Αφηρημένο

Στην περίπτωση του καρκίνου του παγκρέατος, υπάρχει μια σαφής ανικανοποίητη ανάγκη για την αναγνώριση νέων δεικτών ορού είτε για την έγκαιρη διάγνωση, θεραπευτική διαστρωμάτωση ή παρακολούθηση του ασθενούς. Πρωτεομική ανάλυση των κυττάρων του όγκου secretomes είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για να υποδείξει πρωτεΐνες που απελευθερώνονται από κύτταρα όγκου

in vitro

. Εξωτομέα αποβολή διαμεμβρανικών πρωτεϊνών έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι συμβάλλουν σημαντικά κλάσματα τα secretomes των καρκινικών κυττάρων και να παράγουν πολύτιμα βιοδείκτες ορού. Εδώ έχουμε εισαγάγει μια διαλυτή μορφή του γίγαντα καντερίνης FAT1 ως νέο υποψήφιο βιοδείκτη. FAT1 έκφρασης και πρωτεολυτική επεξεργασία αναλύθηκε με φασματοσκοπία μάζης και κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές σε σύγκριση με την ανθρώπινη παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα. έκφραση RNA σε ιστούς του καρκίνου εκτιμήθηκε από

in silico

ανάλυση των δημοσίως διαθέσιμων δεδομένων μικροσυστοιχιών. Εμπλοκή των ADAM10 (Α Ντισιντεγκρίνη και μεταλλοπρωτεϊνάση πρωτεΐνη που περιέχει την περιοχή 10) σε FAT1 εξωτομέα αποβολή αναλύθηκε με χημική αναστολή και knockdown πειράματα. Ένα σάντουιτς ELISA αναπτύχθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων του διαλυτού FAT1 σε δείγματα ορού. Στην παρούσα έκθεση περιγράφουμε την απελευθέρωση υψηλών επιπέδων του εξωτερικού τομέα της FAT1 καντερίνης στα secretomes των ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων

in vitro

, μια διαδικασία που διαμεσολαβείται από ADAM10. Επιβεβαιώνουμε την πλήρους μήκους και επεξεργασία ετεροδιμερής μορφή FAT1 εκφράζεται επί της μεμβράνης πλάσματος και δείχνουν επίσης την ρ60 Ο-τερματικό διαμεμβράνης απομεινάρι θραύσμα που αντιστοιχεί στην εξωτομέα υπόστεγο. FAT1 και sheddase ADAM10 του υπερεκφράζονται σε παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα και εξωτομέα απόπτωση επίσης ανακεφαλαιώνει

in vivo

οδηγώντας σε αυξημένα επίπεδα ορού FAT1 σε ορισμένους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος. Προτείνουμε ότι οι διαλυτές FAT1 μπορεί να βρει εφαρμογή ως δείκτης για την παρακολούθηση των ασθενών συμπληρώνει αντιγόνο υδατάνθρακα 19-9 (CA19-9). Επιπλέον, λεπτομερής ανάλυση των διαφόρων επεξεργασμένης πρωτεΐνης ισομορφών του καταστολέα υποψηφίου όγκου FAT1 μπορεί επίσης να συμβάλει στην κατανόηση της κυτταρικής βιολογίας και συμπεριφοράς του όγκου

Παράθεση:. Wojtalewicz Ν, Sadeqzadeh Ε, Weiß JV, Tehrani ΜΜ, Klein-Scory S, Hahn S, et al. (2014) μια διαλυτή μορφή της Giant καδχερίνη FAT1 απελευθερώνεται από τα κύτταρα καρκίνο του παγκρέατος από ADAM10 Mediated εξωτομέα Περικοπής. PLoS ONE 9 (3): e90461. doi: 10.1371 /journal.pone.0090461

Επιμέλεια: Ανδρέας-Κλαύδιος Hoffmann, της Δυτικής Γερμανίας Κέντρο Καρκίνου, Γερμανία

Ελήφθη: 11 του Οκτώβρη του 2013? Αποδεκτές: 28 Ιαν 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Wojtalewicz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Bundesministerium für Bildung und Forschung, πρόγραμμα NGFN Plus, 01GS08117 (σε MS) και 01GS08118 (με IS-W) και με επιχορήγηση από το Μεταγραφική Cancer Research Unit Hunter (σε RFT). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα είναι η πιο συχνή κακοήθης όγκος του παγκρέατος και είναι η τέταρτη κατετάγη αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο. Θεωρείται η πιο επιθετική συμπαγής όγκος, ο ρυθμός θνησιμότητας από καρκίνο του παγκρέατος είναι υψηλή με ποσοστά επιβίωσης 5-χρόνια λιγότερο από το 5% [1], [2]. Επί του παρόντος, μόνο χειρουργική προσφέρει κάθε δυνατότητα για θεραπεία, αλλά εκτομή είναι δυνατή μόνο σε 15-20% των ασθενών. Ως εκ τούτου, έγκαιρη ανίχνευση του καρκίνου του παγκρέατος είναι απαραίτητη για τη βελτίωση της υγείας των ασθενών.

Ορός βιοδείκτες είναι ιδιαίτερα επιθυμητή για την έγκαιρη διάγνωση, θεραπευτική διαστρωμάτωση και την παρακολούθηση των ασθενών. Στο πλαίσιο του καρκίνου του παγκρέατος το αντιγόνο υδατάνθρακα 19-9 (CA19-9), επίσης γνωστή ως σιαλυλ Lewis αντιγόνο ομάδας αίματος, είναι η κύρια βιοδείκτης ορός χρησιμοποιείται κλινικά [3]. δοκιμασίες Ορός για CA19-9 έχουν περιορισμένη διαγνωστική αξία και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια δοκιμασία διαλογής μόνο ([4] και παραπομπές εκεί), αλλά παρέχουν σημαντικές πληροφορίες σε σχέση με την πρόγνωση, απόκριση σε χημειοθεραπεία και ως μια πρώιμη ένδειξη του μετεγχειρητικού επανάληψη . Ο σειριακός προσδιορισμός των επιπέδων CA19-9 μπορεί να εντοπίσει την υποτροπή της νόσου μήνες πριν από την κλινική ή ακτινολογική απόδειξη. Επιπλέον, η μείωση του CA19-9 σε απόκριση σε χημειοθεραπεία μπορεί να χρησιμεύσει ως υποκατάστατο δείκτη για κλινική ανταπόκριση [4] (για ανασκόπηση βλέπε [5] – [7]). Ωστόσο, αρκετές συγχυτικές μεταβλητές περιορίζουν την κλινική χρησιμότητα της CA19-9.

