4 (25,0%): C + D2116 (76,2%) 2 (9,5%) 2 (9,5%) 1 (4,8%) Πίνακας 1. Η θετική έκφραση του EGFR και COX-2 σε μη μεταστατικό και μεταστατικό καρκίνο του προστάτη.

παθολογική σταδιοποίηση του προστάτη ορίστηκε σύμφωνα με το σύστημα σταδιοποίησης Whitmore-Jewett ως followsA (παρεμπιπτόντως ανακαλύψει PCA), Β (περιορισμένη PCA), C (εισβολή σε παρακείμενα όργανα) D (απομακρυσμένες μεταστάσεις ή συμμετοχή λεμφαδένων) .Jewett στάδιο Α και Β ορίστηκε ως μη μεταστατικό στάδιο και Γ ή Δ, όπως μεταστατικό. CSV Λήψη CSV

Βασική έκφραση και ενεργοποίηση του EGFR και COX-2 πρωτεΐνης σε PC-3M και DU-145 κύτταρα

Το βασικό επίπεδο του συνολικού EGFR, ρ-EGFR και COX-2 μετρήθηκε σε PC-3M και DU-145 κύτταρα. Στη συνέχεια ερευνήθηκε κατά πόσον EGF συσχετίστηκε με αύξηση των επιπέδων αυτών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ενεργοποιημένη /φωσφορυλιωμένη EGFR (ρ-EGFR), EGFR και πρωτεϊνών COX-2 εκφράστηκαν στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2Α). έκφραση της COX-2 ρ-EGFR και αυξήθηκαν σημαντικά στις δύο κυτταρικές σειρές με την προσθήκη του EGF, αλλά η έκφραση EGFR ήταν αμετάβλητη. Η αλλαγή στην αναλογία ρ-EGFR /EGFR ήταν δοσοεξαρτώμενη (Εικόνα 2Β).

κύτταρα αναπτύσσονται σε 1% FBS είχαν εκτεθεί σε 0, 10 και 100 ng /mL EGF για 24 ώρες όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι προκύπτουσες κυτταρικές πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και ανάλυση κηλίδος Western για τον προσδιορισμό των επιπέδων πρωτεΐνης του ρ-EGFR, EGFR και COX-2 (Σχήμα 2Α). κηλίδα Western για β-ακτίνη παρουσιάζεται ως έλεγχος φόρτωσης. Το σχετικό επίπεδο πρωτεΐνης για ρ-EGFR /EGFR και COX-2 φαίνεται στο Σχήμα 2Β.

Η

Αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση που προκαλείται από μόνο του ή σε συνδυασμό με gefitinib και NS-398

προσδιορισμοί ΜΤΤ χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση των τριών φαρμάκων μόνος ή σε συνδυασμούς, σε PC-3M και DU-145 κύτταρα. Σε προκαταρκτικά πειράματα, ιδρύσαμε καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης για κάθε φάρμακο για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση που παρήγαγε λιγότερο από 30% αναστολή της ανάπτυξης στα κύτταρα γραμμές προστάτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με βάση αυτές τις καμπύλες, προσδιορίσαμε το ότι οι συγκεντρώσεις του docetaxel (0,01 μmol /L), gefitinib (20 μmol /L), ή NS-398 (100 μmol /L) ήταν κατάλληλες για χρήση στα πειράματα συνδυασμού. Συν-επώαση με gefitinib ή NS-398 ελαφρώς ενισχυμένη την κυτταροτοξική δράση του docetaxel. Ωστόσο, ο συνδυασμός τριών φαρμάκων που προκαλείται από ένα μεγαλύτερο από προσθετικό αποτέλεσμα επί κυτταρικής ανάπτυξης αναστολής στις δύο κυτταρικές σειρές οι οποίες ήταν πολύ πιο έντονη από ό, τι εκείνη που παρατηρείται με κάθε ένα ή δύο συνδυασμούς φαρμάκων (Σχήμα 3). Ανάλυση της θεραπείας συνδυασμού σε PC-3M και DU-145 κύτταρα έδειξαν ότι ο δείκτης συνδυασμού για τον συνδυασμό τριών παραγόντων ήταν & lt? 1 υποδηλώνοντας μια συνεργική επίδραση (Πίνακας 2 και 3)

