Αφηρημένο

Θεραπεία της μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) και καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) έχουν ουσιαστικά αλλάξει τα τελευταία χρόνια με την εισαγωγή των αναστολέων του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) στην κλινική πρακτική. Η κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν κύτταρα ευαισθησία σε αυτά τα φάρμακα είναι απαραίτητα για τη βέλτιστη χρήση τους.

Μία in vitro μοντέλο της επίκτητης αντίστασης σε δύο αναστολείς κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙ) στοχεύουν EGFR, erlotinib και gefitinib, και σε μία ΤΚΙ στόχευση EGFR και VEGFR, βανδετανίμπη, αναπτύχθηκε από τη συνεχή επεξεργασία η ανθρώπινη κυτταρική σειρά NSCLC CALU-3 και την ανθρώπινη κυτταρική γραμμή CRC HCT116 με κλιμακούμενες δόσεις του κάθε φαρμάκου. ΜΤΤ, Western Blot ανάλυση, τη μετανάστευση, εισβολή και προσδιορισμούς ανεξάρτητη από προσκόλληση σχηματισμού αποικιών διεξήχθησαν in vitro και πειράματα με την καθιερωμένη ξενομοσχεύματα σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς διεξήχθησαν in vivo σε ευαίσθητες, άγριου τύπου (WT) και ΤΚΙ-ανθεκτική CALU-3 και HCT116 κυτταρικές σειρές.

σε σύγκριση με WT CALU-3 και HCT116 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές παρουσίασαν σημαντική αύξηση στα επίπεδα των ενεργοποιημένων, φωσφορυλιωμένης ΑΚΤ, ΜΑΡΚ, και της survivin. Λαμβάνοντας υπόψη τον ρόλο των RAS και RAF ως κατάντη σήματα τόσο του EGFR και μονοπάτια VEGFR, υποβάλλαμε σε αγωγή ανθεκτικών κυττάρων με sorafenib, ένας αναστολέας της C-RAF, Β-RAF, ο-ΚΙΤ, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3, και ΡϋΟΡΡ-β. Sorafenib μείωσε την ενεργοποίηση των ΜΕΚ και ΜΑΡΚ και προκάλεσε μια αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, εισβολή, τη μετανάστευση, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη in vitro και της ανάπτυξης του όγκου in vivo όλων ΤΚΙ-ανθεκτικές γραμμές CALU-3 και κυττάρων HCT116.

Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η αντίσταση σε αναστολείς του EGFR οδηγείται κυρίως από τον /RAF οδού RAS /ΜΑΡΚ και μπορεί να ξεπέρασε με τη θεραπεία με sorafenib

Παράθεση:. Morgillo F, Martinelli Ε, Troiani T, Orditura M, De Vita F, Ciardiello F (2011) αντικαρκινική δράση της Sorafenib στον ανθρώπινο καρκίνο κυτταρικές γραμμές με επίκτητη ανθεκτικότητα σε EGFR και αναστολείς VEGFR κινάσης τυροσίνης. PLoS ONE 6 (12): e28841. doi: 10.1371 /journal.pone.0028841

Επιμέλεια: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Ιταλία

Ελήφθη: May 25, 2011? Αποδεκτές: 16 Νοεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 9 Δεκεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Morgillo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από την Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Μιλάνο, Ιταλία. Floriana Morgillo είναι ο αποδέκτης μιας Ευρωπαϊκής Εταιρείας Ιατρικής Ογκολογίας (ESMO) μεταγραφική έρευνα υποτροφία. οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) είναι ένα κεντρικό ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού και της εξέλιξης του καρκίνου των κυττάρων σε διάφορους ανθρώπινους τύπους καρκίνου. Η κλινική αποτελεσματικότητα των αναστολέων EGFR (cetuximab, panitumumab, erlotinib, gefitinib και βανδετανίμπη) εισήγαγε στην κλινική πρακτική για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκίνων περιορίζεται σε μια υποομάδα ασθενών με την πλειονότητα των ασθενών με καρκίνο που δείχνει είτε εγγενής ή επίκτητη ανθεκτικότητα σε αυτά τα φάρμακα [1].

Οι πρόσφατες πρόοδοι στη γνώση των μηχανισμών της βιολογίας του καρκίνου και της ανθεκτικότητας στα φάρμακα έχουν εντοπίσει, μεταξύ των ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης, που δρουν ως κατάντη στον EGFR, η ΑΚΤ και RAS /RAF /που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) οδών ως μείζων υπεύθυνο για την ανάπτυξη αντοχής των καρκινικών κυττάρων σε αναστολείς EGFR [2] – [4].

Ωστόσο, αποδείξαμε πρόσφατα ότι, σε in vitro μη μικροκυτταρικό μας κύτταρο καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) μοντέλο της επίκτητης αντίστασης στην erlotinib και gefitinib, η θεραπεία με διάφορους παράγοντες που είναι γνωστό ότι στοχεύουν άμεσα ή έμμεσα, η AKT οδό σηματοδότησης, όπως ad LY294002, deguelin και everolimus, δεν ήταν αποτελεσματική στην αναστολή erlotinib- (ERL-) και gefitinib – (GEF-) ανθεκτικός πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων [5]