Τα υψηλότερα επίπεδα CA19-9 ανιχνεύονται σε ασθενείς με απόφραξη των χοληφόρων, ανεξάρτητα από το αν απόφραξη οφείλεται σε καρκίνο ή σε καλοήθη αίτια [8], [9]. Αυξημένα επίπεδα CA19-9 συνδέονται επίσης με παγκρεατίτιδα, κίρρωση του ήπατος, χολαγγειίτιδα και πολλαπλές αδενοκαρκινώματα του άλλου τύπου, π.χ. καρκίνο του παχέος εντέρου. Είναι σημαντικό ότι, η έκφραση του CA19-9 εξαρτάται από Lewis θετικό φαινότυπο, με ψευδή κοινά αρνητικά αποτελέσματα ως επί το πλείστον οφείλεται σε περίπου 7-10% των Καυκάσιων και έως 20% των Αφρικανών είναι

Lewis

αντιγόνο αρνητική όπου CA19- 9 είναι μη ανιχνεύσιμη, ανεξάρτητα από το φορτίο του όγκου [10], [11]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια σαφής ανικανοποίητη ανάγκη για την αναγνώριση νέων δεικτών ορού είτε για την έγκαιρη διάγνωση, θεραπευτική διαστρωμάτωση ή παρακολούθησης ασθενών που έχουν αυξημένη χρησιμότητα ή να το συμπληρώσει με CA19-9 ή άλλους δείκτες του ορού [8].

Μια προσέγγιση για βιοδεικτών ανακάλυψη ότι εμείς και άλλοι έχουν χρησιμοποιήσει, είναι η ανάκριση του πλήρους ρεπερτορίου πρωτεϊνών που απελευθερώνονται από τα καρκινικά κύτταρα

in vitro

– το secretome καρκινικών κυττάρων [12] – [15]. Πρωτεομικής αναλύσεις secretomes έχουν βρει χιλιάδες πρωτεΐνες και κάπως απροσδόκητα, μεταξύ των οποίων σημαντική κλάσματα διαμεμβρανικών πρωτεϊνών (ΤΜ). Αυτό οφείλεται πρώτον, στην απελευθέρωση των μικροκυστιδίων που μεταφέρουν άθικτες πρωτεΐνες TM. Δεύτερον, TM πρωτεΐνες μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία με μία διαλυτή μορφή με πρωτεολυτική επεξεργασία [16] – [18]. Έχουμε βρει προηγουμένως ότι τόσο microvesicular απελευθέρωσης [19] και πρωτεολυτική διάσπαση της ΤΜ πρωτεΐνες δεν συμβαίνει μόνον

in vitro

, αλλά και

in vivo

. Συγκεκριμένα διαπιστώσαμε μια αύξηση στα επίπεδα του διαλυτού καδερίνων, δηλαδή των διαλυτών E-cadherin [20] και του διαλυτού LI-cadherin (αδημοσίευτα δεδομένα) σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνωμα ορού.

Στην έκθεση αυτή έχουμε αναλύσει το secretome παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων

in vitro

και περιγράφουν την ταυτοποίηση μιας διαλυτής μορφής FAT1 καντερίνης ως πολύ άφθονη συστατικό αυτού του κλάσματος. FAT1 ανήκει σε μια μικρή υπο-οικογένεια των τεσσάρων σπονδυλωτών γονίδια (FAT1, FAT2, Fat3 και Fat4). Fat γονίδια καντερίνης κωδικοποιούν εξαιρετικά μεγάλες πρωτεΐνες ~500-600 kDa με τη διατήρηση της δομής από τα ασπόνδυλα στα θηλαστικά. Κάθε μέλος αποτελείται από μέχρι 34 επαναλήψεις καντερίνη, ένα ή δύο lamininG-όπως μοτίβα και αρκετά επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) μοτίβα στην εξωκυτταρική περιοχή τους, ένα μονό-pass περιοχή ΤΜ και μια μεγάλη κυτταροπλασματική περιοχή [21] – [ ,,,0],23]. Η πρωτεολυτική επεξεργασία των πρωτεϊνών Fat συμβαίνουν στην πρώιμη εκκριτική οδό και την παραγωγή ενός μη-ομοιοπολικά συνδεδεμένο ετεροδιμερές στην κυτταρική μεμβράνη έχει περιγραφεί προηγουμένως. Είναι αναφέρεται ως «κλασική» επεξεργασία και φαίνεται να διατηρούνται μεταξύ Drosophila [24] και τον άνθρωπο [22], [25].

FAT1 δεν έχει προηγουμένως μελετηθεί σε καρκίνο του παγκρέατος. Εδώ, σας παρουσιάζουμε την πρώτη περιγραφή ενός διαλυτού ισομορφή της FAT1 απελευθερώνεται από τα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

in vitro

. Βρήκαμε ότι αποδομίνη και μεταλλοπρωτεϊνάση πρωτεΐνη που περιέχει την περιοχή 10 (ADAM10) είναι σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνο για τη θέση αυτού του θραύσματος εξωτομέα.

Στο silico

ανάλυση των δημοσίως διαθέσιμων δεδομένων συστοιχία έκφρασης έδειξε υπερέκφραση FAT1 καθώς ADAM10 σε παγκρεατικά αδενοκαρκινώματα. Τέλος, έχουμε αναπτύξει μία δοκιμασία ELISA που βασίζεται σε θέση να μετρήσει τον εξωτομέα του FAT1 και αποδεικνύουν ότι τα αυξημένα επίπεδα του διαλυτού FAT1 μπορεί να ανιχνευθεί στον ορό του ένα ποσοστό των ασθενών με παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα σε σύγκριση με ανεπηρέαστη ελέγχους.

υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθικής

δείγματα ιστών ελήφθησαν από ασθενείς του Τμήματος Παθολογίας, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr Πανεπιστημίου Bochum, Γερμανία, μετά λήφθηκε ενημερωμένη συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας ηθική του Ruhr Πανεπιστημίου Bochum και διεξήχθη σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι. Δείτε τον πίνακα S5 για λεπτομέρειες ασθενή.

γραπτή συγκατάθεση από όλους τους ασθενείς και τους δωρητές ιστών τεκμηριώθηκε σύμφωνα με τις τοπικές κατευθυντήριες γραμμές δεοντολογίας. Τα τρία δείγματα καρκίνου ελήφθησαν από ασθενείς με PancCa στάδια UICC ΙΙΒ. Κανονική ελέγχους ιστός ήταν από παρακείμενο υγιή ιστό των ίδιων των ασθενών.

Ελήφθησαν δείγματα ορού από ασθενείς του Τμήματος Παθολογίας, Knappschaftskrankenhaus, Ruhr Πανεπιστημίου Bochum, Γερμανία, μετά λήφθηκε ενημερωμένη συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας ηθική του Ruhr Πανεπιστημίου Bochum και διεξήχθη σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι. Δείτε τον πίνακα S4 για λεπτομέρειες ασθενή.

γραπτή συγκατάθεση όλων των ασθενών και αιμοδοτών τεκμηριώθηκε σύμφωνα με τις τοπικές κατευθυντήριες γραμμές δεοντολογίας. Τα δείγματα καρκίνου του 30 ελήφθησαν από ασθενείς με PancCa στάδια UICC I (1), UICC II (9), UICC III (2) και UICC IV (18). Μια ομάδα 26 ασθενών με αρνητικά αποτελέσματα της διάγνωσης για τον καρκίνο του χρησιμοποιήθηκαν ως (κλινική) έλεγχοι.

καλλιέργειας κυττάρων

Το ανθρώπινο παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα κυτταρικής σειράς Paca44 [26] παρασχέθηκε ευγενώς από τον Μ Löhr (Χαϊδελβέργη, Γερμανία), BxPC3, MIAPaCa2 και PANC1 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) και A818-4 κύτταρα από το εργαστήριο μας (WS). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε συμπληρωμένο κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Ανθρώπινα παγκρεατικά επιθηλιακά κύτταρα των πόρων (HPDE) έχουν ευγενώς από Φ.Μ. Tsao (Toronto) και καλλιεργήθηκαν σε καθορισμένο κερατινοκυττάρων-SFM (KFSM, τεχνολογία Life) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

Παρασκευή των δειγμάτων πρωτεΐνης

Secretome παρασκευή έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20] . Εν συντομία κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πρότυπο μέσο έως ότου επετεύχθη συρροή 60-70%. Στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με ϋΜΕΜ και επωάσθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού με συμπληρώματα είτε 16 ώρες για ανάλυση MS ή ακόμη δύο ημέρες για την ανάλυση κηλίδος western. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και καθαρίζονται από επιπλέοντα κύτταρα και συντρίμματα με αποστειρωμένη διήθηση. Για την πρόληψη πρωτεολυτική πέψη, προστέθηκαν αναστολείς πρωτεϊνάσης. Secretome πρωτεΐνες συμπυκνώθηκαν με υπερδιήθηση

Για κύτταρα παρασκευή κυτταρικής καλλιέργειας λύματος λύθηκαν με ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα (25 mMTrisHCl, ρΗ 7,4, 0,5% ΝΡ-40, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA?. 45 λεπτά 4 ° C), με ρυθμιστικό διάλυμα CHAPS-λύσης (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM MgCl

2, 10% γλυκερόλη, 1% CHAPS 90 λεπτά, 4 ° C) ή με ρυθμιστικό διάλυμα NDE-λύσης (10 mMTris /HCl, ρΗ 7,2, 66 mM EDTA, 0,4% SDS, 1% ΝΡ-40, 1 ώρα, 4 ° C) που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) και 1 mM PMSF. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε μετά από φυγοκέντρηση (14,000 rpm, 10 min 4 ° C). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε σε μία τυποποιημένη δοκιμασία πρωτεΐνης Bradford (BioRad, Hercules, CA, USA).

Κατεψυγμένα ιστού εκχύλισης

Ένα μικρό κομμάτι των κατεψυγμένων όγκων ή φυσιολογικό ιστό διεκόπη και κονιοποιημένο ενώ ψύχονται με υγρό άζωτο. Η σκόνη ήταν καλυμμένο με ρυθμιστικό διάλυμα και πρωτεΐνη εκχύλισης NDE πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω.

ADAM και ΜΜΡ αναστολή

Ο ειδικός αναστολέας ADAM10 GI254023X [27], [28] και η ευρεία αναστολέα μεταλλοπρωτεϊνάσηε φάσματος Μπατιμαστάτη (Tocris Bioscience, Bristol, UK) και οι δύο διαλύθηκαν σε DMSO ως διαλύματα αποθέματος πριν από την αραίωση και τη χρήση. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν έως ότου επετεύχθη συμβολή των περίπου 60-70%. Αυτοί πλύθηκαν και κατόπιν επωάστηκαν με 10 μΜ Μπατιμαστάτη ή 5 μΜ GI254023X σε μέσο ελεύθερο ορού για δύο ημέρες.

siRNA-knockdown μελέτες

Για siRNA πειράματα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή περίπου 30% και επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο από αντιβιοτικά για μία ημέρα. Στη συνέχεια επωάστηκαν με 30 μΜ είτε ON-TARGETplus siRNA ή Dharmacon ON-TARGETplus nontargeting siRNA ως έλεγχος χρησιμοποιώντας Dharmafect (Fermentas, ST. Leon Rot, Γερμανία) για δύο ημέρες και ακολούθησε επώαση σε μέσο ελεύθερο ορού για άλλες δύο ημέρες και η δεύτερη επώαση σε μέσο ελεύθερο ορού για άλλες δύο ημέρες.

