Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο, και μεγαλύτερη από 90 % των καρκίνων του πνεύμονα είναι ο καπνός των τσιγάρων που σχετίζονται με. Οι τρέχουσες θεραπευτικές επιλογές είναι ανεπαρκής, επειδή η μοριακή βάση του τσιγάρου που προκαλείται καρκίνος του πνεύμονα είναι ελάχιστα κατανοητή.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Εδώ, δείχνουμε ότι ανθρώπινα πρωτογενή ή αθανατοποιημένα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα εκτίθενται σε ο καπνός του τσιγάρου για οκτώ ημέρες σε καλλιέργεια πολλαπλασιαστούν ταχέως, δείχνουν ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, και οι όγκοι μορφή σε γυμνούς ποντικούς. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο από τα πρώτα στάδια της ογκογένεσης καπνού προκαλούμενη, εξετάσαμε τις μοριακές αλλαγές που οδηγούν σε καρκίνο του πνεύμονα. Παρατηρήσαμε ότι οι οδοί εμβρυϊκά σηματοδότησης που προκαλούνται από Hedgehog και Wnt ενεργοποιείται από τον καπνό. Η φαρμακολογική αναστολή αυτών των οδών μπλοκάρει το μετασχηματισμένο φαινότυπο.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Αυτά τα πειράματα παρέχουν ένα μοντέλο στο οποίο μπορεί να προκληθεί τα πρώτα στάδια της ογκογένεσης καπνού που προκαλείται από, και θα πρέπει να μας επιτρέπουν τον εντοπισμό μοριακές αλλαγές οδήγηση αυτή τη διαδικασία. Τα αποτελέσματα που έχουν επιτευχθεί μέχρι στιγμής δείχνουν ότι ο καπνός που προκαλείται από όγκους του πνεύμονα οδηγούνται από την ενεργοποίηση των δύο εμβρυϊκών ρυθμιστικών μονοπατιών, Hedgehog (Hh) και Wnt. Με βάση την τρέχουσα και τις αναδυόμενες διαθεσιμότητα των φαρμάκων να αναστέλλουν HH και σηματοδότηση Wnt, είναι πιθανό ότι η κατανόηση του ρόλου των hh και Wnt στην παθογένεια του καρκίνου του πνεύμονα θα οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπειών

Αιτιολογική αναφορά.: Lemjabbar-Alaoui Η, Dasari V, Sidhu SS, Mengistab Α, Finkbeiner W, Gallup M, et al. (2006) Wnt και Hedgehog είναι κρίσιμα Μεσολαβητών του τσιγάρου καπνού-Induced καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 1 (1): E93. doi: 10.1371 /journal.pone.0000093

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Carl-Philipp Heisenberg, Ινστιτούτο Max Planck της Βιολογίας Κυττάρου Μοριακής Γενετικής, Γερμανία

Ελήφθη: 4 Οκτώβρη 2006? Αποδεκτές: 9 Νοεμβρίου, 2006? Δημοσιεύθηκε: 20η Δεκεμβρίου 2006

Copyright: © 2006 Lemjabbar-Alaoui et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις R01 HL075602 και P01 HL024136 από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η Παγκόσμια Οργανισμός υγείας αναφέρει ότι περίπου 1,25 δισεκατομμύρια άνθρωποι καπνίζουν τσιγάρα σε καθημερινή βάση [1] και ότι το κάπνισμα θα προκαλέσει περίπου 10 εκατομμύρια θανάτους ετησίως από το έτος 2030 [2]. Περίπου το ένα τέταρτο των θανάτων αυτών θα είναι από καρκίνο του πνεύμονα. Η μοριακή παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα παραμένει ασαφής, αλλά μόλις κατανοητή, θα μπορούσε να ανοίξει το δρόμο για θεραπείες.

Αρκετές προσεγγίσεις έχουν χρησιμοποιηθεί για να αξιολογηθεί η μοριακή παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα τσιγάρου καπνού προκαλούμενη [3]. Μία προσέγγιση χρησιμοποιεί μοντέλα ζώων στα οποία ποντίκια που εκτέθηκαν σε καπνίζουν καθημερινά για πέντε έως δέκα μήνες (για επισκόπηση βλέπε [4]. Αν και οι όγκοι αναπτύσσονται σε ποντικούς, έχουν ήδη συμβεί τα βασικά βήματα στην ογκογένεση και όγκους εμφανίσει μια πληθώρα γενετικών ανωμαλιών. Επιπλέον , δεν ζωικά είδη καπνίζουν τσιγάρα με τον τρόπο οι άνθρωποι. Τρωκτικά, για παράδειγμα, είναι υποχρεωτικά breathers μύτη, με αποτέλεσμα ένα πολύ διαφορετικό μοντέλο της διήθησης των σωματιδίων στα ρουθούνια και της ανώτερης αναπνευστικής οδού από εκείνη που παράγεται από το στόμα αναπνοή (δηλαδή, τσιγάρο καπνίσματος σε . ανθρώπους) Έτσι, αυτά τα

in vivo

μελέτες σε ζώα παρέχουν ατελή μοντέλα για την έκθεση του ανθρώπου Άλλες μελέτες έχουν αξιολογήσει τις ατομικές συνεισφορές των επιμέρους συστατικών του καπνού η οποία πιστεύεται ότι συμβάλλουν στην καρκινογένεση του καπνού (π.χ. 4- (μεθυλονιτροζαμινο). – 1- (3-πυριδυλ) -1-βουτανόνη (ΝΝΚ), [5], [6] και το βενζο (α) πυρένιο [7]. Αυτή η προσέγγιση είναι προβληματική λόγω της εγγενούς πολυπλοκότητας του καπνού των τσιγάρων. Έτσι, είναι πιθανό ότι η βιολογική απόκριση σε ένα σύνθετο μίγμα όπως ο καπνός του τσιγάρου δεν είναι απλώς το άθροισμα των πολλαπλές ανεξάρτητες τοξικοτήτων.