από την άλλη πλευρά, οι μεταλλάξεις του γονιδίου K-RAS έχει περιγραφεί τόσο σε NSCLC και του παχέος εντέρου (CRC) ασθενείς ως υπεύθυνος για μια φτωχή πρόγνωση. και η κακή απόκριση σε αναστολείς EGFR [6]. Αυτές οι μεταλλάξεις προκαλούν πρωτεΐνες KRAS να συσσωρεύονται στο GTP-δεσμευμένη, δραστική μορφή που οδηγεί σε ιδιοσυστατική, παράγοντα ανάπτυξης υποδοχέα ανεξάρτητη ενεργοποίηση του KRAS κατάντη σηματοδότησης σε κύτταρα όγκου [7]. Η ανάπτυξη θεραπευτικών στρατηγικών για ασθενείς με μεταλλάξεις KRAS είναι επομένως μια σημαντική κλινική γκολ. RAF κινασών σερίνης-θρεονίνης είναι οι κύριοι τελεστές της RAS στο ΜΑΡΚ μονοπάτι σηματοδότησης και συνεπώς είναι ένας δυνητικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου. Μέχρι σήμερα, η πιο επιτυχημένη κλινική αναστολέας της δράσης της RAF είναι sorafenib (Nexavar, ΒΑΥ 43-9006) [8] – [10], ένας από του στόματος διαθέσιμος αναστολέας πολλαπλών-στόχων κινάσης, που εμποδίζει την ενεργοποίηση του C-RAF, Β-RAF (τόσο το άγριου τύπου και το ενεργοποιημένο V600E μεταλλάκτη), c-kit, FLT-3, RET, υποδοχέας του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα 2 (VEGFR-2), VEGFR-3, και β του υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια (PDGFR- β) [8] – [10], έχει ήδη εγκριθεί για τη θεραπεία του μεταστατικού καρκινώματος των νεφρών (RCC) και για τις προηγμένες ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC), και υπό διερεύνηση σε άλλες κακοήθειες. Sorafenib επηρεάζει την ανάπτυξη του όγκου με άμεση αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την προώθηση της απόπτωσης σε μια ποικιλία τύπων όγκου, καθώς και με αναστολή προκαλούμενη από όγκο νεοαγγειογένεσης.

Το εργαστήριο μας έχει παράσχει πρόσφατα ενδείξεις συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ sorafenib με ερλοτινίμπη ή μεταξύ sorafenib και cetuximab, ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που στοχεύει την εξωκυτταρική περιοχή του υποδοχέα EGF, σε ένα πάνελ του NSCLC και κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC),

in vitro

και

in vivo

, η οποία συνοδεύεται από έντονη και παρατεταμένη αναστολή της MAPK- και ενδοκυτταρικά σήματα ΑΚΤ-εξαρτώμενη [11].

Υποθέσαμε ότι η θεραπεία με sorafenib θα μπορούσε να ξεπεράσει την επαγόμενη EGFR ΤΚΙ-αντίσταση από την ικανότητά της να μπλοκάρει αρκετές αυξητικού παράγοντα σήματα υποδοχέα-οδηγείται. Επιπλέον, επειδή μπλοκ sorafenib B-RAF, και θα μπορούσε να είναι αποτελεσματική σε καρκινικές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν την ενεργοποίηση K-RAS μεταλλάξεις.

Στην παρούσα μελέτη, έκθεση σχετικά με την ανάπτυξη και για το χαρακτηρισμό του ανθρώπινου NSCLC και CRC κυτταρικές γραμμές με επίκτητη αντίσταση σε δύο αναστολείς κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙ) στοχεύουν EGFR, erlotinib και gefitinib, και ΤΚΙ στόχευσης EGFR, VEGFR και RET, βανδετανίμπη, και σχετικά με τα αντικαρκινικά αποτελέσματα του sorafenib σε αυτές τις ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου.

Αποτελέσματα

Ανάπτυξη και χαρακτηρισμός ΤΚΙ-ανθεκτική CALU-3 και του καρκίνου HCT116 κύτταρα

το ανθρώπινο NSCLC CALU-3 κυτταρική γραμμή και η ανθρώπινη κυτταρική σειρά CRC HCT116 λιμάνι του φυσικού τύπου EGFR γονίδιο και μια γονιδιακή μετάλλαξη ενεργοποίηση K-RAS (KRASp.G13D). Σε αντίθεση με τις άλλες μεταλλάξεις K-RAS, η μετάλλαξη αυτή έχει περιγραφεί ως μη επηρεάζουν την ευαισθησία σε αντι-EGFR θεραπεία, ιδίως cetuximab [11]. Αυτές οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές έχει προηγουμένως χαρακτηρίζεται από την ομάδα μας για την έκφραση των τεσσάρων υποδοχέων αυξητικού παράγοντα EGF που σχετίζονται με (EGFR, erbB2, erbB3, και erbB4) και τριών υποδοχέων VEGF (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 ), καθώς και για την έκφραση των τριών προσδεμάτων EGFR (αμφιρεγουλίνη, EGF, και ΤΟΡα) και τριών προσδεμάτων VEGFR (VEGF-A, VEGF-Β, VEGF-C), με τη χρήση ποσοτικής RT-PCR (qRT-PCR) [12]. Όλες οι δοκιμασμένες συνδέτη mRNAs εκφράσθηκαν σε CALU-3 και κυτταρικές HCT116 γραμμές. CALU-3 κύτταρα εξέφρασαν επίσης EGFR mRNA, ενώ χαμηλά επίπεδα ErbB2 και ErbB3 mRNAs ήταν μετρήσιμες. VEGFR-2 και την έκφραση του mRNA VEGFR-3 ανιχνεύθηκε σε CALU-3 κυτταρική γραμμή. Έκφραση των EGFR και ειδικά προσδέματα του υποδηλώνει ότι σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου καρκίνου έναν EGFR με γνώμονα αυτοκρινής οδός είναι σημαντικές για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Στην πραγματικότητα, CALU-3 και τα κύτταρα HCT116 είναι αυξητικοί-αναστέλλεται από τη θεραπεία με εκλεκτικούς EGFR TKIs, όπως gefitinib ή erlotinib [13]. Επιπλέον, αυτά τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν και τις δύο συνδετήρες VEGF και VEGFRs και ανάπτυξη αναστέλλεται από τη θεραπεία με αντι-αγγειογόνο TKIs [13].