αντισώματα και κηλίδωση Western

μη εμπορική αντι-FAT1 ποντικού μονοκλωνικό και πολυκλωνικό κουνελιού αντισώματα που κατευθύνονται έναντι του Ν-τερματικού ή C- τερματικούς τομείς του FAT1 περιγράφηκαν προηγουμένως [25]. Πολυκλωνικά αντισώματα κατά της εξωκυτταρικής περιοχής του FAT1 (HPA001869 και HPA023882) και μονοκλωνικά αντισώματα έναντι β-τουμπουλίνης (T4026) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). αντισώματα ADAM10 αγοράστηκαν από την Calbiochem (Darmstadt, Γερμανία) (κουνέλι, 735-749) και Millipore (Darmstadt, Γερμανία) (AB19026 κουνέλι). Το αντίσωμα Ε-καδερίνης αγοράστηκε από την Invitrogen (Darmstadt, Γερμανία) (ποντίκι, 13-1700).

Για την ανάλυση Western blot, 8 μg ολικής πρωτεΐνης από secretomes, 50-75 μg από λύματα κυττάρων και ιστών ή 12 μg πρωτεΐνες ορού διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας 3-8% Τπδ-Οξικό πηκτές βαθμίδωσης (Life Technologies, Darmstadt, Germany) όπως περιγράφεται προηγουμένως [25] με κάποιες τροποποιήσεις. Εν συντομία, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη ή PVDF μεμβράνες με τη χρήση ημι-ξηράς κηλίδωσης και οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα με 5% σκόνη αποβουτυρωμένου γάλακτος σε PBS. Μετά την επώαση με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα, ανίχνευση ανοσοαντιδραστικές ζώνες διεξήχθη χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπέρυθρο φθοροφόρα (Alexa-Fluor 680 (Life Technologies, Darmstadt, Γερμανία) ή DyLight 800 (Thermo Scientific, Schwerte, Γερμανία)), ή HRP ( εργαστήρια BioRad, München, Germany). Σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το Infrared System Οδύσσεια απεικόνισης (LI-COR Βιοεπιστημών, Lincoln, NE) ή ένα σύστημα Fuji LAS-4000 απεικόνισης (GE Healthcare, Braunschweig, Γερμανία).

ηλεκτροψεκασμού ιονισμού-διαδοχική φασματομετρία μάζας (ESI -MS /MS) ανάλυση

Για μια λεπτομερή περιγραφή δείτε τα υλικά και τις μεθόδους S1. Εν συντομία secretome και ορός δείγματα διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα PAGE κηλιδώθηκαν με Krypton (Pierce, Rockford, USA) και κάθε πρωτεΐνη λωρίδα κόβεται σε φέτες και 29 σε πέψη με θρυψίνη. Θρυπτικής μίγματα πεπτιδίων διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα UPLC nanoAcquity (Waters GmbH, Eschborn, Germany) όπως περιγράφεται προηγουμένως [19]. Το σύστημα νανο UPLC συνδέθηκε απευθείας με ένα φασματόμετρο μάζας LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific, Βρέμη, Γερμανία). Το φασματόμετρο μάζας λειτούργησε στην ευαίσθητη κατάσταση. Themgf-αρχεία που δημιουργούνται από το λογισμικό Xcalibur (Thermo Scientific, Βρέμη, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκαν για τις αναζητήσεις βάσεων δεδομένων με τη μηχανή αναζήτησης ΜΑΣΚΩΤ (Matrix Science, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο? Έκδοση 2.2) εναντίον της βάσης δεδομένων MSIPI. Κάθε φέτα αναλύθηκε ξεχωριστά και δεδομένων MS /MS δεν είχαν συγχωνευθεί πριν από την αναζήτηση της βάσης δεδομένων πρωτεΐνης για να διατηρήσει τις πληροφορίες σχετικά με το μοριακό βάρος της κάθε πρωτεΐνης, πεπτίδιο αγώνες και βαθμολογία ταυτότητας. Με αυτόν τον τρόπο καταλόγους πρωτεΐνη από ανθρώπινα secretomes παγκρέατος καρκινικών κυττάρων (A818-4, BxPC3, MIAPaCa2, Paca44, PANC1 και HPDE (ανθρώπινο παγκρεατικό επιθηλιακά πόρου)) ιδρύθηκαν.

δοκιμασία ELISA έναντι εκκρίνεται FAT1

96 φρεατίων (λευκό MaxiSorp επίπεδου πυθμένα των 96 φρεατίων (Nunc, Roskilde, Denmark) επικαλύφθηκαν πρώτα όλη τη νύκτα στους 4 ° C με 100 μΐ αντι-Fat mAb NTD-7 (που εγείρεται έναντι domains καντερίνης 11/12 ?. [25].) στα 50 μg /ml σε ανθρακικό ρυθμιστικό διάλυμα (ρΗ 9.6) μεταξύ όλων των βημάτων επώασης, οι πλάκες πλύθηκαν τρεις φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό που περιέχει 0.1% Tween (ν /ν) (PBS-T) οι πλάκες στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ΡΒδ-Τ (2 ώρες, RT) πριν από την εφαρμογή της ενδεικνυόμενης δειγμάτων και περαιτέρω επώαση (2 ώρες, RT). Συλλαμβάνονται αντιγόνο FAT1 ανιχνεύθηκε με 0,05 μg /mL βιοτινυλιωμένης αντι-FAT1 NTD-14 mAb (16 ώρες, 4 ° C) (που εγείρεται έναντι ενός πεπτιδίου σε καντερίνη επανάληψη 12 του FAT1 [25] αραιωμένο σε 2% αποβουτυρωμένο γάλα σε PBST. Συγκροτήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας 5 μg /mL Neutravidin-HRP (Pierce, Darmstadt, Γερμανία) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου πριν από την ανακίνηση της επώασης των 50 υποστρώματος μl (SuperSignal ELISA FemtoMaximum Ευαισθησία).

