Αφηρημένο

Εξωκυττάρια μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας επαγωγέα (EMMPRIN), μια πρωτεΐνη μεμβράνης πλάσματος της ανοσοσφαιρίνης (Ig), έχει αναφερθεί ότι προωθούν την προσβολή καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση σε πολλές ανθρώπινες κακοήθειες. Ωστόσο, οι ρόλοι των διαφόρων ισομορφών EMMPRIN και τους σχετικούς μηχανισμούς τους στο κεφάλι και την εξέλιξη του καρκίνου του λαιμού παραμένουν άγνωστα. Χρησιμοποιώντας ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR, βρήκαμε ότι EMMPRIN ισομορφή 2 (EMMPRIN-2) ήταν η μοναδική ισομορφή που υπερεκφράζεται σε δύο ιστούς καρκίνου κεφαλής και τραχήλου και κυτταρικές σειρές και ότι συνδέθηκε με κεφαλής και του τραχήλου της μετάστασης του καρκίνου. Για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του EMMPRIN-2 στο κεφάλι και την εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου, επιμολύναμε καρκίνο κεφαλής και λαιμού κυττάρων με έναν φορέα έκφρασης EMMPRIN-2 και EMMPRIN-2 siRNA να διαμορφώνει εξωγενώς έκφραση EMMPRIN-2 και εξετάστηκε η λειτουργική σημασία της EMMPRIN-2 στο κεφάλι και το λαιμό εισβολή καρκίνου και μετάσταση. Βρήκαμε ότι EMMPRIN-2 προωθείται κεφαλής και εισβολή κυττάρων του τραχήλου, τη μετανάστευση, και η προσκόλληση in vitro και αυξημένη μετάσταση πνεύμονα in vivo. Μηχανιστικές μελέτες αποκάλυψαν ότι EMMPRIN-2 υπερέκφραση προώθησε την έκκριση των εξωκυτταρικών μορίων σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένων μεταλλοπρωτεϊνασών-2 μήτρας (ΜΜΡ-2), ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (υΡΑ) και καθεψίνη Β, σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Ενώ η ΜΜΡ-2 και υΡΑ έχει αποδειχθεί ότι είναι σημαντικοί μεσολαβητές EMMPRIN σηματοδότηση, δεν έχει τεκμηριωθεί ο ρόλος της Καθεψίνης Β σε EMMPRIN μεσολάβηση μοριακών καταρράκτες και ογκογένεση. Βρήκαμε ότι EMMPRIN-2 υπερέκφραση και Καθεψίνη Β κάτω ρύθμιση ανέστειλε σημαντικά την εισβολή, τη μετανάστευση και την προσκόλληση των κυττάρων Tca8133, υποδηλώνοντας ότι η καθεψίνη Β απαιτείται για EMMPRIN-2 ενίσχυσαν την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας καταδεικνύουν το σημαντικό ρόλο της EMMPRIN-2 σε εξέλιξη καρκίνο κεφαλής και τραχήλου, για πρώτη φορά και να αποκαλύψει ότι η αυξημένη εξωκυτταρική έκκριση του Καθεψίνης Β μπορεί να είναι μία νέα μηχανισμός υποκείμενες EMMPRIN-2 ενισχυμένο εξέλιξης του όγκου σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου.

Παράθεση: Huang Ζ, Tan Ν, Guo W, Wang Ε, Li H, Zhang T, et al. (2014) Η υπερέκφραση του EMMPRIN Ισόμορφης 2 συνδέεται με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου μετάσταση. PLoS ONE 9 (4): e91596. doi: 10.1371 /journal.pone.0091596

Επιμέλεια: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Νοεμβρίου του 2013? Αποδεκτές: 12, Φεβρουαρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 4η, Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (# 81101592, έως το Ω Huang) και του Ιδρύματος επαρχία Γκουανγκντόνγκ Φυσικών Επιστημών (# S2013010014794, έως το Ω Huang), και από τα βραβεία από το Flight Attendant Medical Research Institute (# 062545, με Ζ Guo) και από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (# 81272951, για να J.Li). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος κεφαλής και τραχήλου (ΕΘΕΓ) είναι η έκτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο [1], και έχει γίνει πιο διαδεδομένη στις αναπτυσσόμενες χώρες κατά την τελευταία δεκαετία [2]. Περισσότερες από 650.000 νέες περιπτώσεις HNC διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο [3], [4]. Μόνο στην Ευρώπη, περίπου 143.000 νέες περιπτώσεις και μεγαλύτερη από 68.000 θάνατοι συμβαίνουν λόγω της νόσου κάθε χρόνο [4]. Χειρουργική σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία είναι πλέον αποδεκτή ως η πιο αποτελεσματική θεραπεία για ασθενείς με καρκίνωμα κεφαλής και λαιμού πλακωδών κυττάρων. Ωστόσο, το ποσοστό θνησιμότητας λόγω καρκίνου κεφαλής και τραχήλου δεν έχει αλλάξει σημαντικά τα τελευταία 30 χρόνια, και το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών εξακολουθεί να είναι λιγότερο από 50% [2]. αποτυχίας της θεραπείας έχει κυρίως αποδοθεί στην τοπική υποτροπή και μακρινή μετάσταση [5]. Επί του παρόντος, οι θεραπευτικές αποφάσεις γίνονται με βάση κλινικοπαθολογική παραμέτρους, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας, ο κόμβος όγκου στάδιο μετάσταση, και ιστολογική βαθμολογία. Αν και χρήσιμη, αυτοί οι παράγοντες συχνά αποτυγχάνουν να παρέχουν ακριβείς πληροφορίες σχετικά με τα βιολογικά χαρακτηριστικά των όγκων [3]. Ως εκ τούτου, διορατικότητα στις μοριακές αλλαγές που σχετίζονται με το κεφάλι και το λαιμό μετάσταση του καρκίνου θα παρέχουν κρίσιμες γνώσεις σχετικά με τις θεμελιώδεις μηχανισμούς που διέπουν το κεφάλι και την εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου και να συμβάλει περαιτέρω στη βελτίωση της κλινικής αντιμετώπισης των ασθενών με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου.