Ως εκ τούτου, CALU-3 και HCT116 κύτταρα επελέγησαν ως μοντέλο για την εξερεύνηση της επίκτητης αντίστασης μηχανισμών για την θεραπεία με την erlotinib EGFR TKIs και gefitinib, ή με το διπλό EGFR /VEGFR κινάσης τυροσίνης αναστολέας βανδετανίμπη.

Η gefitinib- (GEF-R), erlotinib- (ΕΡΠ-R) και vadetanib- (VAN -R) ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν με συνεχή καλλιέργεια CALU-3 και HCT116 κύτταρα παρουσία αυξανόμενων δόσεων εκάστου φαρμάκου για 12 μήνες. Μετά την καθιέρωση τριών διαφορετικών ΤΚΙ-ανθεκτική CALU-3 και τρεις διαφορετικές CALU-3 κυτταρικές σειρές HCT116 ΤΚΙ-ανθεκτική, χαρακτηρίσαμε ανθεκτικός φαινότυπος τους κάνοντας προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων παρουσία του καθενός από αυτούς τους αναστολείς. Όπως απεικονίζεται στον Πίνακα 1, μία περίπου 10-πλάσια αύξηση στην IC

50 για κάθε ΤΚΙ-ανθεκτική κυτταρική γραμμή σε σύγκριση με γονικά κύτταρα παρατηρήθηκε. ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου HCT116 ERL-R, GEF-R και VAN-R CALU-3 και διασταυρούμενη αντοχή είτε gefitinib, erlotinib ή θεραπεία βανδετανίμπη. Επιβεβαιώσαμε την επόμενη την εγκαθίδρυση σταθερών ΤΚΙ-ανθεκτικά κύτταρα CALU-3 και τον καρκίνο HCT116 σε ένα μέσο καλλιέργειας χωρίς φάρμακο. Στην πραγματικότητα, οι έξι ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές θα μπορούσαν να αναπτυχθούν απουσία του κάθε φαρμάκου για μεγάλες χρονικές περιόδους (τρεις έως έξι μήνες) και να διατηρήσει ΤΚΙ ανθεκτικό φαινότυπο τους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Για να χαρακτηριστούν περαιτέρω οι ΤΚΙ-ανθεκτική CALU-3 και κυτταρικές σειρές HCT116, εξετάσαμε διαφορική έκφραση πρωτεΐνης μεταξύ άγριου τύπου, ευαίσθητη CALU-3 και τα κύτταρα HCT116 και ΤΚΙ-ανθεκτική παράγωγά τους.

Η ενεργοποίηση των αγωγών EGFR σε ένα σύνθετο ενδοκυτταρική σηματοδότηση η οποία περιλαμβάνει την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ προ-επιβίωσης /ΑΚΤ οδού και της μιτογόνου οδού RAS /RAF /MEK /ΜΑΡΚ [13], [14]. Εμείς, ως εκ τούτου, ερευνήθηκε από ανάλυση ανοσοκηλίδωσης αυτά τα μοριακά μονοπάτια. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1, EGF-διεγερμένα ενεργοποίηση του EGFR ήταν αποτελεσματικά αποκλείστηκε σε WT και ERL-R, GEF-R και VAN-R κύτταρα όπως αποδεικνύεται από την αναστολή του EGFR auto-φωσφορυλίωση (Ρ-EGFR).

κηλίδωση Western ανάλυση του EGFR και του κατάντη περιόδων γονικής ανθρώπινης CALU-3 και HCT116 κύτταρα (WT) και σε ΤΚΙ-ανθεκτική παράγωγά τους (ERL-R, GEF-R, VAN-R) σηματοδότησης. β-ακτίνη περιλήφθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Δεδομένου ότι οι ενεργοποιούνται, φωσφορυλιωμένες μορφές των ΑΚΤ και ΜΑΡΚ είναι βασικά ενδοκυτταρική μεσολαβητές ανάπτυξης επιβίωσης παράγοντα ενεργοποιημένων κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των σημάτων [13], [14] ερευνά την κατάσταση ενεργοποίησης αυτών των μοριακών οδών που μπορεί να παρουσιάζουν ενδιαφέρον στην κατανόηση των μηχανισμών αντίστασης. Η ενεργοποίηση των ΜΑΡΚ και ΑΚΤ με μια αύξηση στην φωσφορυλιωμένη μορφές τους (Ρ-ΜΑΡΚ και Ρ-ΑΚΤ), καθώς και μια αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης survivin παρατηρήθηκαν και στα τρία ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές CALU-3 και στα τρία ΤΚΙ-ανθεκτική HCT116 κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τη γονική ομόλογό τους (Εικόνα 1).

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι σε αυτό το μοντέλο καρκινικού κυττάρου της επίκτητης αντίστασης σε τρεις διαφορετικές TKIs, ενεργοποίηση AKT- και ΜΑΡΚ γνώμονα ενδοκυτταρικά σήματα μπορεί να είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με την παρουσία είτε επιλεκτική αντι-EGFR TKIs, όπως gefitinib ή erlotinib, ή με την παρουσία του ευρέος φάσματος ΤΚΙ, όπως βανδετανίμπη.