Η απόκριση συγκέντρωσης-απόκρισης για. κάθε φάρμακο χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση που προκάλεσε μια κατάλληλη αντι-πολλαπλασιαστική δράση για χρήση σε θεραπεία συνδυασμού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε docetaxel (0,01 μmol /L), NS-398 (100 μmol /L) και gefitinib (20 μmol /L) μόνες ή σε συνδυασμό για 24 ώρες. Οι τιμές είναι μέσοι ± SD από τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,005 ***, P & lt? 0.001 σε σύγκριση με τις τιμές ελέγχου. γραμμές

Η Κυττάρων

G (μΜ)

D (nM)

Φα

CI

Ν (μΜ)

D (nM)

Fa

CI

PC-3M1050.2151.1535050.2110.98220100.2801.049100100.3080.72640200.3631.118200200.3881.023DU-1451050.1861.8395050.2640.96620100.2651.114100100.3830.92440200.3251.092200200.5850.956Table 2. Επίδραση της gefitinib (G) ή NS-398 (N) σε συνδυασμό με ντοσεταξέλη (D) στο PC-3M και DU-145 κύτταρα.

CSV Κατεβάστε γραμμές κυττάρων CSV

G (μΜ)

Ν (μΜ)

Dl (nM)

Fa

CI

PC-3M105050.3020.74520100100.4650.71240200200.6610.699DU-145105050.2640.96620100100.4230.78340200200.6210.872Table 3. Επίδραση της gefitinib (G), NS-398 (N) και docetaxel (D) συνδυασμού σε PC-3M και DU-145 κύτταρα.

Θεραπείες συνδυασμού με gefitinib (10, 20, και 40 μΜ), NS- 398 (50, 100, και 200 ​​μΜ), και docetaxel (5, 10, και 20 ηΜ) σε PC-3M και DU-145. Οι κυτταρικές σειρές αξιολογήθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ. FA: Κλάσμα της ανάπτυξης επηρεάζουν κυττάρων φάρμακο εκτίθεται σε σύγκριση με τους μάρτυρες. CI, δείκτης συνδυασμό. Φα και CI υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CalcuSyn. CSV Λήψη CSV

κυτταροτοξική δράση που προκαλείται από docetaxel, gefitinib, και NS-398

κυτταρομετρίας ροής αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της απόπτωσης κυττάρων που προκαλείται από οποιοδήποτε μόνα τους ή σε συνδυασμό φαρμάκου. Ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίσθηκε ποσοτικά (Σχήμα 4Α και C). Τόσο docetaxel και gefitinib, αλλά όχι NS-398, αυξήθηκε ελαφρώς τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με αυτή που παρατηρήθηκε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα προστάτη (Σχήμα 4Β και D). Docetaxel σε συνδυασμό με gefitinib ή NS-398, συνδέθηκε με μια αύξηση στον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων σε σύγκριση με docetaxel (Σχήμα 4Β και D). Ο συνδυασμός τριών φαρμάκων, οδήγησαν σε σημαντικά υψηλότερους αριθμούς αποπτωτικών κυττάρων από οποιοδήποτε μεμονωμένο φάρμακο ή δύο φαρμάκων συνδυασμού (Σχήμα 4Β και D).

Μετά την επώαση με διάφορα φάρμακα, τα κύτταρα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι και αποπτωτικών ποσοστό εκτιμήθηκε με ανάλυση FACS. Α και C: Εκπρόσωπος οικόπεδα dot απεικονίζουν τα δεδομένα κοντά στο μέσο όρο των ομάδων στο Β και το ρυθμό Δ Β και D. Η απόπτωση υπολογίστηκε από UR (μη βιώσιμων αποπτωτικών ή νέκρωση των κυττάρων ρυθμό) και LR (πρώιμων αποπτωτικών ποσοστό των κυττάρων) ένωση. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από τρία ξεχωριστά πειράματα. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,005 ***, P & lt?. 0.001 σε σύγκριση με τις τιμές ελέγχου

Η

Απώλεια της διεισδυτικής ικανότητας που προκαλείται από docetaxel, gefitinib, και NS-398

μία δοκιμασία εισβολής vitro χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η ικανότητα επεμβατικές σε κύτταρα PC-3M και DU145. Η επεμβατική δυναμικό προσδιορίστηκε με υπολογισμό του αριθμού των κυττάρων τα οποία διείσδυσε ένα θάλαμο εισβολή Matrigel. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α και C, έκθεση των κυττάρων σε 0,005 μmol /L docetaxel, 10 μmol /L gefitinib, ή 50 μmol /L NS-398 ανέστειλε σημαντικά την ικανότητά τους επεμβατική (Σχήμα 5Β και D).