μια άλλη προσέγγιση είναι να εξάγει τα συστατικά στον καπνό που εκπέμπεται από την καύση των τσιγάρων με διοχέτευση μέσω ενός υδατικού διαλύματος. Τέτοια παρασκευάσματα, που ονομάζεται εκχύλισμα καπνό του τσιγάρου (CSE), έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως πρώτη ύλη σε διάφορα συστήματα [8], [9]. Είναι σημαντικό, ΧΑΚ περιέχει περισσότερες από τις ενώσεις που εισπνέεται από τους καπνιστές. Έτσι, η χρήση αυτού του τύπου της προετοιμασίας καπνού στον πολιτισμό παρέχει ένα σημαντικό και χρήσιμο μοντέλο για την εκτίμηση της τοξικότητας του καπνού του τσιγάρου.

Σε αυτή τη μελέτη έχουμε αναπτύξει ένα

in vitro

μοντέλο για την αξιολόγηση φαινοτυπική οι αλλαγές στον καπνό προκαλούμενη ογκογένεση που είναι μια γρήγορη, εύκολη και επαναλήψιμη δοκιμασία στην οποία καλλιεργούνται βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα εκτίθενται στο Χρηματιστήριο Αξιών Κύπρου.

Αποτελέσματα

η χρόνια έκθεση στον καπνό προκαλεί φαινοτυπική αλλάζει χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων

μιμήθηκε πρώτα τις επιπτώσεις της έκθεσης στον καπνό του τσιγάρου χρόνια κατ ‘επανάληψη την αντιμετώπιση μη-καρκινικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα BEAS-2Β [10] με Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου στον πολιτισμό. Εμείς επεξεργασμένα κύτταρα BEAS-2B για 0 ​​έως 8 ημέρες με Πρόσωπα που ακολουθείται από μια περίοδο ανάρρωσης τριών εβδομάδων. Πρόσωπα προκάλεσε μια εξαρτώμενη από το χρόνο τοξικότητα σε BEAS-2Β κύτταρα (Σχήμα 1Α). Δημιουργήσαμε επτά κυτταρικών πληθυσμών, που ορίζεται Β1, Β2, Β3, Β5, Β6, Β7 και Β8, το καθένα αντιπροσωπεύει κύτταρα που παρέμειναν βιώσιμα μετά την καθορισμένη έκθεση σημείο χρόνου σε ημέρες. B0 κύτταρα αντιπροσωπεύουν τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Οι κυτταρικοί πληθυσμοί που προέκυψαν από τα λίγα κύτταρα τα οποία επέζησαν τα τοξικά αποτελέσματα της έκθεσης καπνού για 8 ημέρες (κύτταρα Β8) απέκτησε φαινοτυπικές αλλαγές οι οποίες περιλαμβάνονται ενισχυμένη τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 1Β), και μικρότεροι χρόνοι διπλασιασμού.

Χρόνια καπνός έκθεση επάγει τοξικότητα και αλλαγές που σχετίζονται με κυτταρικό μετασχηματισμό. Α: Η τοξικότητα που προκαλείται από την έκθεση στον καπνό. Ορατή είναι καλλιεργημένα κύτταρα BEAS-2Β μετά από 0, 4 και 8 ημέρες ανάπτυξης σε εκχύλισμα καπνού μέσο που περιέχει. Β: Δοκιμασία πολλαπλασιασμού σε κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν για 1-5 ημέρες, που προέρχεται από κύτταρα Πρόσωπα που εκτίθενται σε 4 χρονικά σημεία (0,3,7 και 8 ημέρες). Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± s.e.m. * P & lt? 0.001. C: δοκιμασίες προσκόλλησης κυττάρων-υπόστρωμα για πλαστικά, πλακούντα κολλαγόνου και φιμπρονεκτίνης χρησιμοποιώντας καλλιεργημένα κύτταρα BEAS-2Β μετά το καθορισμένο χρονικό σημείο σε ημέρες ανάπτυξης σε εκχύλισμα καπνού μέσο που περιέχει. Δοκιμασίες αναλύθηκαν μετά από 60 λεπτά σε καλλιέργεια. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν S.E.M. n = 4 * P & lt? 0.001. D: Κυττάρων δοκιμασίες μετανάστευσης χρησιμοποιώντας καθιερωμένες κυτταρικές σειρές μετά από 24 ώρες σε καλλιέργεια. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± s.e.m. n = 4 * P & lt? 0.001. Ε: ακτίνη του κυτταροσκελετού των κυτταρικών σειρών B0 και Β8 απεικονίζεται με μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας Alexa Fluor 594 phalloidin. Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 20 μm.

Η

κύτταρα ΧΑΚ εκτίθενται έδειξε μειωμένη πρόσφυση κυττάρων-υποστρώματος (σχήμα 1Γ), αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων (Εικόνα 1Δ) και άλλαξε τη μορφολογία και τη δομή του κυτταροσκελετού. Β8 κύτταρα ήταν πιο στρογγυλεμένες και είχε αυξηθεί συσσωμάτωση και παρουσίασαν αλλοιωμένη κατανομή ακτίνης ινών στρες όταν χρωματίζονται με Alexa Fluor 594 συζευγμένο με φαλλοειδίνη σε σύγκριση με τα πατρικά αντίστοιχά (B0) (Σχήμα 1 Ε). Αλλαγές παρατηρήθηκαν επίσης για Β6 και Β7, αλλά όχι για κύτταρα κατεργασμένα για μικρότερες χρονικές περιόδους. Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, την ανάλυση του RNA με PCR, συγκρίνοντας Β8 και γονικής ομόλογό B0 τους, έδειξαν ενεργοποίηση των γονιδίων που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυκλίνης D1 και c-myc (Σχήμα S1).