Επιδράσεις της sorafenib στην ΤΚΙ-ανθεκτική CALU-3 και την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου HCT116

Υπό το φως του ρόλου της RAS και RAF ως κατάντη μεσολαβητές τόσο του EGFR και σήματα VEGFR από την επιφάνεια των κυττάρων, ελέγξαμε την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του sorafenib, ένα πολυ- στοχευμένη αναστολέα κινάσης, εμποδίζοντας την ενεργοποίηση της C-RAF, Β-RAF, ο-ΚΙΤ, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3, και ΡϋΟΡΡ-β [8] για την γονική WT και ΤΚΙ ανθεκτικά CALU -3 και HCT116 καρκινικά κύτταρα. Μία σημαντική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρατηρήθηκε και στα δύο WT CALU-3 κύτταρα και τα κύτταρα HCT116 WT και τα αντίστοιχα τρία παράγωγα ΤΚΙ-ανθεκτική εξής sorafenib θεραπεία, με μια IC

50 κυμαίνεται από 0. 1 έως 0.5 μΜ, (Σχήμα 2 ) Εμείς χαρακτηρίζονται περαιτέρω τα αποτελέσματα της αγωγής sorafenib στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση με κηλίδωση Western. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3, η αγωγή των ERL-R, GEF-R και VAN-R CALU-3 και HCT116 κυττάρων με sorafenib για 48 ώρες δεν επηρέασε τα συνολικά επίπεδα πρωτεΐνης ΜΕΚ και ΜΑΡΚ, ενώ προκάλεσε αξιοσημείωτη μείωση της φωσφορυλιωμένης, ενεργοποιημένες μορφές της ΜΕΚ (Ρ-ΜΕΚ) και του ΜΑΡΚ (Ρ-ΜΑΡΚ). Επιπλέον, ερευνήσαμε την κατάσταση ενεργοποίησης όλων των μοριακών στόχων του sorafenib Μελετώντας τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του C-RAF, Β-RAF, c-Kit, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3 και PDGFRβ, και τους κατάσταση φωσφορυλίωση από κηλίδωση western ανάλυση. Μεταξύ όλων των στόχων της δραστηριότητας sorafenib, μόνο C-RAF και Β-RAF προέκυψε ενεργοποιείται σε ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές CALU-3 και τον καρκίνο HCT116, και ως εκ τούτου αναστέλλεται ισχυρά από κατεργασία sorafenib (Σχήμα 3).

πολλαπλασιασμού ΜΤΤ κύτταρο δοκιμασίες διεξήχθησαν σε γονική πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα CALU-3 και του παχέος καρκινικά κύτταρα HCT116. (WT) και σε ΤΚΙ-ανθεκτική παράγωγά τους (ERL-R, GEF-R, VAN-R), σε θεραπεία για τρεις ημέρες με τις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις του sorafenib. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο (± SD) των τριών ξεχωριστών πειραμάτων, το καθένα πραγματοποιείται εις τετραπλούν.

Η

κηλίδωση Western ανάλυση του C-RAF, Β-RAF, ΜΕΚ και ΜΑΡΚ ενεργοποίηση μετά από αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του sorafenib παραγώγων ανθεκτικών ΤΚΙ αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα HCT116 CALU-3 και (ERL-R, GEF-R, VAN-R). β-ακτίνη περιλήφθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Επιδράσεις της θεραπείας με sorafenib στην εισβολή, τη μετανάστευση και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη του ΤΚΙ-ανθεκτική CALU-3 και τον καρκίνο HCT116 κύτταρα

έχει προταθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα που υποβάλλονται σε ανθεκτικά σε αντι-EGFR φάρμακα θα μπορούσαν να αποκτήσουν μια πιο επιθετική και μεταστατική φαινότυπο με αυξημένη ικανότητα να εισβάλλουν, μεταναστεύουν και να σχηματίσουν αποικίες σε ημιστερεό μέσο [15]. Ως εκ τούτου, αξιολογήσαμε αυτές τις ιδιότητες σε ΤΚΙ-ευαίσθητα WT CALU-3 και HCT116 καρκινικά κύτταρα και σε ΤΚΙ-ανθεκτική παράγωγά τους. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 4, WT CALU-3 και τα κύτταρα HCT116 αποδεικνύεται λίγο ή καθόλου ικανότητα σε εισβολή και τη μετανάστευση. Αντίθετα, όλα τα ΤΚΙ-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές CALU-3 και HCT116 εμφάνισαν σημαντική επεμβατικές και μεταναστευτικές ικανότητες. Επιπλέον, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη αποικιών τους αυξήθηκε από περίπου 3-φορές σε σύγκριση με κύτταρα WT (Σχήμα 4). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ο καρκίνος κυτταρικές σειρές με επίκτητη αντοχή στην erlotinib, το gefitinib και βανδετανίμπη έχουν αποκτήσει μια πιο επεμβατική και, ενδεχομένως, πιο μεταστατική συμπεριφορά.

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη (Α), της μετανάστευσης (Β) και εισβολή (C), αξιολογήθηκαν σε ΤΚΙ-ανθεκτική CALU-3 και HCT116 παραγώγων (ERL-R, GEF-R, VAN-R) μετά από θεραπεία με τις αναφερόμενες συγκεντρώσεις του sorafenib. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, το καθένα εις τριπλούν. Αντιπροσωπευτικά εικόνες που παρουσιάζονται για τις μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων των CALU-3 WT και ανθεκτικό κυτταρικές σειρές.

Η

Στη συνέχεια εκτιμήσαμε τις επιδράσεις του sorafenib στις επεμβατικές και μεταναστευτικές δυνατότητες του ΤΚΙ-ανθεκτική CALU-3 και HCT116 κυτταρικές σειρές. Εμείς δεν δοκιμαστεί η επίδραση της θεραπείας sorafenib στην ΤΚΙ ευαίσθητα κυτταρικές γραμμές καρκίνου WT λαμβάνοντας υπόψη την απουσία μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητα. Ένα σημαντικό δοσοεξαρτώμενη αναστολή της εισβολής και της μετανάστευσης παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές ΤΚΙ-ανθεκτική μετά από θεραπεία με sorafenib (Σχήμα 4).