κύτταρα ήταν χωρίς θεραπεία (έλεγχος) ή εκτέθηκαν επί 24 ώρες σε 0,005 μmol /L docetaxel (D), 10 mmol /L gefitinib (G) ή 50 μmol /LNS-398 (Ν), μόνα τους ή σε συνδυασμό κατά την διάρκεια in vitro δοκιμασίες εισβολής, πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Transwell δύο σωμάτων θαλάμων όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Στο τέλος της δοκιμασίας 24 ώρες, τα εισβάλλοντα κύτταρα χρωματίστηκαν και μετρήθηκαν με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (χ 200). Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα δείχνουν τον μέσο αριθμό των κυττάρων που εισβάλλουν μέσω της Matrigel προστεθεί μεμβράνη σε πέντε τυχαία πεδία μικροσκοπίου. * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0.005, *** P & lt?. 0.001 σε σύγκριση με τις τιμές ελέγχου

Η

Η έκθεση σε docetaxel σε συνδυασμό με gefitinib ή NS-398 μείωσε σημαντικά τον αριθμό του DU-145 κύτταρα διεισδύουν στην Matrigel σε σύγκριση με docetaxel (Σχήμα 5D), αλλά δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά στα κύτταρα PC-3M (Σχήμα 5Β). Ο συνδυασμός τριών φαρμάκων έδειξαν μια υπερ-προσθετική ανασταλτική επίδραση στην ικανότητα κυτταρικής εισβολής η οποία ήταν ισχυρότερη από οποιονδήποτε συνδυασμό των δύο φαρμάκων (Σχήμα 5Β και D).

ΝΡ-κΒ, ΜΜΡ-9 και η έκφραση του VEGF αλλαγές που προκαλούνται από docetaxel, gefitinib, και NS-398

Η πρωτεΐνη και mRNA και προσδιορίστηκαν ποσοτικά να διερευνήσει κατά πόσον NF-κΒ, MMP-9 και VEGF, συμμετείχαν στις κυτταρικές αποκρίσεις με docetaxel, gefitinib ή NS-398. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 6Α και 6Β, δείχνουν ότι docetaxel, gefitinib και NS-398 κάθε μειωτικά χωριστά NF-κΒ, ΜΜΡ-9 και η έκφραση VEGF mRNA στις δύο κυτταρικές σειρές PCa. έκφραση ΝΡ-κΒ mRNA ήταν πιο έντονα κάτω ρυθμισμένα όταν τα κύτταρα εκτέθηκαν σε συνδυασμούς φαρμάκων. Οι τρεις συνδυασμοί φαρμάκων έδειξαν μια ισχυρότερη ανασταλτική επίδραση από τα δύο συνδυασμούς φαρμάκου (Σχήμα 6Α και Β).

κύτταρα αναπτύσσονται σε 1% FBS εκτέθηκαν σε 0,01 μmol /L docetaxel (D), 20 μmol /L gefitinib (G) or100 μmol /LNS-398 (N), μόνο του ή σε συνδυασμό, ή με DMSO ως έλεγχος για 24 ώρες. ΝΡ-ΚΒ, ΜΜΡ-9 και του mRNA του VEGF (Α και Β) και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (C και D) μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές αναφέρονται ως μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων.