εξωκυτταρική μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας επαγωγέα (EMMPRIN), επίσης γνωστή ως CD147 ή basigin, είναι μία πρωτεΐνη μεμβράνης πλάσματος της ανοσοσφαιρίνης (Ig) υπεροικογένεια και ονομάστηκε με βάση τη λειτουργία του να επάγει την παραγωγή εξωκυτταρικής μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs), τα βασικά ένζυμα που εμπλέκονται στη διατήρηση της ακεραιότητας και του κύκλου εργασιών της εξωκυττάριας ουσίας (ECM) [6]. EMMPRIN συμμετέχει σε μια ποικιλία κανονικών φυσιολογιών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των λεμφοκυττάρων ανταπόκρισης, γυναικείου αναπαραγωγικού διεργασίες, και ενδοκυτταρική μεταφορά [7] – [9]. έκφραση Αυξημένα EMMPRIN έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη του όγκου σε γλοιώματα, γιγαντιαία όγκους των κυττάρων του οστού, του λάρυγγα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, ορώδες καρκίνωμα ωοθηκών και μελανωμάτων [10]. EMMPRIN προωθεί την πρόοδο του καρκίνου με την ενίσχυση των καρκινικών κυττάρων εισβολή και μετάσταση. Η λειτουργική σημασία της EMMPRIN κατά τη διάρκεια εξέλιξης του όγκου έχει κυρίως αποδοθεί στην ικανότητά του να διεγείρει την παραγωγή των MMPs [8] – [10]. Σε κύτταρα όγκου, EMMPRIN προάγει την παραγωγή της ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 και διευκολύνει την σύνθεση του ΜΤ1-ΜΜΡ και ΜΤ2-ΜΜΡ [11] – [13]. Εκτός από την μεσολάβηση της υποβάθμισης του ECM, EMMPRIN παίζει πολυλειτουργικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου. Με up-ρυθμίζουν την έκφραση του VEGF και των κύριων υποδοχέα του, VEGFR-2, και στις δύο κύτταρα όγκου και τα ενδοθηλιακά κύτταρα, EMMPRIN μπορεί να προωθήσει την αγγειογένεση, η οποία είναι ένα κρίσιμο γεγονός όχι μόνο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του όγκου, αλλά και κατά τη διάρκεια της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων [14], [15]. EMMPRIN μπορεί επίσης να δράσει ως μόριο προσκόλλησης και να αλληλεπιδρούν με β1-ιντεγκρίνης [16], [17]. Πολλά άλλα μόρια έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά με EMMPRIN, συμπεριλαμβανομένων caveolin-1, υΡΑ, μεταφορείς μονοκαρβοξυλικού (MCT), και CYP450 ένζυμα [18].

Λόγω εναλλακτικό μάτισμα, τουλάχιστον 4 διαφορετικές παραλλαγές του mRNA που κωδικοποιεί EMMPRIN οι διαφορετικές ισομορφές της πρωτεΐνης EMMPRIN (EMMPRIN-1 έως -4) έχουν ταυτοποιηθεί. Μεταξύ αυτών των τεσσάρων παραλλαγών, EMMPRIN-2 είναι η πιο άφθονη ισομορφή εκφράζεται σε κύτταρα όγκου [19]. EMMPRIN-1 κωδικοποιεί το μεγαλύτερο, αμφιβληστροειδή ειδική ισομορφή, η οποία διακρίνεται από μια πρόσθετη ομοιάζουσα της Ig επικράτεια (τρεις περιοχές όμοιες με Ig συνολικά) στο εξωκυτταρικό τμήμα [20]. Οι άλλες δύο παραλλαγές, EMMPRIN-3 και EMMPRIN-4, προσδιορίστηκαν για πρώτη φορά σε ανθρώπινα κύτταρα ενδομητρίου στρωματικά και του τραχήλου της μήτρας κυτταρικές γραμμές καρκινώματος [19]. EMMPRIN-3 είναι η συντομότερη ισομορφή, που αποτελείται από ένα μόνο δίκην Ig περιοχής σε εξωκυτταρικό τμήμα του [21], και αλληλεπιδρά με την εσωτερίκευση EMMPRIN συμπλόκου υποδοχέα-συνδετήρα [19].

προηγούμενη μελέτη μας προσδιορίζονται EMMPRIN ως αποτελεσματικό στόχο για ανοσοθεραπεία για τη γλώσσα καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων [22]. Ωστόσο, τα ακριβή χαρακτηριστικά των ισομορφών EMMPRIN και τους ρόλους τους στην έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου παραμένουν άγνωστες. Ενώ EMMPRIN ισομορφή 3 είναι μία αποδεικνύεται αρνητικός ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού και της εισβολής των καρκινικών κυττάρων [23], EMMPRIN ισομορφές 1, 2 και 4 έχουν προταθεί ότι παίζουν ένα ογκογόνο ρόλο στην ανθρώπινη κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του στόματος. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τις θεμελιώδεις ρόλους των ισομορφών EMMPRIN στην πρόοδο του καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Τα ευρήματά μας αποδεικνύουν το σημαντικό ρόλο της EMMPRIN-2 και τους σχετικούς μηχανισμούς του στο κεφάλι και το λαιμό εισβολή καρκίνου και μετάσταση, για πρώτη φορά.