Αποτελέσματα

το γιγαντιαίο cadherin FAT1 είναι ένα σημαντικό συστατικό της secretome της παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

Ως μέρος του προγράμματος ανακάλυψη βιοδεικτών μας έχουμε καταλογογραφηθεί το ρεπερτόριο των πρωτεϊνών που εκλύονται από πέντε ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας (A818-4, BxPC3, MIAPaCa2, Paca44 και PANC1) και συγκρίθηκε αυτό στην secretome των αθανατοποιημένων ανθρώπινων παγκρεατικού πόρου επιθηλιακά κύτταρα (HDPE). Secretomes παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12], [13], [19] και διαχωρίστηκαν σε ένα 1D-κλίση γέλης. Κάθε λωρίδα γέλη κόπηκε σε 29 φέτες. Θρυπτική πέψη και φασματομετρία μάζας πραγματοποιήθηκαν χωριστά για κάθε γέλη φέτα και βάση δεδομένων αναζητήσεις οδήγησε στην ταυτοποίηση άνω των 1000 πρωτεϊνών ανά secretome και πάνω από 3000 μοναδικές πρωτεΐνες συνολικά (αδημοσίευτα δεδομένα).

Αξίζει να σημειωθεί ότι πολλές πεπτίδια χαρτογράφηση σε το γιγαντιαίο πρωτοκαδερίνη Fat-1 βρέθηκαν σε όλες τις έξι secretomes εντός φέτες πήγματος δύο και τρία που αντιστοιχούν σε πρωτεΐνες & gt? 400 kDa συνέπεια με την προβλεπόμενη μάζα των FAT1 του -500 kDa (σύγκρινε πίνακα 1). Πράγματι, από την άποψη του αριθμού των πεπτιδίων που προσδιορίζονται, το οποίο είναι ένα σχετικό μέτρο της πρωτεΐνης αφθονία, FAT1 ήταν μεταξύ των πλέον άφθονες πρωτεΐνες των καρκινικών κυττάρων secretomes αντιπροσωπεύουν μέχρι το 0,9% του συνόλου των πεπτιδίων και η πιο άφθονη παράγωγο οποιασδήποτε πρωτεΐνης ΤΜ. Η κατανομή των πεπτιδίων FAT1 μεταξύ των κυτταρικών γραμμών και πεπτίδια που προέρχονται από άλλες πρωτεΐνες Fat (FAT2 και Fat4) παρουσιάζεται στον πίνακα 1.

Η

επόμενο προφίλ της έκφρασης του mRNA και των τεσσάρων Fat οικογένεια καντερίνες στην παγκρέατος πίνακα γραμμή καρκινικών κυττάρων χρησιμοποιώντας ανάλυση μικροσυστοιχιών (πίνακας S1) που ακολουθείται από τη δευτερογενή επιβεβαίωση χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR (σχήμα S1). FAT1 εκφράστηκε σε υψηλά επίπεδα σε όλες τις έξι κυτταρικές σειρές, FAT2 και Fat4 σε μέτρια επίπεδα σε μόνο δύο από τις έξι κυτταρικές γραμμές. Αντίθετα ελήφθησαν μόνο επίπεδα υποβάθρου για Fat3 σε αυτή την ανάλυση.

Τα καθοριζόμενα επίπεδα των mRNAs συνήθως αντιστοιχούσε με τα πρωτεομικά δεδομένα, ωστόσο, συγκρίνοντας τα καρκινικά κύτταρα να HPDE κύτταρα υπήρχαν ορισμένες διαφορές. Ειδικότερα, τα κύτταρα HDPE εμφανίζεται υψηλή έκφραση FAT1 mRNA, αλλά αντίθετα έδωσε το χαμηλότερο αριθμό των FAT1 πεπτιδίων στο secretome. Ομοίως, το πεπτίδιο αριθμούς για FAT2 και Fat4 στο secretome HPDE είναι χαμηλότερες ή ακόμη και απούσα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τις καρκινικές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν επίσης συγκρίσιμα επίπεδα FAT2 και Fat4 mRNAs (BxPC3 και PANC1, αντίστοιχα) υποδεικνύοντας ότι τα καρκινικά κύτταρα απελευθερώνουν περισσότερο λίπος πρωτεΐνες από τα φυσιολογικά κύτταρα.

Για την επικύρωση ανεξάρτητα αυτά τα ευρήματα αναλάβαμε ανάλυση στυπώματος Western των secretomes παγκρεατικών κυττάρων και συγκρίθηκαν με αντίστοιχες κυτταρολύματα. Ανίχνευση με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον του αμινο-άκρο της πρωτεΐνης FAT1 απεκάλυψε κυρίως μία μοναδική ζώνη λίγο πάνω από 460 kDa στα secretomes με αντίστοιχα προϊόντα λύσης κυττάρου από καρκινικά κύτταρα που εμφανίζουν μία ζώνη παρόμοιας κινητικότητας (σχήμα 1). Σε αντίθεση, τα κύτταρα HDPE παρουσίασαν μικρή αντιδραστικότητα για FAT1 στην secretome και η κύρια ζώνη ανιχνεύθηκαν στα κυτταρολύματα εμφανίστηκε μεγαλύτερη υποδηλώνοντας μπορεί να υπάρχουν μετα-μεταφραστική διαφορές. Δεδομένου ότι οι εντάσεις ταινιών των secretomes συσχετίζονται με τις μετρήσεις πεπτίδιο προσδιορίστηκε για κάθε αντίστοιχη κυτταρική γραμμή (Πίνακας 1), λαμβάνονται μαζί αυτά τα δεδομένα παρέχουν καλή απόδειξη ότι FAT1 είναι ιδιαίτερα άφθονη στις secretomes του παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές αλλά σε μικρότερο βαθμό σε φυσιολογική κυτταρική τους ομολόγους

ανάλυση Western blot του FAT1 στο αντίστοιχο secretome. (S? 8 μα φόρτισης) και λύμα (L? 50 μg φορτωθεί) κλάσματα από τέσσερα παγκρεατικών κυτταρικών σειρών και HPDE. Το στύπωμα ιχνηλατήθηκε με ένα αντιορό που εγείρεται έναντι της εξωκυτταρικής περιοχής του FAT1 (ECD1).