Η

Ούτε gefitinib ούτε NS-398 είχαν οποιαδήποτε επίδραση επί προσθετικό docetaxel επαγόμενη μειορύθμιση της έκφρασης ΜΜΡ-9 και VEGF mRNA (Σχήμα 6Α και Β ). Ωστόσο, η συν-επώαση με τα τρία παράγοντες οδήγησε σε περισσότερες αξιοσημείωτη αναστολή της ΜΜΡ-9 και τα επίπεδα VEGF σε σύγκριση με μονό ή δύο φάρμακα συνδυασμού σε κύτταρα PC-3M (Σχήμα 6Α), αλλά όχι σε DU-145 κύτταρα (Σχήμα 6Β),

κηλίδωση Western αναλήφθηκε για την εκτίμηση των επιπέδων της πρωτεΐνης του ΝΡ-κΒ ΜΜΡ-9 και VEGF μετά από έκθεση σε κάθε ένα από τα φάρμακα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6C και 6D, η προσθήκη docetaxel στο gefitinib και /ή NS-398 σε διπλές και τριπλές συνδυασμός αλλάξει ΝΡ-κΒ, ΜΜΡ-9 και τα επίπεδα πρωτεΐνης VEGF στις δύο κυτταρικές σειρές. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σε γενικές γραμμές σύμφωνο με τις αλλαγές mRNA εκτός από τις αλλαγές στο NF-κΒ πρωτεΐνη μετά από έκθεση σε ένα συνδυασμό docetaxel και NS-398, (Σχήμα 6C και D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ευεργετική απόκριση των κυττάρων PC-3M την έκθεση στην docetaxel, gefitinib και NS-398 συνδυασμό, επηρεάζεται από μια μείωση NF-κΒ, ΜΜΡ-9 και VEGF (Σχήμα 6C).

Επιδράσεις της gefitinib, NS-398 και δοκεταξέλης στην ανάπτυξη του όγκου του προστάτη in vivo

docetaxel σε συνδυασμό με gefitinib ή NS-398 ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και σε σημαντικά μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι σε μη επεξεργασμένους μάρτυρες ή ζώα που έλαβαν με ένα μόνο φάρμακο (Σχήμα 7). Σε αυτές τις ομάδες διπλού συνδυασμού μόνο μια μέτρια αύξηση στο μέγεθος του όγκου καταγράφηκε στο τέλος του πειράματος 6 εβδομάδες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου και 2 εβδομάδες μετά τη διακοπή της θεραπείας. Συνδυασμένη θεραπεία με οποιαδήποτε δύο φάρμακα ή και με τα τρία φάρμακα ήταν καλά ανεκτό? Παρατηρήθηκαν καμία απώλεια βάρους ή άλλα σημεία οξείας ή καθυστερημένη τοξικότητα.

Τα ποντίκια ενέθηκαν στο πλευρό ραχιαία με κύτταρα PC3M. Μετά από 7 ημέρες (μέσο μέγεθος όγκου: 0,2 cm

3), τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Αλλαγή στον όγκο του όγκου αξιολογήθηκε μετά την έκθεση σε Doc, gefitinib και NS-398 μόνο ή σε συνδυασμό. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD.

Η

Συζήτηση

Η docetaxel διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη θεραπεία του προχωρημένου προστάτη. Ωστόσο, η μακροχρόνια θεραπεία συχνά οδηγεί σε παρενέργειες και η αντίσταση χημειοθεραπεία, με αποτέλεσμα την υποτροπή της νόσου και την κακή επιβίωση. Σε μια προσπάθεια να ξεπεράσει την αντίσταση του φαρμάκου, πρόσφατες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην χαμηλή δόση docetaxel σε συνδυασμό με άλλα φάρμακα ή για φίμωση μερικά γονίδια [22-25].

EGFR και COX-2 είναι υπερ-εκφράζεται σε αριθμό κακοηθειών συμπεριλαμβανομένου του προστάτη. Ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι EGFR και COX-2 δραστηριότητες σηματοδότηση παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη των κακοήθων νόσων. Και οι δύο οδοί, ως εκ τούτου, να παρέχει ελκυστικούς στόχους για αντικαρκινική θεραπεία και χημειοπροφύλαξη [5-8,26,27]. Κατά συνέπεια, EGFR και αναστολείς COX-2 έχουν διερευνηθεί για τη χημειοθεραπεία και την πρόληψη του καρκίνου [28-31].