Η χρόνια έκθεση σε καπνό προκαλεί αγκυροβόλιο ανεξάρτητη από την ανάπτυξη των κυττάρων και το σχηματισμό όγκων άτριχων ποντικών

από τα μορφολογικά ανάπτυξη, την προσκόλληση και τη μετανάστευση αλλοιώσεις που παράγονται από χρόνια έκθεση στο ΧΑΚ θύμιζαν φαινοτύπων χαρακτηριστικό ογκογονικώς μετασχηματισμένα κύτταρα, έχουμε το επόμενο ερώτημα εάν τα κύτταρα του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου με φάρμακο ήταν σε θέση να αγκύρωσης ανάπτυξη ανεξάρτητη καλλιεργώντας τους σε μαλακό άγαρ. Εστιάσαμε στα κύτταρα Β8, η οποία είχε τη μεγαλύτερη έκθεση στο ΧΑΚ. Με 10 ημέρες, οι αποικίες του ΧΑΚ εκτεθειμένων κύτταρα που σχηματίζονται σε μαλακό άγαρ, επιβεβαιώνοντας ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, ενώ B0 κύτταρα δεν σχηματίζουν αποικίες (Εικόνα 2Α).

Η χρόνια έκθεση σε καπνό προκαλεί αύξηση σε μαλακό άγαρ και σχηματισμό όγκων σε γυμνούς ποντικούς. Α: Anchorage ανεξαρτησία προσδιορίστηκε με την ικανότητα των κυττάρων ΧΑΚ εκτεθειμένων να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ. B0 ή Β8 κύτταρα (1 χ 10

3) αναπτύχθηκαν σε μαλακό άγαρ για 15 ημέρες πριν από την φωτογράφηση. Ποσοτικοποίηση των αποικιών φαίνεται στα δεξιά. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά 5 πειραμάτων. Β: σχηματισμός όγκου σε γυμνούς ποντικούς, 4 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό με B0 ή Β8 κύτταρα. Τα βέλη δείχνουν μεγάλες μάζες όγκου που σχηματίζεται σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με Β8 κύτταρα. C: Τμήμα ενός αντιπροσωπευτικού όγκου από ένα ποντίκι εμβολιάζεται με Β8 κύτταρα χρωματίζονται με Η και Ε D: Εικόνες από μαλακό δοκιμασίες άγαρ χρησιμοποιώντας κύτταρα HBE μετά από καμία έκθεση σε καπνό (P0) ή να ανακτηθούν τα κύτταρα HBE μετά από 8 ημέρες από την έκθεση του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου (P8) . Ποσοτικοποίηση των αποικιών φαίνεται στα δεξιά. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά 5 πειραμάτων. Ε: σχηματισμός όγκου σε γυμνούς ποντικούς, 4 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό με κύτταρα P0 και P8. Τα βέλη δείχνουν μεγάλες μάζες όγκου που σχηματίζεται σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα Ρ8. ΣΤ: Τμήμα ενός αντιπροσωπευτικού όγκου από ένα ποντίκι εμβολιάζεται με κύτταρα P8 χρωματίστηκαν με Η και Ε Κλίμακα μπάρες αντιπροσωπεύουν 50 μm.

Η

επόμενο εμφυτεύονται B0 ή ΧΑΚ επεξεργασμένα (Β1 έως Β8) κύτταρα σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια (γυμνή) για να προσδιορίσετε αν το ογκογόνο μετασχηματισμό προχωρήσει όλη τη διαδρομή προς την γένεσιν όγκων. Δεν όγκοι σχηματίστηκαν ακόμη και μετά από 3 μήνες σε γυμνούς ποντικούς που έχουν εγχυθεί με κύτταρα ελέγχου (B0), ή Β1-Β7 κύτταρα (τα δεδομένα δεν δείχνονται) (n = 5 για κάθε κυτταρική σειρά). Ωστόσο, όλα τα ποντίκια (η = 5) εμφυτεύθηκαν Β8 κύτταρα ανέπτυξαν όγκους με μία λανθάνουσα περίοδο από περίπου 4 εβδομάδες, υποδεικνύοντας μία υψηλή απόδοση του ποντικού ογκογονικότητα (Σχήμα 2Β). Η ιστολογική χαρακτηρισμός επιβεβαίωσε ότι τα κύτταρα που σχηματίζονται Β8 καρκινωμάτων. Οι όγκοι που αποτελείται από μεταβλητά μεγέθους φωλιές πολυεδρικά κύτταρα, τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με λεπτές λωρίδες του στρώματος. Αυτά τα καρκινικά κύτταρα ήταν μετρίως pleiomorphic με σχήματα από γύρο σε επιμήκη. Πυρήνες ήταν εμφανή και συχνά πολλαπλά. Μιτωτικά σχήματα έχουν εύκολα φανεί (Σχήμα 2C). Δημιουργήσαμε τέσσερις κυτταρικές γραμμές όγκου από Β8 όγκους όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Όταν αυτά τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε γυμνά ποντίκια, σχημάτισαν όγκους στην θέση ένεση με μια μικρότερη λανθάνουσα κατάσταση (1-2 εβδομάδες) από τα γονικά κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

έκθεση στον καπνό προκαλεί μετασχηματισμό των ανθρώπινων πρωτογενών επιθηλιακών κύτταρα

Από BEAS-2Β είναι μια SV40-απαθανάτισε βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή, μπορούμε στη συνέχεια ρώτησε αν οι αλλαγές που προκαλούνται καπνού που παρατηρείται στα κύτταρα BEAS-2B θα μπορούσε να αναπαραχθεί σε πρωτογενή ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (HBE). έκθεσης ΧΑΚ οδήγησε σε μια ταχεία μετατροπή σε πρωτογενή κύτταρα HBE όπως επιβεβαιώνεται και από τα δύο

in vivo

και τον πολιτισμό πειράματα. Απομονώσαμε κυτταρικές σειρές από HBE εκτεθεί σε καπνό για 0-8 ημέρες και έχει οριστεί να P0-P8. Τα κύτταρα P8 αποκτήσει την ικανότητα να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ, ενώ δεν έχουν εκτεθεί τα κύτταρα ελέγχου δεν είχε (Σχήμα 2D). κύτταρα Ρ8, αλλά όχι γονικών αντίστοιχά τους P0, έδειξαν ενεργοποίηση των γονιδίων που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυκλίνης D1 και c-myc (Σχήμα S1). Είναι σημαντικό ότι, σε οκτώ ημέρες από την έκθεση σε ΧΑΚ ήταν επαρκής για την παραγωγή κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων ΗΒΕ? τα κύτταρα P8 σχηματίζονται όγκοι σε γυμνούς ποντικούς σε 5 εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό, ενώ δεν έχουν εκτεθεί τα κύτταρα ελέγχου P0 δεν είχε (Σχήμα 2Ε και 2F). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι ΧΑΚ μπορεί να μετατρέψει μη καρκινικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα σε καρκινικά φαινότυπο.