Υλικά και Μέθοδοι

1. Ανθρώπινους ιστούς και κυτταρικές σειρές που

Ένα σύνολο 51 ζεύγη καρκίνου κεφαλής και τραχήλου ιστούς και τα αντίστοιχα γειτονικά nontumorous ιστοί συλλέχθηκαν 2009-2011 στο Τμήμα Στοματικής και Γναθοπροσωπικής Χειρουργικής, Memorial Hospital Sun Yat-Sen, Sun Πανεπιστήμιο Yat-Sen, Guangzhou, Κίνα. Τα δείγματα ιστού αμέσως συμπληρωματικό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο μετά την εκτομή και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Τόσο οι οιδηματώδης και των παρακείμενων nontumorous ιστοί ιστολογικά εξετάστηκαν. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε για τη συλλογή όλων των ανθρώπινων υλικών και η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας του Memorial Hospital Sun Yat-sen στο Πανεπιστήμιο του Zhongshan. Όλα τα δείγματα που συλλέχθηκαν από ασθενείς πριν την κλινική θεραπεία. Κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Η

Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου κεφαλής και τραχήλου Tca8113 και ACCM ευγενικά παρέχεται από το Κολέγιο της Στοματολογίας, Shanghai Jiao Tong University (Σαγκάη, Κίνα) [24 ], [25]. κύτταρα TSCCA ευγενικά παρέχεται από την Sun Yat-Sen University Κέντρο Καρκίνου [26] και την πηγή των κυττάρων SCC25 περιγράφηκε στην προηγούμενη δημοσίευση μας [27]. Οι κυτταρικές γραμμές Tca8113 και ACCM καλλιεργήθηκαν σε RMPI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ενώ οι κυτταρικές γραμμές TSCCA3 και SCC25 καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen Carlsbad, CA). Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco), 100 IU /mL πενικιλλίνης G και 100 μg /mL θειικής στρεπτομυκίνης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), και τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 37 ° C θερμοκοιτίδες που περιέχει 5% CO

2 και μια υγρή ατμόσφαιρα.

2. Αντίστροφη μεταγραφή και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα ή τους ιστούς χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με το συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε με το σετ αντιδραστηρίων RT Prime-Script (Takara, Dalian, Κίνα). Ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με SYBR Premix Ex-Taq (Takara). Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται δείχνονται στον Πίνακα S1.

3. Western blotting

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ΝΡ-40 ρυθμιστικό λύσης που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και έναν αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ (Roche, Rotkreuz, Ελβετία). Μετά από διαχωρισμό με χρήση SDS-PAGE, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, USA). Στη συνέχεια, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris (TBS) που περιείχε 0,1% Tween-20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με τις σχετικές πρωτογενή αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C, πλύθηκαν, και διερευνήθηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο είδος-ειδική (Cell Signaling, Beverly, USA). Μια ενισχυμένη μέθοδος ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Pierce ECL Western Blotting Substrate, Thermol, Beverly, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση των κηλίδων. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-EMMPRIN, αντι-ΜΜΡ-2, αντι-υΡΑ, αντι-Καθεψίνη Β (Santa Cruz Biotechnology, USA), και αντι-β-ακτίνης (Sigma-Aldrich, ΜΟ, USA).

4. EMMPRIN-2 πλασμίδιο μορφώματα, επιμόλυνση, φακοϊό παραγωγή και την εγκατάσταση του σταθερώς κυτταρικές σειρές που εκφράζουν

Ο φορέας έκφρασης λεντοϊού EMMPRIN-2-pWPXL EMMPRIN-2 κατασκευάστηκε με αντικατάσταση του θραύσματος GFP του φορέα pWPXL (Addgene πλασμίδιο 12257 , Didier Trono) με την ακολουθία κωδικοποίησης του EMMPRIN-2 (αριθμός πρόσβασης NM_198589), η οποία ενισχύθηκε από τη βιβλιοθήκη cDNA ανθρώπινου ήπατος με τη χρήση EcoRI και BamHI τα ένζυμα κλωνοποίησης. Τα ολιγονουκλεοτίδια συντέθηκαν για να δημιουργηθεί Τα siRNAs ανόπτηση που στοχεύουν την αλληλουχία του EMMPRIN-2 από την θέση +430 έως 449 (5′-GTCGTCAGAACACATCAAC-3 ‘) και την αλληλουχία του Καθεψίνης Β από την θέση +670 έως 689 (5’-GTGGCCTCTATGAATCCCA- 3 ‘). Οι αλληλουχίες των ολιγονουκλεοτιδίων για τα πλασμιδικά κατασκευάσματα που παρατίθενται στον Πίνακα S2. Τα θραύσματα κλωνοποιήθηκαν ξεχωριστά στο φορέα pLVTHM (Addgene πλασμίδιο 12247, Didier Trono) χρησιμοποιώντας τις θέσεις περιορισμού ΜΙυΙ και ClaI. Λεντοϊών σωματίδια συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την συν-επιμόλυνση του pWPXL-EMMPRIN-2 ή pLVTH-shRNA με psPAX2 και pMD2.G σε κύτταρα ΗΕΚ-293Τ χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο επιμόλυνσης Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Τα κύτταρα-στόχοι (Tca8113 και ACCM) μετήχθησαν με ανασυνδυασμένο φακοϊό συν 6 μg /mL πολυβρενίου (Sigma-Aldrich). Μετά από 2 εβδομάδες καλλιέργειας σε επωαστήρα 37 ° C που περιέχει 5% CO

2 και μία υγρή ατμόσφαιρα, ολικό RNA και πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν και την έκφραση της EMMPRIN-2 ή Καθεψίνη Β περαιτέρω πιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας κηλίδα western και ποσοτική RT- PCR [28].