Η

FAT1 στον παγκρεατικό καρκίνο secretome αποτελείται από τον

ρίξει εξωκυτταρικό τομέα

Το φαινομενικό μοριακό φάσμα ( κ) της ζώνης FAT1 σε παγκρεατικά secretomes καρκίνος είναι στην περιοχή του προβλεπόμενου κ του πλήρους μήκους πυρήνα FAT1 πολυπεπτίδιο 505 kDa (σχήμα 1). Ενώ ονομαστικά αυτό υποδηλώνει ότι εκκρινόμενη FAT1 μπορεί να είναι ανέπαφο, η ευθυγράμμιση των ταυτοποιημένων πεπτιδίων στην αλληλουχία αμινοξέων FAT1 αποκάλυψε ότι όλα τα πεπτίδια προέρχονται αποκλειστικά από το εξωκυτταρικές περιοχές (ECD, αμινοξέα 1-4180) με το πλέον Ο-τερματικό αμινοξύ που προσδιορίζονται σε μια χαρτογράφηση πεπτιδίων σε ΑΑ 3997 (εικ. 2 και το αρχείο S1).

μάζας φασματομετρικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τους έξι secretomes και FAT1 ειδικά πεπτίδια ανιχνεύτηκαν αρχίζουν κοντά στο αμινοτελικό άκρο προς τα κάτω και περιλαμβάνουν την περιοχή EGF ( δείτε S1 αρχείο για λεπτομέρειες). Εδώ φαίνονται ευθυγραμμίσεις FAT1 ειδικών πεπτιδίων από τρία παραδειγματικά αποτελέσματα με υψηλή κάλυψη αλληλουχία στο τμήμα των αμινοξέων 3500 κάτω στο Ο-άκρο στο AA4588 (σύμφωνα με HPRD).

Η

Επιπλέον, η ύπαρξη ενός μεγαλύτερου συγκροτήματος στο προϊόν λύσης κυττάρου HPDE προταθεί, ότι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις μπορεί να συμβάλει με το συνολικό μέγεθος των πρωτεϊνικών ισομορφών όπως συχνά παρατηρείται για ΤΜ πρωτεΐνες συμπεριλαμβανομένων πολλών καντερίνες. Πράγματι, τα πειράματα επιβεβαίωσαν ότι απογλυκοζυλίωση περίπου ένα πρόσθετο 70 kDa της συνολικής μάζας πρωτεΐνης οφείλονται σε γλυκοσυλίωση των κυτταρικών μορφών και της διαλυτής μορφής του FAT1 (σχήμα S2). Όσον αφορά τα σήματα σε προϊόντα λύσης κυττάρων, το πολύ υψηλό κ μπάντα που υπάρχει στα κύτταρα HPDE υποδηλώνει αυτοί εκφράζουν κυρίως το πλήρους μήκους γλυκοζυλιωμένη πρωτεΐνη. Η ελαφρώς μικρότερη ζώνη που υπάρχουν στα λύματα των καρκινικών κυττάρων μπορεί να αντιπροσωπεύει το Ν-τελικό τμήμα της περιγράφηκε πρόσφατα FAT1 ετεροδιμερές, που αποτελείται από ένα GP Ν-τερματικό 490 (P420) και ρ85 Ο-τερματικό διαμεμβράνης θραύσμα. Αυτή η μη-ομοιοπολικά συνδεδεμένη ετεροδιμερές παράγεται από ενδοπρωτεολυτική S1-διάσπαση στο δίκτυο trans-Golgi [25] πριν φτάσει στη μεμβράνη του πλάσματος. Να διευκρινίσει τη φύση της FAT1 υπάρχουν στο secretome και να επιβεβαιώσουν τις ταυτότητες των ζωνών που παρατηρείται σε κυτταρολύματα, αναλάβαμε αναλύσεις Western blot με ειδικά αντισώματα τομέα [25].

Σχήμα 3 συγκρίνει ένα αντιπροσωπευτικό μέρος secretome παράλληλα κυττάρων λύματα από καλλιεργημένα παγκρεατικά κύτταρα. Το στύπωμα ανιχνεύθηκε με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον της ενδοκυτταρικής περιοχής του FAT1 που ανιχνεύει εύκολα μία μόνο ζώνη & gt? 500 kDa στα προϊόντα λύσης κυττάρων σε σαφή αντίθεση με την secretome όπου δεν ήταν εμφανή σήματα. Στη συνέχεια, το ίδιο στύπωμα επωάστηκε με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον ενός εξωκυτταρικό τομέα FAT1 όπου λύματα παγκρεατικών κυττάρων έδωσε δύο στενά διαστήματα μπάντες στα κυτταρολύματα: η άνω ζώνη είναι πανομοιότυπη με εκείνη που ανιχνεύεται από ενδοκυτταρικά αντισώματα. Η έλλειψη αντιδραστικότητας της κάτω ζώνης με ενδοκυτταρικά αντισώματα domain προσδιορίζει αυτό το ζεύγος των ζωνών ως πλήρους μήκους και ετεροδιμερείς μορφές του FAT1, αντίστοιχα (σχήμα 3). Επιπλέον, όπως αναμένεται από τα MS-αποτελέσματα, εξωκυτταρικό τομέα αντισώματα έδωσαν ισχυρά σήματα στο secretome δείγμα. Συλλογικά, τα αποτελέσματα των δύο βιοχημικών και φασματομετρίας μάζας (MS) αναλύσεις υποδεικνύουν ότι FAT1 παρούσα στο secretome στερείται εντελώς C-τερματικά υπολείμματα. Δεδομένου ότι και οι δύο γνωστές μορφές κυτταρικών FAT1 είναι ΤΜ πρωτεΐνες, η αναγκάζοντας συμπέρασμα από αυτά τα δεδομένα είναι ότι η FAT1 ανιχνεύσιμα στο secretome αντιπροσωπεύει εξωκυτταρικό απόπτωση μέσω πρωτεολυτική διάσπαση σε εξωκυτταρική περιοχή του κατάντη από τον τομέα LAMG. Με κηλίδωση Western κυτταρολυμάτων δεν μπορέσαμε να βρούμε αποδείξεις για την παρουσία ενός Ο-τερματικού θραύσματος απομεινάρι αναμένονται να προκύψουν από εξωτομέα απόπτωση, ούτε κάναμε την ανίχνευση της Ο-τερματικό θραύσμα ρ85 από το ετεροδιμερές.