Η υπερέκφραση του EGFR και COX-2 και την αλληλεπίδραση μεταξύ σηματοδότηση EGFR και δραστικότητα COX-2 έχουν ενοχοποιηθεί ως αιτιολογικοί παράγοντες για τον καρκίνο [32,33]. Σε μας in vitro και in vivo μελέτες, έχουμε επιδείξει σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του EGFR και της έκφρασης COX-2 σε προχωρημένο ιστό προστάτη (Πίνακας 1) και σε αντίστοιχες κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2). Έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι η ενεργοποίηση ή η υπερέκφραση του EGFR [12,13] και COX-2 [20] συσχετίζεται με αντοχή docetaxel. Αυτό μας οδήγησε να υποθέσουμε ότι, ταυτόχρονα, τη στόχευση του EGFR και COX-2 μπορεί να είναι μια πιο αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική για την αντιμετώπιση αντίστασης docetaxel από στοχεύουν είτε μονοπατιού σηματοδότησης ξεχωριστά.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, ταυτόχρονα, μπλοκάροντας EGFR με gefitinib και COX-2 με NS-398 σε κύτταρα προστάτη υποβάλλονται σε docetaxel χαμηλής δόσης οδήγησε σε μια ευεργετική επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων (Σχήμα 3). ανάλυση του μέσου αποτελέσματος χρησιμοποιώντας τη μέθοδο CI των Chou και Talalay επιβεβαίωσε μια μετρίως συνεργική αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των τριών φαρμάκων σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές προστάτη (πίνακας 2 και 3). Στην απόπτωση των κυττάρων και δοκιμασίες εισβολή το συνδυασμένο αποτέλεσμα των τριών φαρμάκων ήταν ελαφρώς μεγαλύτερη από προσθετική στις δύο κυτταρικές σειρές. Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με τα ευρήματα της δοκιμής πολλαπλασιασμού ΜΤΤ, υποδηλώνοντας ότι αυτό το νέο συνδυασμό των φαρμάκων μπορεί να είναι αποτελεσματική στην πρόληψη της ανάπτυξης του όγκου και απομακρυσμένες μεταστάσεις.

έδειξαν επίσης ότι ο συνδυασμός τριών φαρμάκων συσχετίστηκε με σημαντική κυτταρική απόπτωση (Σχήμα 4) και την απώλεια της εν τω βάθει ικανότητα (Σχήμα 5). Σε μια προηγούμενη μελέτη gefitinib δεν είχε καμία δραστηριότητα ως μονοθεραπεία, αλλά ο συνδυασμός του με docetaxel συνδέθηκε με το ίδιο ποσοστό ανταπόκρισης σε προχωρημένο προστάτη ως μονοθεραπεία με docetaxel [7]. Έχει επίσης δειχθεί ότι η αναστολή της κυκλοοξυγενάσης-2 αυξάνει docetaxel επαγόμενη απόπτωση [17] η οποία είναι συνεπής με τα αποτελέσματα της μελέτης μας. Ωστόσο, η μακροχρόνια, υψηλής δόσης θεραπεία με αυτό το συνδυασμό σχετίζεται με την τοξικότητα και παρενέργειες που αποτρέπει την χρήση του στην κλινική πρακτική. docetaxel Υψηλή δόση συνδέεται με τον τραυματισμό του νευρικού συστήματος, αιμοποιητικών καταστολή και χημειοαντίσταση που το καθιστά κατάλληλο για un πολλούς ασθενείς με προχωρημένη νόσο

Είναι σημαντικό, δείξαμε ότι η προσθήκη ενός αναστολέα EGFR και COX-2 ειδικό αναστολέα έναντι των χαμηλών δόσεων σχήματα docetaxel μπορεί να παρέχει μια στρατηγική για τη μείωση της δόσης που σχετίζονται με παρενέργειες. Ταυτόχρονα στοχεύει EGFR και COX-2 φαίνεται να ευαισθητοποιήσει κύτταρα προστάτη στις επιπτώσεις της docetaxel in vitro. Τα αποτελέσματά μας in vivo ήταν σύμφωνες με αυτές τις in vitro ευρήματα, υποδεικνύοντας ότι η συνδυασμένη θεραπεία είναι ανώτερη από μονής ή θεραπεία διπλού παράγοντα. Ο συνδυασμός των δύο οποιωνδήποτε φαρμάκων, ή και τα τρία φάρμακα, ήταν καλά ανεκτή. Αριθ οξεία ή καθυστερημένη τοξικότητα παρατηρήθηκε σε οποιοδήποτε από τα ζώα.