5. Σε προσδιορισμούς μετανάστευση και εισβολή vitro

Για τους προσδιορισμούς μετανάστευσης Transwell, 2 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν στην κορυφή του θαλάμου του κάθε ενθέτου (BD Biosciences, NJ). Για τους προσδιορισμούς εισβολής, 1 × 10

5 κύτταρα απλώθηκαν σε άνω θάλαμο του κάθε ενθέτου, το οποίο είχε επικαλυφθεί με 150 μg του Matrigel (BD Biosciences, ΜΑ). Τα κύτταρα σε αμφότερες τις δοκιμασίες τρυψινοποιήθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ, και 700-900 μί μέσου που είχε συμπληρωθεί με 10% ορό εμβρύου μόσχου προστέθηκε στους κάτω θαλάμους του κάθε φρεάτιο. Μετά από 12 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα που παραμένουν στην κορυφή θαλάμους ή στα άνω μεμβράνες των ενθέτων απομακρύνθηκαν προσεκτικά, και τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει ή εισβάλει στους κάτω θαλάμους σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα βαφής που περιέχει 0,1% κρυσταλλικό ιώδες και 20% μεθανόλη. Οι μεταναστεύουν και εισβάλλουν κύτταρα απεικονίστηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα IX71 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan). Τα ίδια πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές.

6. Δοκιμασία σύμφυσης κυττάρων

Μια δοκιμασία προσκόλλησης κυττάρου διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο που σκιαγραφήθηκε σε προηγούμενη δημοσίευση [29]. Για αυτόν τον προσδιορισμό, 96 φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες καλλιέργειας επικαλύφθηκαν με 30 μg του Matrigel (BD Biosciences, ΜΑ) σε ϋΜΕΜ για 3 ώρες στους 37 ° C. Πλάκες που είχαν επικαλυφθεί με λευκωματίνη 0,2% βόειου ορού (BSA) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας τρυψίνη /ΕϋΤΑ, πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επαναιωρήθηκαν σε DMEM. Τα κύτταρα (2.5 × 10

4) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά. Οι πλάκες ανακινήθηκαν στους 1000 rpm για 30 δευτερόλεπτα και πλύθηκαν τρεις φορές με ϋΜΕΜ προς απομάκρυνση μη συνδεδεμένων κυττάρων. Τα κύτταρα που παρέμειναν συνδέονται με τις πλάκες ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την κυτταρική Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) Δοκιμασία (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) σύμφωνα με τις συνιστώμενες οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την αφαίρεση του υποβάθρου δέσμευσης από BSA επικαλυμμένα φρεάτια των κυττάρων, το ποσοστό των προσκολλημένων κυττάρων υπολογίστηκε διαιρώντας την οπτική πυκνότητα των προσκολλημένων κυττάρων από εκείνο της αρχικής εισόδου κύτταρο. Τέλος, τα κύτταρα που είχαν καθοριστεί και χρωματίστηκαν σε ένα διάλυμα βαφής που περιέχει 0.1% ιώδες κρύσταλλο και 20% μεθανόλη απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο IX71 (Olympus). Όλα τα πειράματα προσκόλλησης διεξήχθησαν σε τριπλά φρεάτια και επαναλαμβάνεται τουλάχιστον τρεις φορές.

7. μοντέλα ποντικιού για την in vivo αναλύσεις μετάστασης

Για το

in vivo

αναλύσεις των μεταστατικών ικανότητες των κυτταρικών σειρών, κάθε γυμνό ποντίκι (δέκα ανά ομάδα, αρσενικά BALB /c-nu /nu ) είχε ουρά-ενδοφλέβια ένεση με 1 × 10

6 Tca8113 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά EMMPRIN-2 ή Tca8113 κύτταρα που εκφράζουν τον κενό φορέα. Οι ποντικοί θανατώθηκαν μετά από 6 εβδομάδες, και οι πνεύμονες αποκόπηκαν, στερεώθηκαν με φωσφορικό ρυθμιστικό ουδέτερη φορμαλίνη και εμβαπτισμένες σε παραφίνη. Μεταστατικές εστίες στους πνεύμονες μετρήθηκαν μικροσκοπικώς σε Η &? Ε-χρώση τομών ιστού. Τα ποντίκια χειραγωγείται και φυλάσσεται σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που είχαν εγκριθεί από την Ιατρική Πειραματική Επιτροπή Φροντίδας Ζώων Σαγκάη και η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας της Σαγκάης Medical College, Πανεπιστήμιο Fudan.

8. Ζελατίνη δοκιμασία ζυμογραφία

Η δοκιμασία ζυμογραφία ζελατίνης εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί η δραστικότητα της ΜΜΡ-2 [30]. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού, και το μέσο συλλέχθηκε μετά από 24 ώρες. Μέσο από ίσο αριθμό κυττάρων διαχωρίστηκε χρησιμοποιώντας γέλες ακρυλαμιδίου 10% που περιέχει 1 mg /ml του τύπου ζελατίνης Α (Sigma-Aldrich). Τα πηκτώματα επωάστηκαν σε 2.5% διάλυμα Triton-X-100 σε θερμοκρασία δωματίου με ήπια ανάδευση για την απομάκρυνση του SDS και επανα-φύση η ΜΜΡ-2. Τα πήγματα στη συνέχεια επωάστηκαν στις αναπτυσσόμενες ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM Tris-HCl, 0.2 Μ NaCl, 5 mM ΟαΟ

2, και 0,02% Brij35) για 24 ώρες στους 37 ° C για να προκληθεί λύση ζελατίνης από το επανουσιώθηκαν ΜΜΡ-2. Μετά την αντίδραση, τα πηκτώματα χρωματίστηκαν με διάλυμα χρώσης (0.1% Coomassie Brilliant Blue R250, 30% μεθανόλη και 10% οξικό οξύ) για 1 ώρα και αποχρωματίζονται σε ένα διάλυμα που περιέχει 30% μεθανόλη και 10% οξικό οξύ. Εικόνες των πηκτωμάτων αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας την ChemiDoc XRS + System (Bio-Rad). Τα ίδια πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές.