Επιδράσεις της sorafenib στην ΤΚΙ-ανθεκτική CALU-3 και ξενομοσχεύματα όγκων HCT116

Ερευνήσαμε τελικά την in vivo αντικαρκινική δράση του sorafenib σε γυμνούς ποντικούς που φέρουν WT CALU-3 και HCT116 ή ΤΚΙ-ανθεκτική CALU-3 και HCT116 κυτταρικές σειρές που αναπτύχθηκαν υποδόρια ως ξενομοσχεύματα. Σε WT CALU-3 και HCT116 όγκων ξενομοσχευμάτων, θεραπεία με sorafenib προκάλεσε σημαντική μείωση στο μέγεθος του όγκου σε σύγκριση με τον έλεγχο χωρίς θεραπεία ποντικούς. Για παράδειγμα, κατά την ημέρα 35 από την έναρξη της αγωγής, ο μέσος όγκος του όγκου σε ποντικούς που φέρουν ξενομοσχεύματα όγκου WT και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με sorafenib ήταν αντίστοιχα 38% και 31% σε CALU-3 και HCT116 σε σύγκριση με τον έλεγχο χωρίς θεραπεία ποντικούς (Σχήμα 5, 6 ). Επίσης, σε ποντικούς που φέρουν ERL-R, GEF-R ή VAN-R CALU-3 και HCT116 όγκων ξενομοσχευμάτων, θεραπεία με sorafenib προκάλεσε μια σημαντική μείωση στην ανάπτυξη του όγκου (Σχήμα 5, 6). Από την άποψη αυτή, κατά την ημέρα 35 από την έναρξη της θεραπείας, η μέση όγκων του όγκου στα ποντίκια που sorafenib αγωγή κυμαίνονταν μεταξύ 27% και 40%, σε σύγκριση με τον έλεγχο χωρίς θεραπεία ποντικούς.

Α, Γονικό (WT) καρκίνος CALU-3 κύτταρα? B, GEF-R καρκίνο CALU-3 κύτταρα? C, VAN-R κύτταρα CALU-3cancer? D, ERL-R CALU-3 καρκινικά κύτταρα. Αθυμικά γυμνά ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως στο πλευρό ραχιαία με 10

7 καρκινικά κύτταρα. Μετά από 7 έως 10 ημέρες (μέσο μέγεθος όγκου, 75 mm

3), τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή όπως αναφέρεται στο Υλικά και Μέθοδοι για 5 εβδομάδες. Κάθε ομάδα θεραπείας αποτελείτο από 8 ποντίκια. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο (± SD).

t

δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση των μεγεθών των όγκων μεταξύ των διαφόρων ομάδων αγωγής την ημέρα 35 μετά την έναρξη της θεραπείας. Α, CALU-3 WT: sorafenib έναντι του ελέγχου (δύο όψεων p & lt? 0.001)? Β, CALU-3 GEF-R: sorafenib έναντι του ελέγχου (ρ δύο όψεων & lt? 0.001). C, CALU-3 VAN-R: sorafenib έναντι του ελέγχου (ρ δύο όψεων & lt? 0.001)? D, CALU-3 ERL-R:. Sorafenib έναντι του ελέγχου (ρ δύο όψεων & lt? 0.001)

Η

Α, Γονικός (WT) καρκίνου HCT116 κύτταρα? B, GEF-R καρκίνου HCT116 κύτταρα? C, VAN-R καρκίνου HCT116 κύτταρα? D, HCT116 καρκινικά κύτταρα. Αθυμικά γυμνά ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως στο πλευρό ραχιαία με 10

7 καρκινικά κύτταρα. Μετά από 7 έως 10 ημέρες (μέσο μέγεθος όγκου, 75 mm

3), τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή όπως αναφέρεται στο Υλικά και Μέθοδοι για 5 εβδομάδες. Κάθε ομάδα θεραπείας αποτελείτο από 8 ποντίκια. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο (± SD).

t

δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση των μεγεθών των όγκων μεταξύ των διαφόρων ομάδων αγωγής την ημέρα 35 μετά την έναρξη της θεραπείας. Α, HCT116 WT: sorafenib έναντι του ελέγχου (δύο όψεων p & lt? 0.001)? Β, HCT116: sorafenib έναντι του ελέγχου (ρ δύο όψεων & lt? 0.001). C, HCT116 VAN-R: sorafenib έναντι του ελέγχου (ρ δύο όψεων & lt? 0.001)? D, HCT116 ΕΡΠ-R:. Sorafenib έναντι του ελέγχου (ρ δύο όψεων & lt? 0.001)

Η

Συζήτηση

Η ενεργοποίηση του EGFR και τα μονοπάτια VEGFR διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη της πλειοψηφίας των επιθηλιακών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων NSCLC και CRC. Ωστόσο, μόνο μια υποομάδα ασθενών οφέλη από θεραπείες με φάρμακα που στοχεύουν την EGFR ή τα μονοπάτια VEGFR [16]. Πράγματι, ακόμη και σε αρχικά ανταποκρίνονται οι ασθενείς με δευτερογενή ή επίκτητη αντίσταση συμβαίνει προκαλώντας την εξέλιξη του καρκίνου και την αποτυχία της θεραπείας. Αρκετοί μοριακών μηχανισμοί έχουν προταθεί για να εξηγήσει την απόκτηση ανθεκτικότητας των καρκινικών κυττάρων για την μοριακή στοχευμένη αντικαρκινικά φάρμακα [16].

αντίσταση των κυττάρων του καρκίνου σε ανταγωνιστές EGFR μπορεί να οφείλεται σε διάφορους λόγους. Υποδοχής σχετικοί μηχανισμοί, όπως ελαττωματική δραστικότητα του ανοσοποιητικού συστήματος, η ταχεία μεταβολισμό ή κακή απορρόφηση, είναι υπεύθυνοι για την εγγενή ή πρωτογενή αντίσταση. Επιπλέον, η γενετική αστάθεια των κυττάρων αυτών δημιουργεί καρκινικού κυττάρου κλώνους με ένα επίκτητη αντοχή μετά από παρατεταμένη έκθεση σε αναστολείς EGFR. Δεδομένου ότι οι ανταγωνιστές EGFR παρεμβαίνει στην ενεργοποίηση αρκετών ενδοκυττάριων οδών που ελέγχουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, απόπτωση, μεταστατική ικανότητα, εισβολή και προκαλούμενη από όγκο αγγειογένεση, είναι σαφές ότι πολλές διαφορετικές μοριακές αλλαγές θα μπορούσαν να είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη αντοχής σε αυτούς τους αναστολείς [ ,,,0],16].

στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα, τα οποία αναπτύσσουν αντοχή στους αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR μετά από μακρόχρονη θεραπεία χρόνου (επίκτητη αντοχή) παρουσιάζουν ενεργοποιηθεί RAS /RAF /ΜΑΡΚ και μονοπάτια ΑΚΤ. Το EGFR-ανεξάρτητη ενεργοποίηση αυτών των οδών κατάντη καθιστά τα καρκινικά κύτταρα ευαίσθητα στην αναστολή EGFR και αποτελεί ένα από τα πιο κοινά αναφερόμενη αιτίες της αντοχής σε EGFR-στοχευμένη θεραπεία σε συμπαγείς όγκους.

Η συστατική δραστικότητα τουλάχιστον μιας των δύο αυτών οδών έχει αποδειχθεί ότι είναι σε θέση να ορίζει ένα ανθεκτικό φαινότυπο ανεπηρέαστη από την αγωγή με gefitinib και cetuximab [2], [17].

Επίμονη φωσφορυλίωση του RAS /RAF /ΜΑΡΚ και /ή ΑΚΤ οδοί μπορεί να εξηγηθεί με την ενεργοποίηση των υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας, εκτός από EGFR όπως ο παράγοντας-1 υποδοχέα ινσουλινόμορφου αυξητικού (IGF-1R) και ΜΕΤ [18] – [21], τα οποία είναι γνωστό ότι iperexpressed ή ενεργοποιούνται με την παρουσία της επίμονης αναστολή του EGFR.

Επιπλέον, η αυξημένη δραστηριότητα υποδοχέα-ανεξάρτητο από το RAS /RAF /ΜΑΡΚ ή /και μονοπάτια ΑΚΤ θα μπορούσε να προέρχεται από την άμεση ενίσχυση του γονιδίου, ενεργοποιώντας /απενεργοποιώντας μεταλλάξεις ή απώλεια της μοριακής ρυθμιστή [ ,,,0],22], [23].

Ωστόσο, λαμβάνοντας υπόψη ότι η αναστολή της οδού της ΑΚΤ δεν παρεμβαίνει με τον πολλαπλασιασμό των ανθεκτικών κυττάρων, η αναστολή της /ΜΑΡΚ μονοπάτι RAF /MEK με κατεργασία sorafenib μειώνει έντονα κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση . Πράγματι, ανάμεσα σε όλους τους μοριακούς στόχους του sorafenib, μόνο C-RAF και B-RAF είχε ως αποτέλεσμα ενεργοποιείται σε ανθεκτικές κυτταρικές σειρές πιθανότατα από ανάντη των υποδοχέων δεν έχει ακόμη δοκιμαστεί σε αυτό το έργο? Ωστόσο, αυτές οι πληροφορίες δείχνουν ότι η ενεργοποίηση της RAF που εξαρτώνται από ενδοκυτταρικά σήματα θα μπορούσαν να είναι ένας σημαντικός μηχανισμός για την απόκτηση της αντοχής σε αντι-EGFR θεραπείας.

Το μονοπάτι /RAF /ΜΑΡΚ σηματοδότησης RAS είναι ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο δεδομένου του κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων θηλαστικών, μετεγκατάσταση εξωκυτταρικά σήματα από συνδεδεμένο με πρόσδεμα υποδοχέα κινασών τυροσίνης στην κυτταρική επιφάνεια προς τον πυρήνα μέσω ενός καταρράκτη συγκεκριμένων γεγονότων φωσφορυλίωσης. Η μεταλλακτική κατάσταση του RAS και B-RAF γονίδια έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την ευαισθησία των κυτταρικών γραμμών όγκου σε αναστολείς του EGFR [24]. Ωστόσο, η θεραπευτική στόχευση της οδού της Ras ήταν μέχρι σήμερα ανεπιτυχής. RAF κινασών σερίνης-θρεονίνης είναι οι κύριοι τελεστές της RAS και θεωρούνται ένας σημαντικός στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου. Παράγοντες όπως sorafenib που παρακάμπτουν RAS και αναστέλλουν μόρια τελεστές καθοδικά του μεταλλαγμένου ΟΤΡάσης (π.χ. RAF) που αξιολογούνται. Τα προκλινικά δεδομένα έχουν δείξει ότι το sorafenib αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων από επαγωγή G1 σύλληψη σε κυτταρικές σειρές NSCLC ανεξάρτητα από KRAS γονότυπο [8].

Ένας άλλος πιθανός μηχανισμός αντίστασης στην αναστολή του EGFR μπορεί να είναι αυξημένη αγγειογενετική δυναμικό μέσω της ενίσχυσης των ενδοθηλιακών κυττάρων πολλαπλασιασμό και διαπερατότητας. Βάσει αυτού πληροφορίες, διάφορες προκλινικές μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί με σκοπό να ανακαλύψουν τις επιδράσεις της συνδυασμένης στόχευσης του erbB και τις οδούς του VEGF με τη χρήση διαφορετικών προσεγγίσεων [25] – [29]. Εκτός από την επιλογή του χρησιμοποιώντας αντι- θεραπειών EGFR σε συνδυασμό με φάρμακα αντι-VEGF, αναπτύχθηκαν μια σειρά κινασών τυροσίνης που μπλοκάρουν τόσο το EGFR και τον υποδοχέα ΤΚ VEGF, όπως βανδετανίμπη, η οποία έχει επιδείξει σημαντική δραστηριότητα ως μονοθεραπεία και σε συνδυασμό με την παραδοσιακή χημειοθεραπευτικά σε διάφορους τύπους ανθρώπινου όγκου [27] – [29]

Συχνά, αναστολέας ανθεκτικά EGFR ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών έκθεμα, ως κοινό χαρακτηριστικό, VEGFR υπερέκφραση, αυξημένη έκκριση του VEGF και του πλακούντα ανάπτυξη. παράγοντα, και επαυξημένης δυνατότητες μετανάστευσης. Sorafenib αναστέλλει αρκετές RTKs που συμμετέχουν σε νεοαγγείωση, συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGFR) -2 και VEGFR-3 [30]. Η αναστολή της αγγειογένεσης μπορεί έτσι να αναμένεται να συμβάλλουν στην αναστολή της ανάπτυξης του όγκου με αυτό το φάρμακο εκτός από τις επιπτώσεις της επί της RAF σηματοδότηση. Παρόλο sorafenib προηγουμένως δείχθηκε να αναστέλλει την ανάπτυξη μιας ποικιλίας ανθρώπινων καρκινικών ξενομοσχευμάτων σε ποντικούς [8], ήταν δύσκολο να μετρηθούν οι σχετικές συνεισφορές των αντί-αγγειογόνο δραστηριότητα της και την άμεση αντικαρκινική δραστικότητα του μέσω της αναστολής της RAF. Επιπλέον, στην εργασία μας, η ανάπτυξη των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων ανθεκτικών σε βανδετανίμπη, απέκλεισε το ενδεχόμενο ότι sorafenib’efficacy μπορεί να εξαρτάται από την αναστολή του VEGFR.

Η απόδειξη της θετικής αλληλεπίδρασης μεταξύ sorafenib και αντι-EGFR φάρμακα έχουν πρόσφατα παρέχονται από την ομάδα μας [12]. Προκλινικά αποδείξεις υποστηρίζεται μια ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική και αντι-μεταναστευτικά αποτελέσματα σε καρκινικές κυτταρικές σειρές NSCLC και CRC μετά την συνδυασμό με το sorafenib συν ant-EGFR φάρμακα [12]. Επιπλέον, μια κλινική μελέτη φάσης ΙΙ πρόσφατη υποστήριξε ο συνδυασμός της erlotinib και sorafenib σε ηλικιωμένους ασθενείς με προχωρημένο NSCLC υπό το φως της υψηλότερο ποσοστό επιβίωσης 1-χρόνου [30].

Στην παρούσα μελέτη, έχουμε παράσχει αποδείξεις ότι το sorafenib είναι ενεργή στην αναστολή ανάπτυξης κυττάρου όγκου

in vitro

και

in vivo

των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων που είναι ανθεκτικά σε αναστολείς του EGFR και /ή VEGFR. Η δραστηριότητα του sorafenib είναι στενά συνδεδεμένη με την ικανότητά του να μπλοκάρει RAF σηματοδότηση μέσω του μονοπατιού /ΜΑΡΚ RAS /RAF /MEK.

Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, φαρμάκων και χημικών ουσιών

Η ανθρώπινη οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC HCT116 NSCLC CALU-3 και δόθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS? ϋίβ Technologies, Gaithersburg, MD) σε ένα υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Gefitinib και βανδετανίμπη δόθηκαν από την AstraZeneca, Μάκλσφιλντ, Ηνωμένο Βασίλειο? erlotinib χορηγήθηκε από τη Roche, Βασιλεία, Ελβετία? sorafenib παρασχέθηκε από την εταιρεία Bayer Schering Pharma, Leverkusen, Γερμανία. Πρωτογενή αντισώματα εναντίον P-EGFR (Tyr1173), EGFR, P-MAPK44 /42 (Thr202 /Tyr204), MAPK44 /42, P-ΑΚΤ (Ser473), ΑΚΤ, P-ΜΕΚ (Ser217 /221), ΜΕΚ, PB-RAF (ser 445), P- C-RAF (Ser 338), survivin ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, USA. Κυττάρων εισβολή και δοκιμασία μετανάστευσης κιτ ελήφθησαν με Chemicon, Millipore, CA, USA. Όλα τα άλλα χημικά αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich, ΜΟ, USA.

Δημιουργία κυτταρικών σειρών CALU-3 και τον καρκίνο HCT116 με επίκτητη ανθεκτικότητα σε διάφορα TKIs

Σε μία περίοδο 12 μηνών, τα ανθρώπινα CALU -3 κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και κύτταρα ανθρώπινου καρκινώματος HCT116 ορθοκολικού συνεχώς εκτίθενται σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις είτε gefitinib, erlotinib ή βανδετανίμπη, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (12). Η αρχική δόση ήταν η δόση που προκαλεί την αναστολή 50% της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων (IC

50) για κάθε αναστολέα EGFR (δηλ .: erlotinib, 3 μΜ? Gefitinib, 6 μΜ? Βανδετανίμπη, 1 μΜ). Η δόση του φαρμάκου αυξήθηκε προοδευτικά σε 15 μΜ σε περίπου δύο μήνες, σε 20 μΜ μετά από άλλες δύο μήνες, σε 25 μΜ μετά από δύο επιπλέον μήνες, και, τέλος, με 30 μΜ για συνολικά 12 μήνες. Οι καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές καρκίνου ανθεκτικού στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε συνεχή καλλιέργεια με το μέγιστο επιτυγχάνεται δόση κάθε ΤΚΙ που επέτρεψε κυτταρικό πολλαπλασιασμό (30 μΜ για κάθε φάρμακο).

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Τα καρκινικά κύτταρα ήταν σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορα φάρμακα, όπως erlotinib, gefitinib, βανδετανίμπη ή sorafenib για 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με την 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) δοκιμασία -2,5-διφαινυλτετραζολίου (ΜΤΤ). Το IC

50 προσδιορίστηκαν με παρεμβολή από τις καμπύλες δόσης-απόκρισης. Αποτελέσματα αντιπροσωπεύει την μέση τιμή των τριών ξεχωριστών πειραμάτων κάθε πραγματοποιήθηκαν εις τετραπλούν.

κηλίδωση Western ανάλυση

Μετά την αγωγή, τα καρκινικά κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα Tween-20 λύσης (50 mmol /L HEPES, ρΗ 7,4 , 150 mmol /L NaCl, 0,1% Tween-20, 10% γλυκερόλη, 2,5 mmol /L EGTA, 1 mmol /L EDTA, 1 mmol /L ϋΤΤ, 1 mmol /L φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, και 10 μg /mL λευπεπτίνη και απροτινίνη ) και κατεργασία με υπερήχους. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης αναλύθηκαν με SDS-PAGE. Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και αναλύθηκαν με ειδική πρωτογενή αντισώματα, όπως αναφέρεται στο πείραμα. Οι πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν μέσω επώασης με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας και σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας ECL.

δοκιμασία Invasion

Η επεμβατική ικανότητα in vitro μετρήθηκε χρησιμοποιώντας Transwell θαλάμους, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί της μεμβράνης του άνω θαλάμου της transwell σε συγκέντρωση 2 × 10

5 /ml σε 500 μΐ μέσου RPMI και αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις sorafenib για 24 ώρες. Το μέσο στον ανώτερο θάλαμο ήταν χωρίς ορό. Το μέσο στο κάτω θάλαμος περιείχε 10% FBS ως πηγή χημειο-ελκυστικών. Κύτταρα που πέρασαν από επιστρωμένο με Matrigel μεμβράνη υπέστησαν χρώση με Κυττάρων Stain Διάλυμα περιέχον κρυσταλλικό ιώδες παρέχεται στη δοκιμασία transwell εισβολή (Chemicon, Millipore, CA) και φωτογραφήθηκαν μετά από 20 ώρες επώασης. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 562 nm με αναγνώστη ELISA μετά από διάλυση των χρωματισμένων κυττάρων σε 10% οξικό οξύ. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

εκτιμήθηκε δοκιμασία Μετανάστευση

Η μετανάστευση των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο προσδιορισμό χημειοταξίας. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν σε RPMI μέσο χωρίς ορό για 24 χέρι αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις sorafenib, μετά τις οποίες αποσπάστηκαν από τις φιάλες, αιωρήθηκε σε απόσβεση μέσο (μέσο ελεύθερο ορού που περιέχει 5% αλβουμίνη ορού βοοειδούς) και EDTA, και εμβολιάστηκαν σε Boyden ένθετα θαλάμου μετανάστευσης τοποθετούνται σε πλάκα 24 φρεατίων. Τα ένθετα περιέχουν μία μικροπορώδη μεμβράνη με ένα μέγεθος πόρου 8-μm. Εισάγει τοποθετήθηκαν πάνω φρεάτια που περιέχουν μέσα χωρίς ορό συν χημειο-προσελκυστικό (10% FBS). Μετά από μία περίοδο θεραπείας 48 ωρών, τα κύτταρα /media απορρίφθηκαν από την άνω πλευρά του ενθέτου θαλάμου μετανάστευση και ο θάλαμος τοποθετήθηκε σε φρεάτια μιας νέας πλάκας 24 φρεατίων που περιέχει κυτταρικό διάλυμα απόσπαση. Μετά την επώαση για 30 λεπτά στους 37 ° C, το ένθετο απορρίφθηκε, και ένα διάλυμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης και χρωστικής CyQuant GR προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. CyQuant είναι ένα πράσινο φθορίζον χρώμα το οποίο εμφανίζει ισχυρή αύξηση του φθορισμού όταν δεσμεύεται σε κυτταρικά νουκλεϊκά οξέα που απελευθερώνονται από το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, που επιτρέπει την εκτίμηση του σχετικού αριθμού των κυττάρων μετανάστευσαν. Ο φθορισμός προσδιορίστηκε με φθοριόμετρο στα 480/520 nm. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η ανάπτυξη σε μαλακό άγαρ

Cells (10

4 κύτταρα /φρεάτιο) εναιωρήθηκαν σε 0,5 mL 0,3% άγαρ Difco Noble (Difco, Detroit, ΜΙ) συμπληρωμένο με πλήρες μέσο καλλιέργειας. Αυτό το εναιώρημα επιστρώθηκε επί 0,5 mL 0,8% άγαρ-στρώμα μέσου βάσης σε 24 τρυβλία πολλαπλών πιάτα σύμπλεγμα (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις του sorafenib. Μετά από 14 ημέρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με νιτρο κυανούν τετραζολίου (Sigma, St. Louis, ΜΟ) και οι αποικίες μεγαλύτερες από μετρήθηκαν 0,05 mm.