ΧΑΚ προκαλεί η σηματοδότηση Wnt και Hedgehog μονοπάτια

επόμενο διερεύνησαν τις πιθανές μοριακών μηχανισμών που διέπουν η μετάβαση στην ανάπτυξη του όγκου που προκαλείται από την έκθεση στο ΧΑΚ. Η ακατάλληλη επαναδραστηριοποίηση των οδών σηματοδότησης εμβρυϊκών σε ενήλικα κύτταρα όπως Wnt [11], Hedgehog [12] και Notch [13], μπορεί να παρέχει μια κινητήρια δύναμη για την ανάπτυξη του όγκου. Ως εκ τούτου, προσδιορίστηκαν για Wnt, σκαντζόχοιρος και η δραστηριότητα Notch χρησιμοποιώντας λουσιφεράσης δημοσιογράφους ανταποκρίνεται στους παράγοντες μεταγραφής που εκπροσωπούν το περιφερικό βραχίονα τελεστή κάθε μονοπατιού, που απασχολούν TOPFLASH, Gli-λουσιφεράσης και Hes-λουσιφεράσης δημοσιογράφους αντίστοιχα.

Βρήκαμε ότι το μέγεθος της δραστηριότητας ρεπόρτερ TOPFLASH αυξήθηκε προοδευτικά με την έκθεση στον καπνό από 1 έως 8 ημέρες (Σχήμα 3Α), με Β8 κύτταρα δείχνει ένα & gt? 25 φορές σε σύγκριση με την επαγωγή B0 κύτταρα. Gli-δραστικότητας ανταποκριτή λουσιφεράσης αυξήθηκε επίσης με παρατεταμένο χρόνο έκθεσης στο Χρηματιστήριο Αξιών Κύπρου, με Β8 κύτταρα δίνοντας μια & gt? Επαγωγή 7 φορές πάνω από B0 κύτταρα (Εικόνα 3Β). Αντίθετα, CSE έκθεσης είχε καμία επίδραση στην Hes1-λουσιφεράσης δραστικότητα (Σχήμα 3C), υποδεικνύοντας ότι η οδός Notch δεν ενεργοποιήθηκε σε κύτταρα Πρόσωπα που εκτίθενται.

Η χρόνια έκθεση σε καπνό επάγει την Wnt και Hedgehog μονοπάτια σηματοδότησης Α : Wnt σηματοδότηση δοκιμασία του καπνού πληθυσμούς που έχουν εκτεθεί Beas-2b κυττάρων μετά από επιμόλυνση με TOPFLASH /FOPFLASH κατασκευάσματα αναφοράς της λουσιφεράσης. Β: κύτταρα Beas-2b επιμολύνθηκαν με Gli-ΤΚ ή ΤΚ- μόνος για να προσδιοριστεί σηματοδότηση Hh. C: δοκιμασία σηματοδότησης Notch στα κύτταρα Beas-2b χρησιμοποιώντας HES αναφοράς της λουσιφεράσης. D, Ε και F: Ίδιο όπως στο Α, Β και C, χρησιμοποιώντας κυτταρικών πληθυσμών HBE. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± s.e.m. n = 6 * P & lt? 0.001.

Η

Αυτά τα πρότυπα δραστηριότητας ρεπόρτερ επίσης αναπαραχθεί για πειράματα που πραγματοποιούνται με την πρωτογενή κύτταρα HBE εκτίθενται στο ΧΑΚ. Τόσο TOPFLASH (Εικόνα 3D) και Gli (Σχήμα 3Ε) δραστηριότητα δημοσιογράφος αυξάνεται προοδευτικά με την έκθεση στον καπνό από P1 έως P8, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές για HES-1 δραστηριότητας της λουσιφεράσης (Σχήμα 3F).

Για να επιβεβαιώσετε ότι δραστηριότητα ανταποκριτή αντικατοπτρίζει την αυξημένη σηματοδότηση Wnt, εξετάσαμε την υποκυτταρική θέση του β-κατενίνης. Συνεπής με ένα ενεργοποιημένο μονοπάτι Wnt /β-κατενίνης, παρατηρήσαμε πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης σε Β8 και P8 κύτταρα με ανοσοκυτταροχημεία (Σχήμα 4Α και Β). Επιπλέον, με ανοσοκυτταροχημεία ήταν προφανές ότι Gli1 μετατοπίζεται στους πυρήνες σε Β8 και P8 κυττάρων αποδεικνύοντας ενεργοποίηση μονοπατιού Hh (Σχήμα 4C και D).

Wnt και σηματοδότηση Hedgehog συνδέονται με φαινοτυπικές μεταβολές που προκαλούνται από χρόνια έκθεση καπνό. Α: Η ανοσοχρώση δείχνει αυξημένα επίπεδα β-κατενίνης (πράσινο) στον πυρήνα του Β8 κυττάρων σε σύγκριση με B0 κύτταρα και Β: στον πυρήνα των κυττάρων P8 σε σύγκριση με P0. C: Η ανοσοχρώση δείχνει αυξημένη έκφραση του Gli (κόκκινο) στον πυρήνα του Β8 κυττάρων σε σύγκριση με B0 κύτταρα και D: σε κύτταρα P8 σε σύγκριση με P0. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 20 μm.

Η

Δεδομένου ότι οι οδοί Wnt και ΗΗ είναι σημαντικές στην εμβρυϊκή και την ανάπτυξη των βλαστικών κυττάρων, ρωτήσαμε αν τυχόν εμβρυϊκών δείκτες επανενεργοποιήθηκαν μετά την χρόνια έκθεση του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου. Αξίζει να σημειωθεί ότι, CSE-μετασχηματισμένα ΗΒΕ και κύτταρα BEAS-2Β που εκφράζεται δύο κύτταρο-ειδικούς δείκτες στέλεχος, Stellar και Oct4 [14] (Εικόνα S2). Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η χρόνια έκθεση Πρόσωπα επάγει τα εμβρυϊκά μονοπάτια σηματοδότησης Wnt και Hh συγχρόνως ότι τα κύτταρα αποκτούν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ και όγκους μορφή σε γυμνούς ποντικούς.

Αναστολείς Wnt και Hh επηρεάζουν μετασχηματισμό από ΧΑΚ

Συνηθίζαμε δίπλα αναστολείς για να καθοριστεί εάν αυτές ενεργοποιούνται μονοπάτια σηματοδότησης ήταν υπεύθυνος για τις λειτουργικές μεταβολές στις ΧΑΚ μετασχηματισμένα βρογχικών κυττάρων. Η οδός-ειδικός αναστολέας Hh, κυκλοπαμίνη κατέστειλε σημαντικά την ικανότητα του Β8 και Ρ8 κύτταρα να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ (Σχήμα 5Α και Β). Σουλινδάκη, ένας Wnt αναστολέα οδού ειδικά, μειώθηκε επίσης το σχηματισμό αποικιών, αλλά ήταν κάπως λιγότερο αποτελεσματική από την κυκλοπαμίνη. Αντιθέτως, tomatidine, ένα αδρανές ανάλογο κυκλοπαμίνη, NS-398 (COX-2 αναστολέας) και GSI (ένας ισχυρός αναστολέας Notch μονοπάτι) ήταν χωρίς επίδραση.

Αναστολείς Hh και σηματοδότηση Wnt μπλοκάρει ανεξάρτητο από αγκύρωση ανάπτυξη και την κυτταρική υπερπλασία του ΧΑΚ εκτίθενται κυττάρων. Α: Η ικανότητα των κυττάρων της χρόνιας καπνού εκτεθειμένα (Β8), ή Β: (P8), να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ για 15 ημέρες προσδιορίστηκε μετά τη θεραπεία με tomatidine, κυκλοπαμίνη, σουλινδάκη, NS398, GSI ή ελέγχου του οχήματος. Ποσοτικοποίηση των αποικιών φαίνεται στα δεξιά. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά 5 πειραμάτων. C: B0 και Β8 κύτταρα σε καλλιέργεια μετά από θεραπεία με tomatidine, κυκλοπαμίνη, σουλινδάκη ή ελέγχου του οχήματος.

Η

Θεραπεία της B0 κυττάρων σε καλλιέργεια μονοστοιβάδας με κυκλοπαμίνη ή sulindac δεν μετέβαλε μεταβολές στην κυτταρική πυκνότητα ή τη μορφολογία μετά από 6 ημέρες σε καλλιέργεια, σε σύγκριση με τους μάρτυρες που περιελάμβαναν μη-κατεργασμένα κύτταρα ή κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με tomatidine, NS- 398 ή GSI (Σχήμα 5C). Σε αντίθεση, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στην πυκνότητα κυττάρου σε Β8 κύτταρα κατεργασμένα με κυκλοπαμίνη ή sulindac, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ή κύτταρα που κατεργάζονται με tomatidine. Κύτταρα κατεργασμένα με NS-398 ή GSI (τα δεδομένα δεν φαίνονται) παρέμειναν αμετάβλητες. Η πλειονότητα των κυττάρων Β8 έλαβαν κυκλοπαμίνη αποσπαστεί από την πλάκα καλλιέργειας κατά την διάρκεια της περιόδου αγωγής, και τα λίγα υπόλοιπα κύτταρα εμφανίστηκαν απλαστική, δηλαδή, δεν εμφανίζουν αύξηση ή αλλαγή στη δομή. Έτσι, η αγκύρωση ανεξάρτητη και μονοστιβάδα ανάπτυξη κυττάρων ΧΑΚ-μετασχηματισμένων απαιτεί την οδό Hh και, σε μικρότερο βαθμό, μονοπάτι Wnt. Για να προσδιοριστεί ο μηχανισμός δράσης των αναστολέων μονοπατιού Wnt και Hh, αξιολογήσαμε πολλαπλασιασμό, τη βιωσιμότητα και την απόπτωση (Σχήμα S3 και S4). Χρησιμοποιώντας ενσωμάτωση και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορισμούς BrdU για να μετρηθεί προσδιορισμούς κυτταρικού πολλαπλασιασμού και αννεξίνης να αξιολογήσει κυττάρου απόπτωση, βρήκαμε ότι ούτε κυκλοπαμίνη ούτε σουλινδάκη παράγεται αλλαγές στην B0 κύτταρα. Ωστόσο, κυκλοπαμίνη προκάλεσε σημειώνονται απόπτωση σε Β8 κύτταρα, η οποία συνοδεύεται από σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. θεραπεία σουλινδάκη προκάλεσε μια μέτρια, αλλά σημαντική αύξηση στην απόπτωση των κυττάρων Β8 (αν και λιγότερο από κυκλοπαμίνη) και μια μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. θεραπείες ελέγχου με μέσο ελέγχου που περιέχουν tomatidine ή DMSO μόνο ήταν χωρίς αποτέλεσμα. Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν το συμπέρασμα ότι η ενεργοποίηση των εμβρυϊκών μονοπατιών Wnt και Hh, αλλά δεν Notch, είναι ένας σημαντικός συνεισφέρων στον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση του ΧΑΚ-μετασχηματισμένα κύτταρα.

Επιπλέον, η θεραπεία είτε με κυκλοπαμίνη ή σουλινδάκ καταργηθεί μεταγραφική δραστηριότητα του μονοπάτι Wnt καθορίζεται από τη δραστηριότητα TOPFLASH σε Β8 κύτταρα (Σχήμα 6Α), αλλά ήταν χωρίς αποτέλεσμα σε B0 κύτταρα. Tomatidine-επεξεργασμένα κύτταρα δεν έδειξαν σημαντικές αλλαγές στη δραστηριότητα TOPFLASH σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Σημαντικά, ενώ κυκλοπαμίνη θεραπεία προκάλεσε σημαντική μείωση στην Hh μονοπάτι μεταγραφική δραστικότητα όπως μετράται με δραστικότητα Gli-λουσιφεράσης σε κύτταρα Β8, σουλινδάκη ήταν χωρίς αποτέλεσμα επί της δραστικότητας TOPFLASH (Σχήμα 6Β). Ούτε τα ναρκωτικά επηρεάζεται B0 κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η οδός Hh μπορεί να λειτουργεί προς την αντίθετη κατεύθυνση του μονοπάτι Wnt σε Β8 κύτταρα

Αναστολή της Wnt και Hedgehog σηματοδότηση μειώνει το μέγεθος του όγκου σε γυμνούς ποντικούς Α:. Επίδραση των αναστολέων Wnt και Hh για σηματοδότηση Wnt σε B0 vs . Β8 κύτταρα χρησιμοποιώντας TOPFLASH /FOPFLASH κατασκευάσματα αναφοράς της λουσιφεράσης. Β: Επίδραση των αναστολέων Wnt και Hh σε σηματοδότηση Hh σε B0 vs. κύτταρα επιμολυσμένα με Β8 Gli-ΤΚ ή ΤΚ μόνο. C: Αντιπροσωπευτικά όγκοι αποκόπηκαν από ποντικούς μετά χωρίς αγωγή (Con) ή μετά από 15 ημέρες θεραπείας με φάρμακα όπως υποδεικνύεται. Γραφήματα δείχνουν τη σύγκριση του όγκου του όγκου (cm

3) και το βάρος (gm). Veh είναι μόνο όχημα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν ± s.e.m. n = 5 * P & lt? 0.001. D:. Η και Ε χρώση των αντιπροσωπευτικών όγκων σχηματίζονται σε ποντικούς που έχουν εγχυθεί με Β8 κύτταρα και θεραπεία με φάρμακα όπως υποδεικνύεται

Η

Πρόσωπα-κατεργασμένα κύτταρα ΗΒΕ έδειξε επίσης έκθεση χρονο-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των Hh και Wnt μονοπάτια σηματοδότησης σε δοκιμασίες ανταποκριτή (Σχήμα 3) και με πυρηνική συσσώρευση του β-κατενίνης και Gli1 (Σχήμα 4). Και πάλι, οι αναστολείς του Hh και σηματοδότηση Wnt, αλλά όχι Notch αναστολείς σηματοδότησης (Σχήμα 5Β και Σχήμα S5) μπλοκάρει ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και κυτταρική υπερπολλαπλασιασμό τους. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μετασχηματισμένο φαινότυπο των μετασχηματισμένων κυττάρων καπνού πρωτογενών HBE είναι επίσης Hh και σηματοδότηση Wnt εξαρτώμενη.

Η θεραπεία με αναστολείς των μονοπατιών Wnt και Hedgehog μειώνει την ανάπτυξη των όγκων που προκύπτουν από βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα καπνού μετασχηματίζονται σε ποντίκια

στη συνέχεια, προσδιορίζεται αν αναστέλλοντας μονοπάτια Wnt και Hh θα επηρεάσει το

in vivo

ανάπτυξη των όγκων που προκαλούνται από κύτταρα του Χρηματιστηρίου Αξιών Κύπρου-μεταμορφωθεί. Γυμνά ποντίκια με καθιερωμένους υποδόριους όγκους ξενομοσχεύματος που προέρχονται από Β8 κύτταρα παρουσίασαν 80% και 92% μείωση στη μάζα του όγκου και ο όγκος αντίστοιχα μετά από 15 ημέρες θεραπείας κυκλοπαμίνης σε σύγκριση με την ομάδα άνευ αγωγής και ελέγχου ομάδα που έλαβε όχημα (Σχήμα 6C). Ομοίως, παρατηρήσαμε μια 53% και 72% μείωση στη μάζα του όγκου και ο όγκος αντίστοιχα στα ζώα σουλινδάκη αγωγή σε σύγκριση με τους χωρίς θεραπεία ελέγχους. Επιπλέον, η ταυτόχρονη θεραπεία με σουλινδάκη και κυκλοπαμίνη (και οι δύο αναστολείς χρησιμοποιήθηκαν στη μισή συγκέντρωση που χρησιμοποιείται σε προηγούμενα πειράματα), είχε ως αποτέλεσμα σημαντικά μεγαλύτερη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ΧΑΚ-μετασχηματίζεται, σε σύγκριση με το ενιαίο θεραπείες με κάθε αναστολέα μόνο του (Σχήμα S6). Οι ιστολογικές αναλύσεις των συλλεγμένων όγκων αποκάλυψε μια ινωτικής εκφυλισμό των όγκων τόσο στην κυκλοπαμίνη και ομάδες που έλαβαν σουλινδάκη (Σχήμα 6D). Οι όγκοι αυτοί έδειξαν χαλαρά επιθηλιακά αδρανών υλικών με μεγάλη ποσότητα διάσπαρτα μεσέγχυμα. Οι όγκοι από τους χωρίς θεραπεία ελέγχους ή ζώα υπό αγωγή με όχημα αποκάλυψε μια συμπαγή μάζα των επιθηλιακών κυττάρων. Αυτά τα πειράματα έδειξαν ότι τα εμβρυϊκά μονοπάτια σηματοδότησης Hh και Wnt είναι σημαντικοί παράγοντες για τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και τον σχηματισμό όγκων του ΧΑΚ-μετασχηματισμένα κύτταρα BEAS-2Β.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι χρόνια έκθεση στον καπνό του τσιγάρου εξαγάγετε εύκολα μπορεί να βλάψει πνεύμονα επιθηλιακά κύτταρα, προκαλώντας υπερπλασικά ανάπτυξης, μετασχηματισμού κακοήθων κυττάρων και την καρκινογένεση. Τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ότι οι πρωτογενή ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα και SV40-αθανατοποιημένα κύτταρα BEAS-2Β που επιβιώνουν από 8 ημέρες επανειλημμένης έκθεσης ΧΑΚ προικισμένα με φαινοτυπικές αλλαγές που είναι χαρακτηριστικές της ογκογόνο μετασχηματισμό: μεταβολή στην κινητική ανάπτυξης, αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, μειωμένη προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος , αυξημένη δραστικότητα μετανάστευσης, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, και, το σημαντικότερο, την ικανότητα να παράγουν όγκους σε γυμνούς ποντικούς. Δείχνουμε για πρώτη φορά ότι η χρόνια έκθεση Πρόσωπα μπορούν να μετατρέψουν αποτελεσματικά μη καρκινική πρωτογενή και αθανατοποιημένα, τα ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα

in vitro

σε ένα καρκινικό φαινότυπο. Η προσέγγιση αυτή προσφέρει ένα νέο εργαλείο για τη μελέτη της ανάπτυξης των όγκων του πνεύμονα.

Η πρόοδος του όγκου εμφανίζεται γενικά σε χρονικά και χωρικά επικαλυπτόμενες φάσεις, που αποτελείται από τις προκαρκινικές υπερπλασία, δυσπλασία, καρκίνωμα

in situ

και επεμβατική καρκίνος [15]. Οι επιπτώσεις της έκθεσης στον καπνό εμφανίζονται επίσης σε στάδια. Μετά την έκθεση στον καπνό βλέπουμε πρώτη υπερπλασία των κυττάρων του πνεύμονα. Σε προηγούμενη εργασία, αναφέραμε ότι αυτή η υπερπλασία των κυττάρων που προκαλείται από την ενεργοποίηση του καπνού προκαλούμενη από υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα [16]. Η προκύπτουσα υπερπλασία του πνεύμονα είναι επιζήμια, επειδή προσαγωγές που προκαλούνται από τις καρκινογόνες ουσίες του καπνού παράγει μεταλλάξεις κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του DNA. Έχουμε παρατηρήσει επίσης μια πρόωρη επαγωγή της έκφρασης του ογκοπρωτεΐνη Bcl2, ένα αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη η οποία ρυθμίζει την επιβίωση των κυττάρων (αδημοσίευτη παρατήρηση). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα αυτά τεκμηριώνεται ο καπνός που προκαλείται μετασχηματισμός των φυσιολογικών βρογχικών επιθηλιακών κυττάρων σε ογκογόνα κύτταρα στο σύστημά μας.

Η ανώμαλη επανενεργοποίηση των αναπτυξιακών μονοπατιών Hh και Wnt έχει εμπλακεί στην ανάπτυξη του καρκίνου [11], [17 ]. Στον πνεύμονα, αυτά τα μονοπάτια παίζουν πολύπλευρο ρόλο? η ενεργοποίηση τους είναι κρίσιμης σημασίας για την ανάπτυξη των πνευμόνων, ενώ απορρύθμιση τους μπορεί να οδηγήσει σε φλεγμονώδεις ασθένειες όπως η πνευμονική ίνωση και ο μετασχηματισμός του καρκίνου. β-κατενίνης είναι ένας βασικός παράγοντας στο μονοπάτι Wnt, μετάδοση σημάτων Wnt στον πυρήνα και κριτικά συμβάλλουν στην ογκογένεση μέσω της ενεργοποίησης των ογκογονιδίων (π.χ. κυκλίνης D1 και c-myc) ή μέσω των δικών σποραδικές μεταλλάξεις του (αναθεωρηθούν [18]. Είναι σημαντικό , συστατικά Wnt /β-κατενίνης συχνά μεταλλάσσεται ή υπερεκφράζεται σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα και η αναστολή τους διεγείρει απόπτωση σε αυτά τα κύτταρα [19], [20].

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η οξεία επιθηλιακών αεραγωγών αποτελέσματα αναγέννηση σε ευρεία ενεργοποίηση ενδοεπιθηλιακών σηματοδότηση Hh, όπως υποδεικνύεται από την έντονη έκφραση αμφότερων των συνδετών Hh και του παράγοντα μεταγραφής Gli, οι οποίες είναι το συστατικό τελεστή σηματοδότησης Hh σε θηλαστικά [11]. Στους ανθρώπους, μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα, ένα θανατηφόρο κακοήθεια των αεραγωγών συνδέονται στενά με έκθεση καπνός του τσιγάρου, εξαρτάται από την ενεργοποίηση του μονοπατιού Hh Sonic [11]. Αυτή η οδός ενεργοποιείται επίσης σε ανθρώπινο πνεύμονα πλακωδών καρκινωμάτων και κάποιων αδενοκαρκινώματα των πνευμόνων που προκαλείται από την έκθεση καπνό του τσιγάρου [12], [21].

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκθεση του ΧΑΚ ενεργοποιεί Wnt /β-κατενίνης και τη σηματοδότηση Hh σε βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον, η διέγερση αυτών των οδών συμπίπτει με τη φάση όταν τα κύτταρα αποκτούν την ικανότητα να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ και όγκους μορφή σε γυμνούς ποντικούς. Η κατεργασία αυτών των μετασχηματισμένων κυττάρων με αναστολείς ΗΗ ή Wnt μπλοκαριστεί το σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ, και ποντίκια που εμβολιάστηκαν με τα κύτταρα καπνού μετασχηματισμένα έδειξαν εκφύλιση των όγκων όταν έλαβαν θεραπεία με είτε αυτών των αναστολέων. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η Wnt /β-κατενίνης και μονοπάτια Hh διαδραματίζει αιτιολογικό ρόλο στην έναρξη, τη συντήρηση, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση του ΧΑΚ μετασχηματισμένα επιθηλιακά κύτταρα.

Από τις μελέτες μας, η ενεργοποίηση Wnt μονοπατιού φαίνεται να προηγείται Hh ενεργοποίηση μονοπατιού κατά τη διάρκεια της χρόνιας έκθεσης ΧΑΚ, όπως συνάγεται από τις παρατηρήσεις ότι η αγωγή με κυκλοπαμίνη μειώνεται έντονα τη δραστικότητα σηματοδότησης Wnt σε αυτά τα κύτταρα, αλλά η θεραπεία με σουλινδάκη δεν επηρέασε σηματοδότηση Hh. Επιπλέον, η οδός Hh φαίνεται να παίζει ένα σχετικά ισχυρότερο ρόλο από σηματοδότηση Wnt στη διατήρηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και την επιβίωση των κυττάρων σε ΧΑΚ-μετασχηματισμένα κύτταρα.

Έτσι, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν μια ιεραρχική και συνεργική σχέση μεταξύ του Hh και Wnt μονοπάτια στο τσιγάρο καρκίνο του πνεύμονα καπνού που προκαλείται σηματοδότησης. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με μια πρόσφατη έκθεση ότι οι ινδικές Hh ανταγωνίζεται σηματοδότηση Wnt στη διαφοροποίηση επιθήλιο του κόλου και του παχέος καρκινικά κύτταρα [22]. Έτσι, διακριτές σχέσεις μπορεί να υπάρχουν μεταξύ αυτών των εμβρυϊκών μονοπάτια μέσα σε διαφορετικούς τύπους όγκων.

Ένα σημαντικό αλλά άλυτο ερώτημα είναι κατά πόσον η ενεργοποίηση αυτών των εμβρυϊκών μονοπάτια είναι αρκετή για να προκαλέσει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα.

μας τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η οδός Wnt ενεργοποιείται σε κύτταρα που εκτίθενται σε καπνό για μικρότερες χρονικές περιόδους (≥2 ημέρες) (Σχήμα 3Α και D). Ωστόσο, μόνο 8 ημέρα τα κύτταρα καπνού που εκτίθενται ήταν ικανά αγκύρωσης ανάπτυξη ανεξάρτητη και σχηματισμό όγκων in vivo. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση της οδού Wnt από μόνη της δεν είναι αρκετή για να προκαλέσει την πλήρη κακοήθη μετασχηματισμό των φυσιολογικών κυττάρων του πνεύμονα. Σε συμφωνία με αυτό, έχει δειχθεί ότι Wnt μονοπάτι αποτελεί παράγοντα προαγωγής του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) προκληθείσα ανθρωπίνων κερατινοκυττάρων κακοήθη μετασχηματισμό. Παρ ‘όλα αυτά, αυτή η μελέτη έδειξε επίσης ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt την απουσία HPV δεν ήταν επαρκής για να επάγει κακοήθη μετασχηματισμό [23].

Τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι η ενεργοποίηση λαμβάνει χώρα σε Hh κύτταρα εκτίθενται επανειλημμένα να καπνίζουν για ≥ 7 ημέρες σε αθανατοποιημένα κύτταρα BEAS2B και ≥2 ημέρες σε πρωτογενή κύτταρα ΗΒΕ (Σχήμα 3Β και Ε). Παρά το γεγονός ότι, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η επιβίωση αυτών των κυττάρων που απαιτείται δραστηριότητα Hh (τα δεδομένα δεν φαίνονται), δεν παρατηρήθηκαν όγκοι σχηματίστηκαν ακόμη και μετά από 3 μήνες σε γυμνούς ποντικούς που ενέθηκαν με B0-Β7 κύτταρα ή κύτταρα P0-P7 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, όλοι οι ποντικοί εμφυτεύθηκαν με Β8 ή P8 κύτταρα ανέπτυξαν όγκους. Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν επίσης ότι η ενεργοποίηση Hh δεν είναι επαρκής για να προκαλέσει πλήρη κακοήθη μετασχηματισμό των κυττάρων του πνεύμονα.

Όλα μαζί τα ευρήματα μας δείχνουν ότι ενώ η ενεργοποίηση των κανονικών Wnt και Hh οδός είναι αναγκαία για την ογκογένεση, άλλα γονοτυπική καπνό προκαλούμενη αλλαγές καλούνται επίσης να προκαλέσει την πλήρη κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων του πνεύμονα.

Τέλος, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ΧΑΚ-μετασχηματισμένα κύτταρα εκφράζουν βλαστικών κυττάρων-ειδικούς δείκτες. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι τα βλαστικά κύτταρα μπορεί να είναι η πηγή των μεταλλαγμένων κυττάρων που προκαλούν όγκους και να διατηρήσουν την ανάπτυξή τους [24]. Οι όγκοι μπορεί να προκύψουν και να αναπτυχθεί ως αποτέλεσμα του σχηματισμού των καρκινικών βλαστικών κυττάρων, τα οποία αν και μπορεί να περιλαμβάνει μόνο μια μειοψηφία των κυττάρων εντός ενός όγκου, μπορεί εντούτοις να είναι κρίσιμη για τον πολλαπλασιασμό του. Αυτό αυξάνει την πιθανότητα ότι η έκθεση του ΧΑΚ δύναται να στοχεύουν βλαστικά κύτταρα ή επάγουν το σχηματισμό των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου. απαιτούνται περαιτέρω έρευνες για να ελέγξει την υπόθεση αυτή.

Τα ευρήματα αυτά εγείρουν την πιθανότητα ότι οι αναστολείς της οδού Wnt και Hh μπορεί να είναι η βάση για νέες θεραπευτικές μέθοδοι για την αντιμετώπιση του καπνίσματος που προκαλείται από τον καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Το ανθρώπινο βρογχικά επιθηλιακά κυτταρική γραμμή BEAS-2Β (που ελήφθη από την ATCC) χρησιμοποιήθηκε σε αυτές τις μελέτες. Αυτά τα κύτταρα είναι εξαρτώμενα από αγκίστρωση και μη ογκογόνα σε γυμνά ποντίκια. κύτταρα BEAS-2Β αναπτύχθηκαν με μετασχηματισμό με το SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο. κύτταρα BEAS-2Β διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1% (ν /ν) 10.000 μονάδες /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη σε ατμόσφαιρα 5% CO

2 στους 37 ° C.

Πρωτογενή ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ΗΒΕ) χρησιμοποιήθηκαν επίσης σε αυτές τις μελέτες. Ορίσαμε πρωτογενή (P0) πολιτισμούς ως κύτταρα τοποθετούνται αμέσως μετά την απομόνωση. Βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας μεθόδους που περιγράφονται προηγουμένως [25], [26].