9. Προσδιορισμούς ELISA

παρασκευή

Δείγμα: Τα κύτταρα (2 χ 10

6) προστέθηκαν σε κάθε τρυβλίο 10 cm και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Για να αφαιρέσετε τα μη δεσμευμένα κύτταρα, τα τρυβλία πλύθηκαν τρεις φορές με μέσο χωρίς ορό. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με 15 ml μέσου άνευ ορού, και το μέσο συνελέγη χρησιμοποιώντας ένα Ultra στήλη 10Κ Amicon 15 ml (Millipore) μετά από 24 ώρες. δραστικότητα υΡΑ, οι συγκεντρώσεις Καθεψίνης Β ΜΜΡ-2 και ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας υΡΑ Activity Assay Kit (Millipore), ένα ανθρώπινο ΜΜΡ-2 Quantikine ELISA Kit (R &? D Systems) και μια ανθρώπινη καθεψίνη Β Duo Set Kit (R &? D Systems) σύμφωνα με τους κατασκευαστές συνιστώμενα πρωτόκολλα. Όλες οι αναλύσεις δειγμάτων διεξήχθησαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

10. Στατιστικές αναλύσεις

Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος +/- το πρότυπο σφάλμα του μέσου (SEM). Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας είτε μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ή t-test δύο ουρών Student, όπως προσδιορίζεται στα αντίστοιχα υπομνήματα σχήμα.

P

& lt? 0,05 ορίστηκε ως το επίπεδο της στατιστικής σημαντικότητας. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του SPSS 17.0.

Αποτελέσματα

1. EMMPRIN-2 υπερεκφράζεται σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου και συνδέεται με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου μετάσταση

Αν και αλλαγμένη έκφραση διαφόρων ισομορφών EMMPRIN έχει ενοχοποιηθεί ότι παίζει ένα ρόλο σε ογκογένεση HNC, οι μεμονωμένες συνεισφορές των διαφόρων EMMPRIN ισομορφές με την έναρξη και την πρόοδο της ΕΘΕΓ παραμένουν ασαφείς. Για να διευκρινιστεί περαιτέρω τους ρόλους των ισομορφών EMMPRIN σε HNC, εξετάσαμε την έκφραση των διαφορετικών ισομορφών EMMPRIN σε ιστούς HNC και κυτταρικές σειρές. Η έκφραση όλων των 4 ισομορφές EMMPRIN εξετάστηκε για πρώτη φορά στο 12 περιπτώσεις από του στόματος καρκινικούς ιστούς με τη χρήση ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου. Ενώ EMMPRIN ισομορφές 1, 2 και 4 έδειξαν σχετικά άφθονη έκφραση, EMMPRIN ισομορφή 3 ήταν δύσκολα ανιχνεύσιμη στους δοκιμάστηκαν από το στόμα καρκινικούς ιστούς (Σχήμα S1). Ως εκ τούτου, η συνεχής μελέτη μας επικεντρώθηκε στο ρόλο της EMMPRIN ισομορφές 1, 2 και 4 στο κεφάλι και την εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου. Η έκφραση του EMMPRIN ισομορφών 1, 2 και 4 αναλύθηκε περαιτέρω σε 51 όγκους HNC και συμφωνημένα κανονικά από το στόμα ιστούς τους χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, EMMPRIN-2 και EMMPRIN-4 φαίνεται να είναι οι κύριες ισομορφές που εκφράστηκαν στο κεφάλι και το λαιμό τους ιστούς, ενώ EMMPRIN-1 εμφανίζονται μόνο πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Παρατηρήσαμε ότι EMMPRIN-2 ήταν η μόνη ισομορφή EMMPRIN στα οποία τα επίπεδα έκφρασης του mRNA ήταν σημαντικά αυξημένα στους όγκους σε σύγκριση με τα συμφωνημένα παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς (Σχ. 1Α). Κατά προσέγγιση αυξάνει κατά 2 φορές (C /A, 1.90) κατά μέσο όρο επίπεδα έκφρασης EMMPRIN-2 ανιχνεύθηκαν σε ιστούς όγκων κατά τα παρακείμενα φυσιολογικούς μάρτυρες. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στη EMMPRIN-1 και την έκφραση EMMPRIN-4 mRNA ανιχνεύθηκαν μεταξύ των όγκων και των γειτονικών μη-καρκινικούς ιστούς (Σχ. 1Α).

(Α) έκφραση EMMPRIN mRNA σε 51 κεφαλή και τους ιστούς του τραχήλου και τα γειτονικά μη-καρκινικούς ιστούς αναλύθηκε χρησιμοποιώντας qPCR. EMMPRIN-2 mRNA έκφρασης στο κεφάλι και το λαιμό του όγκου των ιστών είναι υψηλότερο από ότι σε παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς (

ρ

& lt? 0,01). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση του mRNA EMMPRIN-1 και EMMPRIN-4 μεταξύ ιστών όγκου και των παρακείμενων μη-καρκινικούς ιστούς (

σ

& gt? 0,05). (Β) Σύγκριση της έκφρασης του mRNA EMMPRIN-2 μεταξύ 26 περιπτώσεις των μεταστατικών όγκων και 25 περιπτώσεις όγκων χωρίς κανένα σημάδι των τοπικών και απομακρυσμένων μεταστάσεων. EMMPRIN-2 mRNA έκφρασης ήταν σημαντικά αυξημένη σε μεταστατικό καρκίνο κεφαλής και τραχήλου ιστούς σε σύγκριση με μη μεταστατικό ιστούς καρκίνου κεφαλής και τραχήλου (

ρ

& lt? 0,05). ανιχνεύσεως (C) qPCR έκφρασης EMMPRIN mRNA σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. (Δ) Ανίχνευση της έκφρασης EMMPRIN σε κυτταρικές σειρές καρκίνου κεφαλής και τραχήλου, χρησιμοποιώντας Western blot. Τα υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το γονίδιο EMMPRIN-2 ανιχνεύθηκαν σε όλα τα 4 από τις κυτταρικές σειρές καρκίνου.