κυτταρολύματα (75 μg έκαστο) και ένας εκπρόσωπος secretome (8 μα) κηλιδώθηκαν μαζί με ένα δείκτη πρωτεΐνη (Μ). Το ίδιο στύπωμα ανιχνεύθηκε πρώτα, με έναν αντιορό που εγείρεται έναντι της κυτταροπλασματικής περιοχής (CTD) του FAT1 και στη συνέχεια με ένα αντιορό που εγείρεται έναντι της εξωκυτταρικής περιοχής (ECD 2). Βήτα-τουμπουλίνης, τελικά, χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για κυτταρολύματος. Τα ειδικά αντισώματα εξωκυτταρική περιοχή, μόνο, ανιχνεύουν την επεξεργασία κυτταρική μορφή και το απελευθερωμένο FAT1 στην secretome.

Η

Έτσι, το επόμενο πραγματοποιήθηκε ανάλυση ανοσοκαθίζησης με τον τομέα ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs), χρησιμοποιώντας τρεις αντιπροσωπευτικές κύτταρο αδενοκαρκινώματος γραμμές. Χρησιμοποιώντας βιοτινυλίωση να επισημαίνουν τις πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας, αυτή η ανάλυση δείχνει την παρουσία κυρίως δύο υψηλού κ ζώνες καθιζάνει με Ν- και C-τερματικών ειδικών mAbs στην πλειονότητα των κυτταρικών γραμμών που εξετάστηκαν. Μεταγενέστερες κηλίδωση Western με ένα εξωκυτταρικό πεδίο ειδικό αντίσωμα ανιχνεύει το μεγαλύτερο συγκρότημα μόνο, ενώ οι ειδικές σήματα αντίσωμα ενδοκυτταρική περιοχή τόσο μεγάλο κυτταρικών μορφών (σχήμα 4). Αυτό παρέχει περαιτέρω απόδειξη της διπλής επεξεργασίας σύμφωνα με την οποία και οι δύο σε όλο το μήκος και ετεροδιμερείς μορφές του FAT1 συμβαίνουν στην κυτταρική επιφάνεια των παγκρεατικών κυττάρων αδενοκαρκινώματος, όπως περιγράφεται προηγουμένως για τα κύτταρα μελανώματος. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η ενδοκυτταρική περιοχή Ο-τερματικού ειδικού αντισώματος έδειξε επίσης την παρουσία της ζώνης ρ85 ενδεικτικό του ετεροδιμερούς (Σχήμα 4). Πιο εντυπωσιακά μια ζώνη ~ 60 kDa συνεπής με τον αναμενόμενο εξωτερικός τομέας ρίχνοντας θέση διάσπασης παρατηρήθηκε στο προϊόν λύσης κυττάρου BxPC3 και σε μικρότερο βαθμό σε κύτταρα PaCa44. Η ζώνη P60 καταβυθίστηκε μόνο με Ο-τερματικό-ειδικό mAbs που δείχνει ότι αντιπροσωπεύει ένα προϊόν δεν είναι πλέον σε συνεργασία με τον εξωκυτταρικό τομέα. Αυτό είναι επίσης σύμφωνο με τις προηγούμενες παρατηρήσεις σε κύτταρα μελανώματος [25]

Cells (PANC1, BxPC3 και A818-4) επισημάνθηκαν με βιοτίνη, λύονται και κατακρημνίστηκε με FAT1 ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα (NTD7 και CTD7).? πρωτεΐνης /G σφαιρίδια Α χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Η πρώτη επώαση του στυπώματος με Neutravidin-HRP υποδεικνύεται ζωνών με υψηλό μοριακό βάρος που αντιστοιχεί με τις γνωστές υψηλές κ μορφών FAT1 και πιθανώς διασταυρούμενης αντίδρασης πρωτεΐνης σε ≈200 kDa. Μεταγενέστερες κηλίδωση Western με την εξωκυτταρική περιοχή ειδικό αντιορό ανιχνεύει και πάλι τα δύο υψηλά κ μορφές FAT1. Τέλος, κηλίδωση Western με την ενδοκυτταρική περιοχή ειδικό αντιορό ανιχνεύει την πρωτεΐνη πλήρους μήκους και το ρ85 Ο-τερματικό κατάλοιπο θραύσμα που προέρχεται από την κλασική επεξεργασία και στις δύο FAT1 ιζήματα, επιβεβαιώνοντας την σύνδεση των Ν-τερματικών και Ο-τερματικών τμημάτων. Ένα επιπλέον ρ60 ανιχνεύεται αποκλειστικά στο ίζημα χρησιμοποιώντας το ενδοκυτταρικό αντίσωμα σε συγκεκριμένους τομείς με ισχυρά σήματα σε σήματα BcPC3 και την εβδομάδα στο A818-4 λύματα. Ανοσοκατακρήμνιση (ΙΡ) ανάλυση των FAT1 μετά την επισήμανση της κυτταρικής επιφάνειας των PANC1, BxPC3 και A818-4 κύτταρα με βιοτίνη. IPs χρησιμοποιώντας περιοχή ειδική mAbs έναντι FAT1 μαζί με ένα μάρτυρα (πρωτεΐνη /G σφαιρίδια Α επωάζεται με προϊόντα λύσης) έχουν πρώτα ανιχνεύθηκαν με Neutravidin να διακοσμήσει πρωτεΐνες στην κυτταρική επιφάνεια που ακολουθείται από τα πολύκλωνα αντισώματα κατά του ECD και CTD, όπως φαίνεται. Οι ζώνες επισημαίνονται gp575, gp490 και ρ85 σύμφωνα με Α) με ρ60 υποδηλώνει περαιτέρω πρωτεολυτική προϊόν.

Η

Περικοπή των FAT1 καντερίνης περιλαμβάνει ADAM10

μεταλλοπρωτεάσες συχνά ρυθμίζουν εξωτερικός τομέας αποβολή TM υποδοχέων με μεμβράνη αγκυροβολημένα ADAM οικογένεια μεταλλοπρωτεάσες εμπλέκονται συχνά. mRNA προφίλ των παγκρεατικών κυτταρικών σειρών αποκάλυψε ένα περιορισμένο πρότυπο έκφρασης των μελών της οικογένειας ADAM (πίνακας S2). ADAM10 ιδιαίτερα είναι ο sheddase είναι σε μεγάλο βαθμό υπεύθυνη για εξωτομέα αποβολή Ε-καδερίνης και LI-καδερίνης σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα (μη δημοσιευμένα δεδομένα) και τέσσερις από τις πέντε κυτταρικές σειρές καρκίνου εμφανίζονται υψηλότερα επίπεδα ADAM10 από τα κύτταρα HPDE. Στο επίπεδο πρωτεΐνης, ADAM10 ειδικά πεπτίδια δεν ανιχνεύθηκαν σε secretome καταλόγους αλλά και στα εμπλουτισμένα εξωσώματα από τα κράτη μέλη, δηλαδή 9 αγώνες σε εξωσώματα HPDE και 62 αγώνες στην PANC1 εξωσώματα? κανένας άλλος ADAMs ανιχνεύθηκαν σε αυτές καταλόγους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μαζί αυτά τα δεδομένα παρέχουν μια λογική για την εξέταση του ρόλου των ADAM10 σε FAT1 εξωτομέα απόπτωση.

Για να αξιολογηθεί η συμμετοχή των μεταλλοπρωτεϊνασών και ιδιαίτερα ADAM10 σε FAT1 εξωτομέα απόπτωση, τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος υποβλήθηκαν σε θεραπεία με το ευρύ φάσμα αναστολέα πρωτεάσης Μπατιμαστάτη και ο ADAM10 ειδικός αναστολέας GI245023X [28], [29]. Western κηλίδωση των FAT1 σε secretomes σε κυτταρικές σειρές Paca44 και PANC1 έδειξε θεραπεία Μπατιμαστάτη μείωσε τα επίπεδα της εξωεπικράτειας αποβολή του FAT1 κάτω από τα επίπεδα ελέγχου. Ο αναστολέας GI254023X ήταν εξίσου αποτελεσματικές στη μείωση των επιπέδων εξωτομέα ρίξει FAT1 στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 5Α). Ποσοτική εκτίμηση των επιπτώσεων αυτών των παραγόντων, σε τρεις διαδοχικές πειράματα έδειξαν ότι Μπατιμαστάτη ανέστειλε σημαντικά FAT1 απόπτωση σε κύτταρα PANC1 και Paca44 (Σχήμα 5Β), επιβεβαιώνοντας έτσι τον ρόλο των μεταλλοπρωτεϊνασών στη διαδικασία αυτή. Οι επιδράσεις της GI254023X ήταν παρόμοια προτείνοντας ότι ADAM10 εμπλέκεται στην απόπτωση FAT1 σε αυτά τα κύτταρα. Ωστόσο, ορισμένες αναφορές έχουν προτείνει ότι GI254023X στις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται μπορεί επίσης να έχει κάποια επίδραση στην μεταλλοπρωτεασών μήτρας (MMPs), π.χ. [27], και περαιτέρω πειράματα διεξήχθησαν με RNAi έναντι ADAM10.

Η εικόνα του Α) δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό Western blot. PaCa44 και PANC1 κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για δύο ημέρες με την προσθήκη είτε της ευρείας αναστολέα μεταλλοπρωτεάσης φάσμα Μπατιμαστάτη (Β, 10 μΜ), ή ο ADAM10-ειδικός αναστολέας GI245023X (GI, 5 μΜ) ή διαλύτη ως μάρτυρα ( C, DMSO). Secretomes, 8 μg πρωτεΐνης ανά δείγμα, αναλύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας το πολυκλωνικό αντίσωμα FAT1 ECD2. Λεκιάζοντας κατά τρανσφερίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) FAT1 ειδικά σήματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα ποσοτικοποιήθηκαν και εξομαλύνθηκαν με τα σήματα τρανσφερίνης. Τα ιστογράμματα δείχνουν τις μέσες τιμές +/- S.E.M. από τρία πειράματα

Η

Θεραπεία της Paca44 και PANC1 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με ADAM10 δίπολα συγκεκριμένες siRNA είχε ως αποτέλεσμα & gt?. 90% knockdown των επιπέδων πρωτεΐνης ADAM10 σταθερό για 96 ώρες (Εικόνα 6). Η εξέταση του secretome έδειξε μια συνακόλουθη μείωση σε διαλυτή επίπεδα FAT1 παράγονται από PANC1 και τα κύτταρα Paca44 (σχήμα 7). Ακόμα κι αν τα επίπεδα ADAM10 μειώθηκαν κάτω από το 10% των επιπέδων ελέγχου η μέγιστη μείωση στην έκκριση FAT1 που παρατηρήθηκε ήταν περίπου 50% των ελέγχων. Παρόμοιες μειώσεις της έκκρισης της Ε-καδερίνης, ένα γνωστό στόχο των ADAM10, παρατηρήθηκαν σε παράλληλα πειράματα πραγματοποιούνται με τις χημικές αναστολείς ή δίπολα ADAM10 siRNA (σχήμα S3 Α και Β). Συλλογικά αυτό υποδηλώνει ότι ADAM10 είναι ένας σημαντικός δράστης της FAT1 ρίχνοντας αλλά δεν είναι το μοναδικό που εμπλέκονται.