Η

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω η συσχέτιση μεταξύ EMMPRIN-2 έκφρασης και την εξέλιξη και τη μετάσταση των HNC, εμείς σε σύγκριση με την έκφραση του mRNA EMMPRIN-2 σε 26 περιπτώσεις των μεταστατικών όγκων και 25 περιπτώσεις όγκων χωρίς κανένα σημάδι των τοπικών και μακρινή μετάσταση. Ενώ οριακά αυξημένη έκφραση EMMPRIN-2 ανιχνεύθηκε σε όγκους σε σύγκριση με τα γειτονικά τους φυσιολογικούς ιστούς από ασθενείς με μη-μεταστατικούς όγκους (Εικ. 1Β), σημειώνονται διαφορές στο EMMPRIN-2 έκφραση παρατηρήθηκε μεταξύ των όγκων και των φυσιολογικών ιστών ελέγχου από ασθενείς με μεταστατικό όγκων (Σχ. 1Β). Επιπλέον, η έκφραση EMMPRIN-2 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε μεταστατικούς όγκους από ότι σε μη-μεταστατικούς όγκους (Εικ. 1Β). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στο φύλο ή την ηλικία των ασθενών με μεταστατικό και μη-μεταστατικούς όγκους βρέθηκαν.

Τα ευρήματα από τους ιστούς ΕΘΕΓ επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω από τις αναλύσεις που διεξήχθησαν στις HNSCC κυτταρικές σειρές (ACCM, Tca8113, TSCCA και SCC25). EMMPRIN-2 και EMMPRIN-4 ήταν οι κύριες ισομορφές που εκφράστηκαν σε όλες τις κυτταρικές σειρές 4, και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του EMMPRIN-2 ήταν πολύ υψηλότερα στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές (κυμαινόμενη από 0,05 έως 0,15, Εικ. 1 C) σε σχέση με το τα μη-καρκινικούς ιστούς HNC (το οποίο κατά μέσο όρο περίπου 0,01, το Σχ. 1Α). Υψηλά επίπεδα πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το γονίδιο EMMPRIN-2 ανιχνεύθηκαν επίσης σε όλες τις 4 καρκινικές κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας στύπωμα Western (Εικ. 1 D).

2. EMMPRIN-2 προάγει κεφαλής και αυχένα εισβολή των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση, και προσκόλληση in vitro και in vivo μετάσταση

Για τον προσδιορισμό των λειτουργικών ρόλων των EMMPRIN-2 υπερ-έκφραση στην εισβολή, τη μετανάστευση και την προσκόλληση των κυττάρων HNC , έχουμε πειραματικά υπερ-εκφράζεται και ρυθμισμένα προς τα κάτω έκφραση EMMPRIN-2 χρησιμοποιώντας ένα εξωγενές EMMPRIN-2 φορέα έκφρασης και siRNA (siEMMPRIN-2) στις κυτταρικές γραμμές κεφαλής και του τραχήλου, ACCM και Tca8113. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, η ενισχυμένη έκφραση του EMMPRIN-2 προωθείται κεφαλής και εισβολή κυττάρων του τραχήλου, την προσκόλληση και τη μετανάστευση τόσο στην ACCM και κυτταρικές σειρές Tca8113. Αντιθέτως, πειραματική ρύθμιση προς τα κάτω του EMMPRIN-2 με τη χρήση siRNA εξασθενημένο κύτταρο εισβολή, τη μετανάστευση και προσκόλληση στις κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν (Σχ. 2Α, Β και C).

Η εξωγενής υπερέκφραση του EMMPRIN-2 χρησιμοποιώντας μια έκφραση κατασκευάσει ενισχυμένη κεφαλής και του τραχήλου εισβολή καρκινικών κυττάρων (Α), της μετανάστευσης (Β) και προσκόλλησης (C), ενώ τα κάτω ρύθμιση EMMPRIN-2 χρησιμοποιώντας siRNA (siEMMPRIN-2) κατέστειλε κεφαλής και του τραχήλου εισβολή καρκινικών κυττάρων (Α), τη μετανάστευση ( Β) και πρόσφυσης (C). Οι διαφορές στο κελί εισβολή, τη μετανάστευση και προσκόλληση μεταξύ των construct- ή siRNA επιμολυσμένα ομάδες και τις εικονικές μάρτυρες ήταν στατιστικά σημαντική (

ρ

& lt? 0,05). Τα αποτελέσματα της έκφρασης EMMPRIN-2 επί μετάσταση όγκου in vivo ερευνήθηκαν περαιτέρω σε γυμνά μοντέλα ποντικού. (D) Tca8113 καρκίνου κεφαλής και τραχήλου κυτταρικές γραμμές με σταθερά εκφράζεται EMMPRIN-2 ή ένα ψευδο φορέα ελέγχου ενέθηκαν ενδοφλεβίως σε γυμνούς ποντικούς. Μεταστατικές εστίες στους πνεύμονες των γυμνών ποντικών υπολογίστηκαν την εβδομάδα 6 μετά την ένεση. Ο μέσος αριθμός των μεταστατικών εστιών στους πνεύμονες από ποντικούς με τις EMMPRIN-2 κύτταρα που εκφράζουν ήταν 28,4 σε σύγκριση με 6,4 στους πνεύμονες από τους ποντικούς που ενέθηκαν με κύτταρα που φέρουν τον φορέα ελέγχου (

ρ

& lt? 0,01).

Η

Εμείς επεκταθεί περαιτέρω in vitro παρατηρήσεις μας για να εξετάσει τα αποτελέσματα της EMMPRIN-2 για τη μετάσταση των κυττάρων ΕΘΕΓ in vivo. Tca8113 κύτταρα σταθερώς που υπερεκφράζουν EMMPRIN-2 ή ο φορέας ελέγχου ενέθηκαν ενδοφλεβίως σε γυμνούς ποντικούς μέσω της ουραίας φλέβας. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν 6 εβδομάδες μετά τις ενέσεις και οι πνεύμονες αποκόπηκαν, στερεώθηκαν με φωσφορικό ρυθμιστικό ουδέτερη φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη. Μεταστατικές εστίες στους πνεύμονες των γυμνών ποντικών μετρήθηκαν μικροσκοπικώς σε Η &? Ε βαμμένες τομές ιστού. Σημαντικά υψηλότερο αριθμό μεταστατικών εστιών παρατηρήθηκαν στους πνεύμονες των ποντικών που είχαν ενεθεί με κύτταρα που εκφράζουν Tca8113 EMMPRIN-2. Ο μέσος αριθμός των μεταστατικών εστιών στους πνεύμονες από ποντικούς με τις EMMPRIN-2 κύτταρα που εκφράζουν ήταν 28,4, σε σύγκριση με 6,4 στους πνεύμονες από τα ποντίκια που είχαν ενεθεί με τα κύτταρα Tca8113 που φέρουν το φορέα ελέγχου (Σχ. 2D).

3. EMMPRIN-2 υπερέκφραση προωθεί την έκκριση των εξωκυτταρικών μορίων σηματοδότησης ΜΜΡ-2, υΡΑ και Καθεψίνης Β σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα

EMMPRIN έχει καλώς αποδειχθεί ότι αυξάνουν την καρκινικών κυττάρων εισβολή σε αρκετές ανθρώπινες κακοήθειες αυξάνοντας την έκφραση των εξωκυτταρικών μορίων σηματοδότησης ΜΜΡ-2 και υΡΑ [6], [10], [31], [32]. Επιπλέον, η καθεψίνη Β, ένα μέλος της λυσοσωματικής πρωτεολυτικού ενζύμου οικογένεια Καθεψίνη, έχει επίσης αναφερθεί ότι παίζει κρίσιμο ρόλο στην εισβολή καρκίνου και μετάσταση [33]. Για τον προσδιορισμό των υποκείμενων μηχανισμών που διέπουν τις επιδράσεις των EMMPRIN-2 επί των καρκινικών κυττάρων εισβολή και μετάσταση, εξετάσαμε την έκφραση και την έκκριση του υΡΑ, καθεψίνη Β και ΜΜΡ-2 σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κυττάρων μετά από εξωγενώς διαμορφώνοντας την έκφραση του EMMPRIN-2. Η επιμόλυνση ενός φορέα έκφρασης EMMPRIN-2 ή siRNA (siEMMPRIN) επιλεκτικά ενισχυμένη ή εξασθενημένα την έκφραση της EMMPRIN-2 στο επίπεδο του mRNA τόσο στην ACCM και κυττάρων Tca8113, ενώ η έκφραση των άλλων ισομορφών EMMPRIN, υΡΑ, Καθεψίνη Β και ΜΜΡ -2 παρέμεινε ανεπηρέαστη (εικ. 3Α). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν η έκφραση της πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας στύπωμα Western (Σχ. 3Β).

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του υΡΑ, η καθεψίνη Β, ΜΜΡ-2 και διαφορετικές ισομορφές EMMPRIN σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα εξετάστηκαν μετά εξωγενή έκφραση του EMMPRIN-2. Η επιμόλυνση ενός φορέα έκφρασης EMMPRIN-2 ή siRNA (siEMMPRIN) επιλεκτικά ενισχυμένη ή εξασθενημένα τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του EMMPRIN-2 και στα δύο ACCM και κυττάρων Tca8113, ενώ η έκφραση άλλων ισομορφών EMMPRIN, υΡΑ, Καθεψίνη Β και ΜΜΡ-2 παρέμεινε ανεπηρέαστη (

σ

& gt? 0,05). ευρήματα έκφρασης (Β) Το mRNA επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας στύπωμα western. (C) Ανίχνευση του εξωκυτταρικού ΜΜΡ-2, Καθεψίνη Β και υΡΑ χρησιμοποιώντας ELISA. ΜΜΡ-2, έκκριση Καθεψίνη Β και υΡΑ στο μέσο καλλιέργειας αυξήθηκε σε κύτταρα που είχαν επιμολυνθεί με τον φορέα έκφρασης EMMPRIN-2, ενώ η έκκριση μειώθηκε σε EMMPRIN 2-siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (

ρ

& lt? 0.05). (Δ) ανάλυση των εξωκυτταρικής δραστηριότητας ΜΜΡ-2 χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ζελατίνης ζυμογραφία. δραστηριότητα Εξωκυτταρική ΜΜΡ-2 αυξήθηκε μετά την έκφραση EMMPRIN-2 ενισχύθηκε, ενώ η δραστηριότητα των ΜΜΡ-2 μειώθηκε μετά EMMPRIN-2 knockdown έκφραση.

Η

Επιπλέον, εξετάσαμε τα εξωκυτταρικά επίπεδα και των τριών πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας ELISA. Τα εξωκυτταρικά επίπεδα της ΜΜΡ-2, υΡΑ και Καθεψίνη Β στο μέσο καλλιέργειας κυττάρων αυξήθηκε κατά EMMPRIN-2 διαμόλυνση φορέα έκφρασης και μειώθηκαν κατά EMMPRIN-2 διαμόλυνση siRNA τόσο ACCM και κυττάρων Tca8113 (Σχ. 3C). Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι EMMPRIN-2 προάγει ειδικά την εξωκυτταρική έκκριση, παρά την έκφραση, του υΡΑ, ΜΜΡ-2 και Καθεψίνη Β σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κύτταρα. Τα αποτελέσματα του EMMPRIN-2 επί ΜΜΡ-2 εξωκυτταρική έκκριση περαιτέρω επαλήθευσε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ζελατίνης ζυμογραφία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, εξωκυτταρική δραστικότητα ΜΜΡ-2 αυξήθηκε σε αμφότερες ACCM και Tca8113 κύτταρα που είχαν επιμολυνθεί με τον φορέα έκφρασης EMMPRIN-2, ενώ εξωκυτταρικής δραστηριότητας ΜΜΡ-2 μειώθηκαν στις κυτταρικές γραμμές που είχαν επιμολυνθεί με EMMPRIN-2 siRNA (Εικ. 3D).

4. Καθεψίνη Β είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής των επιπτώσεων EMMPRIN-2 επί την εισβολή, τη μετανάστευση και προσκόλληση καρκίνου κεφαλής και λαιμού κύτταρα

Για τον προσδιορισμό του λειτουργικού ρόλου της Καθεψίνης Β σε EMMPRIN-2 που προκαλείται από την εισβολή, τη μετανάστευση και προσκόλληση, εμείς κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση Καθεψίνης Β σε κύτταρα που υπερεκφράζουν Tca8113 EMMPRIN-2 χρησιμοποιώντας καθεψίνη Β siRNA. Η θεραπεία με καθεψίνη Β siRNA είχε ως αποτέλεσμα αντίστοιχες μειώσεις στις Καθεψίνη Β mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης στα δύο γονικών και EMMPRIN-2 κύτταρα που υπερεκφράζουν Tca8113, ενώ EMMPRIN-2 και ΜΜΡ-2 δεν επηρεάστηκαν από Καθεψίνη Β διαμόλυνση (Σχ. 4Α και Β). Εξωκυτταρική έκκριση του Καθεψίνης Β μειώθηκε επίσης με κατεργασία siRNA σε κύτταρα Tca8113, τόσο με την παρουσία και απουσία του EMMPRIN-2 υπερέκφραση (Εικ. 4C). Όπως παρατηρήθηκε στα πειράματα που περιγράφονται ανωτέρω, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν Tca8113 EMMPRIN-2 εμφανίζεται αυξημένη κυτταρική εισβολή, τη μετανάστευση και προσκόλληση σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα Tca8113 (Εικόνα 4D). Σε αντίθεση, ρύθμιση προς τα κάτω της καθεψίνης Β χρησιμοποιώντας siRNA ανέστειλε σημαντικά την εισβολή, τη μετανάστευση και την προσκόλληση των κυττάρων Tca8113 υπερεκφράζουν EMMPRIN-2 (Εικ. 4D), εμπλέκοντας την λειτουργική σημασία της Καθεψίνης Β σε EMMPRIN-2-διαμεσολαβούμενη σηματοδότηση για εισβολή όγκου και . μετάσταση

(Α) Η θεραπεία με Καθεψίνης Β siRNA οδήγησε σε αντίστοιχες μειώσεις στα επίπεδα καθεψίνη Β mRNA τόσο EMMPRIN-2 υπερέκφραση και γονικών κυττάρων Tca8113 (

σ

& lt? 0,05), ενώ EMMPRIN -2 και ΜΜΡ-2 δεν επηρεάστηκαν από καθεψίνη Β siRNA επιμόλυνση (

σ

& gt? 0,05). (Β) Οι επιπτώσεις στην Καθεψίνη Β, EMMPRIN-2 και την έκφραση ΜΜΡ-2 μετά Καθεψίνη Β siRNA επιμόλυνση σε EMMPRIN-2 που υπερεκφράζουν και γονικά κύτταρα Tca8113 περαιτέρω επιβεβαιωμένη χρησιμοποιώντας αναλύσεις western blot. (Γ) Η εξωκυτταρική έκκριση της Καθεψίνης Β μειώθηκε επίσης με κατεργασία siRNA σε κύτταρα Tca8113 τόσο με την παρουσία και απουσία του EMMPRIN-2 υπερέκφραση (

ρ

& lt? 0,05). (D) Όπως παρατηρήθηκε στα παραπάνω πειράματα, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν Tca8113 EMMPRIN-2 επέδειξαν αυξημένη κυτταρική εισβολή, τη μετανάστευση και προσκόλληση σε σύγκριση με γονικά κύτταρα Tca8113. Αντίθετα, προς τα κάτω ρύθμιση της Καθεψίνης Β χρησιμοποιώντας siRNA ανέστειλε σημαντικά την εισβολή, τη μετανάστευση και την προσκόλληση των κυττάρων Tca8113 υπερεκφράζουν EMMPRIN-2.

Η

Συζήτηση

Παρά την πρόοδο που έχει σημειωθεί στη θεραπεία του τοπικά προχωρημένο καρκίνο κεφαλής και λαιμού, η πρόγνωση παραμένει μελαγχολική, και 5-ετή επιβίωση δεν υπερβαίνει το 40% [34]. Τοπική υποτροπή και μετάσταση είναι υπεύθυνοι για την πλειονότητα των θανάτων που οφείλονται σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου.