Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ηπατική μετάσταση είναι η πιο κοινή αιτία του θανάτου σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου. Παρά την εκτεταμένη έρευνα στη βιολογία της εξέλιξης του καρκίνου, οι μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν παχέος μετάστασης του καρκίνου δεν είναι καλά χαρακτηρισμένες.

Μέθοδοι

ΗΤ29 LM1, LM2 ΗΤ29, ΗΤ29 LM3 κυτταρικές σειρές που προέρχονται από το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή ΗΤ29 εξής πολλαπλούς γύρους

in vivo

επιλογή σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς.

Αποτελέσματα

έκφραση CD44, μια γλυκοπρωτεΐνη διαμεμβράνης που εμπλέκονται στην κυττάρου-κυττάρου και σε κύτταρα συμφύσεις μήτρας, και τα καρκινικά κύτταρα προσκόλληση σε ενδοθηλιακά κύτταρα αυξήθηκε σε όλες τις

in vivo

επιλεγμένες κυτταρικές σειρές, με τη μέγιστη έκφραση CD44 και τα καρκινικά κύτταρα προσκόλληση σε ενδοθηλιακά κύτταρα σε υψηλά μεταστατικής κυτταρικής γραμμής ΗΤ29 LM3. Η ενεργοποίηση του c-Met κατά αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF) διέγερση στα

in vivo

επιλεγμένες κυτταρικές γραμμές είναι ανεξάρτητη CD44.

In vitro

διαχωρισμό υψηλής και χαμηλής κύτταρα έκφραση CD44 από την κυτταρική σειρά ΗΤ29 LM3 με δυνατότητα διαλογής FACS επιβεβαίωσε ότι η ενεργοποίηση c-Met είναι CD44 ανεξάρτητος κατά αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων διέγερση. Επιπλέον,

in vivo

αξιολόγηση των CD44 χαμηλής και υψηλής κυττάρων που εκφράζουν ΗΤ29 ΠΝ 3 δεν έδειξε καμία διαφορά στην μετάσταση στο ήπαρ διεισδυτικότητα.

Συμπεράσματα

Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η επιθετική μεταστατικό φαινότυπο

in vivo

επιλεγμένες κυτταρικές γραμμές σχετίζεται με υπερέκφραση του CD44 και ενεργοποίηση του c-ΜΕΤ. Έχουμε αποδείξει ότι η ενεργοποίηση c-Met είναι CD44 ανεξάρτητη κατά τη διέγερση αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων και επιβεβαιώνουν ότι η έκφραση CD44 στην κυτταρική γραμμή ΗΤ29 ΠΝ 3 δεν είναι υπεύθυνη για την αύξηση του μεταστατικού διεισδυτικότητα στην κυτταρική γραμμή ΗΤ29 ΠΝ 3

Παράθεση:. Elliott VA , Rychahou P, Zaytseva YY, Λόγκαν BM (2014) η ενεργοποίηση του c-Met και αύξηση της έκφρασης CD44 συνδέονται με τις Μεταστατικό Φαινότυπος στον Καρκίνο του παχέος μετάσταση στο ήπαρ μοντέλο. PLoS ONE 9 (5): e97432. doi: 10.1371 /journal.pone.0097432

Επιμέλεια: Frédéric André, Πανεπιστήμιο Aix-Marseille, Γαλλία

Ελήφθη: 17, Φεβρουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 18 του Απρίλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: May 13, 2014

Copyright: © 2014 Elliott et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις R01DK048498 από ΝΙϋϋΚ και T32CA165990 από NCI. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Μεταστατική ή υποτροπιάζουσας νόσου είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου σε αυτούς τους ασθενείς. Η πρόγνωση για CRC βασίζεται στο σχηματισμό απομακρυσμένων μεταστάσεων, όχι το ίδιο το πρωτογενούς όγκου. Ακόμη και με ολοκληρωμένη έρευνα στη βιολογία της εξέλιξης του καρκίνου, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην μεταστατική καταρράκτη δεν είναι καλά χαρακτηρισμένες.

Οι μηχανισμοί της μετάστασης περιλαμβάνει μια επιλεκτική και διαδοχική σειρά σταδίων, συμπεριλαμβανομένου διαχωρισμού από τον πρωτογενή όγκο, εισβολή μέσω περιβάλλοντες ιστούς, την είσοδο στο κυκλοφορικό σύστημα, και η δημιουργία και η διάδοση σε μια μακρινή θέση [2]. Δύο πρωτεΐνες που έχουν δειχθεί να εμπλέκονται με πολλαπλά στάδια της μεταστατικής καταρράκτη είναι CD44 και ο-ΜΕΤ. CD44, μία διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη που ανήκει σε μια οικογένεια μορίων κυτταρικής προσκόλλησης, ασχολείται με την εξέλιξη και τη μετάσταση των πολλαπλών τύπων καρκίνου [3] – [6] και έχει συσχετισθεί με κακή πρόγνωση σε ασθενείς CRC [3]. ο-ΜΕΤ είναι ένα πρωτο-ογκογονίδιο που κωδικοποιεί για την κινάση της τυροσίνης του υποδοχέα, επίσης γνωστή ως υποδοχέας παράγοντα ανάπτυξης ηπατοκυττάρων [4]. Η μόνη γνωστή συνδετήρας για γ-ΜΕΤ είναι αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF)? τόσο ο-ΜΕΤ και HGF είναι ρυθμισμένη προς τα πάνω σε έναν αριθμό κακοηθειών και συνδέονται με κακή πρόγνωση και πρώιμο προγνωστικός παράγοντας της περαιτέρω μετάστασης [5]. Συγκεκριμένα, ο-ΜΕΤ εμπλέκεται στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού, της κινητικότητας, εισβολή και μετάσταση μέσω φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση του μονοπατιών κατάντη σηματοδότησης [4].

Μια ολοκληρωμένη κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν CRC μετάσταση είναι σημαντική για η ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων για την αντιμετώπιση αυτού του καρκίνου. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να εντοπίσει τα γονίδια που προάγουν την μετάσταση στο ήπαρ σε CRC. Εδώ, δημιουργήσαμε τρία ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές CRC και δείχνουν ότι περισσότερο επιθετική μεταστατικό φαινότυπο τους συνδέεται με μια αύξηση στην έκφραση CD44 και ενεργοποίηση του c-ΜΕΤ. Επιπλέον, δείχνουμε ότι η ενεργοποίηση του c-ΜΕΤ ήταν ανεξάρτητο από τα επίπεδα των CD44 παρόν. Τέλος, αποδεικνύουμε ότι η αυξημένη έκφραση CD44 δεν είναι υπεύθυνη για την αύξηση του μεταστατικού διεισδυτικότητα της κυτταρικής γραμμής ΗΤ29 LM3. Είναι σημαντικό ότι,

in vivo

επιλογή και την απομόνωση του ήπατος-Tropic μεταστατικά κύτταρα CRC μας επέτρεψε να μελετήσουμε τις βιολογικών μηχανισμών της CRC μετάστασης του καρκίνου και να εντοπίσει τους μηχανισμούς που συμβάλλουν στην μετάσταση στο ήπαρ σε CRC.

Υλικά και μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων, διαμολύνσεις

ΗΤ29 κύτταρα και Ανθρωπίνων πνεύμονα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HMVEC-L) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA), είχαν προηγουμένως επικυρωθεί το Νοέμβριο του 2011 από την Genetica DNA Laboratories (Cincinnati, ΟΗ) καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α, που αγοράστηκε από την Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 10% FBS και αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό. διάνυσμα EGFP-Ν1 αγοράστηκε από Clontech (Mountain View, CA). κύτταρα που εκφράζουν GFP επιλέχθηκαν με 500 μg /ml Geneticin (G418), που αγοράστηκε από την Life Technologies (Carlsbad, CA) και εμπλουτίζεται από τρεις κύκλους κυτταρικής ενεργοποιούμενη με φθορισμό (FACS). Προ-made pGL3 λουσιφεράσης πυγολαμπίδας (Ιυο) λεντοϊού σωματίδια αγοράστηκαν από Lentigen (Gaithersburg, MD). Για φακοϊικών μεταγωγή, 5000 κύτταρα /φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστών 96 φρεατίων και επιμολύνθηκαν την επόμενη μέρα με Luc λεντοϊού σωματίδια σε ΜΟΙ 10 με την παρουσία 10 μg /ml πολυβρένιο, αγοράστηκαν από την Santa-Cruz Biotechnology (Dallas, ΤΧ ).

μετάσταση στο ήπαρ Μοντέλο και

στο

vivo

Imaging

Άντρας χωρίς θύμο αδένα NCr γυμνοί ποντικοί μεταξύ 6-8 εβδ της ηλικίας αγοράστηκαν από την Taconic ( Hudson, Νέα Υόρκη). Στέγαση για τα ζώα αυτά διατηρήθηκε σε ένα ΗΕΡΑ διηθείται περιβάλλον μέσα αποστειρώνονται κλουβιά με 12 ώρες φως /12 ώρες σκοτάδι κύκλους. Όλες οι διαδικασίες ζώων πραγματοποιήθηκαν με την έγκριση και τη συμμόρφωση με το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση? πρωτόκολλο # 2009-0529. Για ενδοσπληνική ένεση κυττάρων CRC αθυμικών γυμνών ποντικών NCr αναισθητοποιήθηκαν με ισοφλουράνιο (επαγωγή 4%, συντήρηση 2%). 1 cm δερματική τομή έγινε στο αριστερό πλευρό και μεταφέρεται προς τα κάτω μέσω της περιτοναϊκής τοίχο. Η σπλήνα προσεκτικά εκτεθειμένη, και τα κύτταρα ΗΤ29 GFP-Luc (5 × 10

6 κύτταρα /100 μΙ) εγχύθηκαν κάτω από την κάψουλα σπλήνα χρησιμοποιώντας μια βελόνα 27-gauge. Η βιωσιμότητα των κυττάρων που χρησιμοποιούνται για τον εμβολιασμό ήταν μεγαλύτερη από 95% όπως προσδιορίζεται με Vi-CELL XR (Beckman Coulter). Ήπια πίεση εφαρμόσθηκε στην θέση εμβολιασμού μέχρις ότου δεν υπήρχε ορατό σημάδι της αιμορραγίας. LIGACLIP επιπλέον μονό συνδετικό σφιγκτήρα εφαρμοστής με LIGACLIP τιτάνιο επιπλέον συνδετικοί σφιγκτήρες, αγοράστηκε από την Ethicon (San Angelo, ΤΧ), χρησιμοποιήθηκε για να κλιπ lienal και lieno-παγκρεατικών φλέβες 5 λεπτά μετά σπληνός έγχυση κυττάρων CRC? η σπλήνα απομακρύνθηκε έπειτα. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν μετά από 4 εβδομάδες ή και νωρίτερα εάν ετοιμοθάνατα. Οι ιστοί του ήπατος συντηρήθηκαν για ιστολογική εξέταση από καθήλωση σε ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης 10% ακολουθούμενη από εμβάπτιση σε παραφίνη.

Όλα τα βιοφωταυγή εικόνες αποκτήθηκαν με IVIS Spectrum (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ), με το στάδιο θερμαίνεται στους 37 ° C κατά τη διάρκεια της απεικόνισης ζωντανό κύτταρο. Εικόνες αποκτήθηκαν 10 min μετά ε.π. ένεση του D-λουσιφερίνης (150 mg /kg) χρησιμοποιώντας 15 sec έκθεση. απεικόνιση φθορισμού GFP πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα LT-9500 Illumatool /TLS (Lightools Research, Encinitas, CA), εξοπλισμένο με μία πηγή διέγερσης (470 nm) και η πλάκα φίλτρου (515 nm).

Η ενζυματική Απομόνωση CRC Cells από ηπατικές μεταστάσεις

Liberase DH Research Grade (05401054001? Roche Applied Science) επαναιωρήθηκε σε αποστειρωμένο νερό προς /ml συγκέντρωση 2,5 mg και αποθηκεύονται σε μίας χρήσης κλάσματα των 100 μΙ στους -80 ° C. Η κολλαγενάση /υαλουρονιδάση (07912? StemCell Technologies) δειγματίστηκε σε δείγματα μίας χρήσης 250 μΐ και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Μετά τη συλλογή, μεταστατικών όγκων τοποθετήθηκαν σε πλήρες μέσο κυτταρικής καλλιέργειας συμπληρωμένο με 1Χ Gibco Αντιβιοτικό-Αντιμυκητιασική (15240-062? Life Technologies) για τη μεταφορά. Μεταστατικός θραύσματα όγκου τεμαχίστηκαν σε κύβους 2-mm χρησιμοποιώντας ψαλίδι και χωνεύτηκε σε 50 μg /ml Liberase DH (100 μΙ) και 0,5Χ κολλαγενάση /Υαλουρονιδάσης (250 μλ), αραιωμένο σε μέσο 5 mL McCoy5A ορό για 4 ώρες στους 37 ° C με ήπια ανακίνηση με μαγνητική ράβδο ανάδευσης. Δεν παρατηρήθηκε αχώνευτος ιστού. Υποστεί πέψη κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με πλήρες μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και μεταφέρθηκαν σε 10% FBS media McCoy5A συμπληρωμένο με 1Χ Gibco Αντιβιοτικό-Αντιμυκητιασική και 100 μg /ml Primocin (μυρμήγκι-ΡΜ-1? InvivoGen).

Ανάλυση Western Blot και αντισώματα

Συνολικά προϊόντα λύσης πρωτεΐνης (20μg) διαχωρίστηκαν σε 4-12% γέλη δις-τρις και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες μεταφοράς Immobilon PVDF. Οι μεμβράνες επωάστηκαν για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με διάλυμα αποκλεισμού (αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα και 0.1% Tween 20), που ακολουθείται από ολονύκτια επώαση σε πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας για 1 ώρα. Μετά από 3 επιπλέον πλύσεις, τα ανοσοσύμπλοκα στις μεμβράνες έγιναν ορατές με ανίχνευση ECL

Τα ακόλουθα αντισώματα αγοράστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε μας μελέτη:. Cell Signaling (Danvers, ΜΑ): φωσφο-ΑΚΤ (# 4058), συνολική ΑΚΤ (# 2920), ΑΚΤ2 (# 3063), φωσφο-ΕΚΚ 1/2 (# 4695), το σύνολο των ERK ½ (# 9107), PTEN (# 9559), φωσφο-mTOR (# 2971), η συνολική mTOR (# 2972), φωσφο-MET (# 3129 για western αποτύπωση και # 3077 για IHC), γ-ΜΕΤ (# 3148), CD44 (# 3570), φωσφο-β-κατενίνης (# 4176), φωσφο-ΡΑΚ (# 8556), και το σύνολο των ΡΑΚ (# 3285). Σάντα Κρουζ (Dallas, TX): ΑΚΤ 1 (# 5298). BD (San Jose, California): Beta κατενίνης (# 610154) και Ε-καδερίνη (# 610404). Abcam (Cambridge, ΜΑ): KRAS (# 55391). Millipore (Billerica, ΜΑ): p85α (# 05-212). Όλα τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε μια συγκέντρωση 1:1,000.

siRNA Επιμολύνσεις και HGF κυττάρων Θεραπεία

Για HGF, τα κύτταρα θεραπεία σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 800,000 κυττάρων /φρεάτιο σε μια πλάκα έξι . Μετά από 24 ώρες, το μέσο των κυττάρων άλλαξε σε μέσο ελεύθερο ορού για επιπλέον 24 ώρες. Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη HGF (PeproTech # 100-39) προστέθηκε στη συνέχεια στα φρεάτια σε συγκέντρωση 50 ng /mL για 5 λεπτά. επιμολύνσεις siRNA: ON-TARGET συν CD44 siRNAs (LU-00999907, LU-00999908) και τον έλεγχο siRNA (D-001810-10) αγοράστηκαν από Dharmacon (Lafayette, CO) και χρησιμοποιείται σε μια συγκέντρωση 100 μΜ

Ανοσοϊστοχημεία

ανοσοϊστοχημεία (IHC) πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Οι παραφίνη τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε φθίνουσα σειρά αιθανόλης. χρώση πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ϋΑΚΟ EnVision Kit, αγοράστηκε από την Dako Corp. (Carpinteria, CA). CD44 και ρ-ΜΕΤ αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 1:100 σε αραιωτικό αντισώματος DAKO. Όλες οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη και παρατηρήθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο.

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

Γονική ΗΤ29 και κύτταρα ΗΤ29 LM3 απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 25.000 κυττάρων ανά φρεάτιο. Ο πολλαπλασιασμός εκτιμήθηκε με μέτρηση κυττάρων σε 24, 48, και 72 ώρες, χρησιμοποιώντας ένα Beckman Coulter-Vi Κυττάρων XR αναλυτή κυτταρικής βιωσιμότητας (Fullerton, CA).

ενδοθηλιακών κυττάρων προσφύσεως Δοκιμασία

ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα από τους πνεύμονες (HMVEC-L) ενεργοποιήθηκαν με 15 ng /mL του TNFa για 4 ώρες. Η γονική ΗΤ29 και κύτταρα ΗΤ29 LM3 σημάνθηκαν με Calcein ΑΜ (/mL τελική συγκέντρωση 2,5 mg) για 30 λεπτά στους 37 ° C, πλύθηκαν, και προστέθηκε στην κορυφή της μονοστιβάδας ενεργοποιημένων κυττάρων HMVEC-L για 30 λεπτά. Τα μη συνδεδεμένα κύτταρα αφαιρέθηκαν με πλύση με PBS (5χ) και τρεις εικόνες GFP λήφθηκαν ανά φρεάτιο για να μετρήσει τα συνδεδεμένα κύτταρα.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και ταξινόμηση κυττάρων

ΗΤ29 LM3 κύτταρα σημάνθηκαν με CD44 – Alexa Fluor 647 αντίσωμα (Biolegend) σε συγκέντρωση 2,5 μg /ml ανά 10

7 κύτταρα για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα διαλογής (φωσφορικό αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα 1Χ, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό). Μέσα σε ένα δείγμα κυττάρων ΗΤ29 LM3, ταξινομήσαμε δύο πληθυσμούς κυττάρων: 10% των κυττάρων με υψηλή έκφραση του CD44 (συντομογραφία ΗΤ29 LM3 CD44 +) και κύτταρα που δεν εκφράζουν CD44 (συντομογραφία ΗΤ29 LM3 CD44-). Μη βαμμένα κύτταρα ΗΤ29 LM3 χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. Μετά διαλογή κυττάρων, τα κύτταρα επεκτάθηκαν σε καλλιέργεια κυττάρων. Η διευκόλυνση του Ηνωμένου Βασιλείου κυτταρομετρίας ροής Υπηρεσία διεξήγαγε ανάλυση των κυττάρων και κυττάρων διαλογή.

Αποτελέσματα

In vivo

Διαδικασία Επιλογής του Ήπατος-Tropic CRC μεταστατικά κύτταρα

CRC μετάσταση στο ήπαρ είναι μία πολυβάθμια διαδικασία στην οποία κακοήθη κύτταρα εξαπλωθεί από πρωτοπαθή όγκο να αποικίσουν το ήπαρ. Κακοήθη κύτταρα είναι επεμβατική και μεταστατικό? Ωστόσο, μόνο ένα περιορισμένο κλάσμα των κυττάρων σε μια πρωτογενή όγκο θεωρούνται πολύ μεταστατικός.

In vivo

μεθόδων επιλογής, με τη χρήση πρωτογενών καρκινικών κυτταρικών γραμμών και τη σύγκριση μεταξύ καθαρών κλωνικοί πληθυσμοί των απομονωμένων μεταστατικών κυττάρων του ήπατος τροπισμό είναι ένα χρήσιμο επιστημονική προσέγγιση για τον προσδιορισμό των βιολογικών μηχανισμών ενισχυμένης διάρκεια CRC μετάσταση στο ήπαρ.

σε αυτή τη μελέτη, θα κατασκευαστεί η κυτταρική σειρά ΗΤ29 CRC για να εκφράσουν πλασμίδια αναφοράς, GFP και λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας που επιτρέπει φθορισμού και βιοφωταύγεια απεικόνισης σε ένα ενιαίο πειραματικό μοντέλο, και εκτελούνται

στο

vivo

επιλογή των ΗΤ29 κύτταρα που κάνει μετάσταση στο ήπαρ. Εν συντομία, ΗΤ29 κύτταρα εγχύθηκαν εντός του σπλήνα αθυμικών γυμνών ποντικών? σπληνεκτομή έγινε 5 λεπτά μετά ενδοσπληνική έγχυση των κυττάρων CRC για να αποφευχθεί η εκ νέου μετάσταση. μεταστάσεις Πειραματική ήπαρ (LM? 30-40 μεταστατικών βλαβών) συλλέχθηκαν, με έδρα το ιστοκαλλιέργειας, και θα ορίζονται ως κυτταρικές γραμμές ΗΤ29 LM. Κύτταρα που συλλέχθηκαν από αυτές τις καλλιέργειες εγχύθηκαν στο σπλήνα ενός άλλου σετ γυμνών ποντικών. Η αλληλουχία του

σε

vivo

επιλογή φαίνεται στο Σχήμα 1Α. HT29LM1 και ΗΤ29 ΠΝ 3 διαφέρουν δραματικά σε σχέση με το μεταστατικό δυναμικό τους. Απεικόνιση βιοφωταύγειας των ποντικών που ενέθηκαν με ΗΤ29 LM2 κατέδειξε 2,5-φορές αύξηση στη διεισδυτικότητα σε σύγκριση με γονική κυτταρική γραμμή (~ 3,5 εβδ με ~ 100% διεισδυτικότητα εναντίον ~ 4 εβδ με ~ 40% διεισδυτικότητα) (Σχήμα 1Β). Έτσι,

στο

vivo

επιλογή των κυτταρικών σειρών ΗΤ29 προβλέπεται άκρως μεταστατικά κύτταρα για τη σύγκριση με τα γονικά κύτταρα κάτω από ισογονιδιακές φόντο.

(Α) Απεικόνιση των μεταστατικών CRC

σε

vivo

διαδικασία επιλογής. Πειραματικό μεταστάσεις στο ήπαρ συλλέχθηκαν, που ιδρύθηκε το πολιτισμό και έχει οριστεί κυτταρικές σειρές ΗΤ29 LM1, LM2 και ΠΝ 3. (Β) βιο-φωσφορισμού εικόνες των ποντικών 4 εβδομάδες μετά την ένεση ενδοσπληνική γονικής ΗΤ29 και κυτταρικές σειρές ΗΤ29 LM2.

Η

Το μονοπάτι γ-ΜΕΤ υπερεκφράζεται στα ΗΤ29 Προέρχεται κυτταρικές γραμμές

Μοριακής ανάλυση των καρκινικών κυττάρων σε διάφορα στάδια της εξέλιξης έχουν αποκαλύψει ότι οι μεταβολές σε ογκοκατασταλτικά γονίδια και ογκογονίδια συσσωρεύονται κατά τη διάρκεια εξέλιξης του όγκου και συσχετίζεται με την κλινική επιθετικότητα του καρκίνου. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε συγκριτική ανάλυση των διαφόρων ογκογονιδίων και προφίλ έκφρασης ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε κυτταρικές σειρές ΗΤ29 LM με κηλίδα Western. Το Σχήμα 2 δείχνει ότι η φωσφορυλίωση της c-ΜΕΤ αυξήθηκε δραματικά στις κυτταρικές γραμμές ΗΤ29 LM1 και ΗΤ29 LM2, με την υψηλότερη ενεργοποίηση στην κυτταρική γραμμή ΗΤ29 LM3, σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα ΗΤ29. Παρατηρήσαμε μια μικρή αύξηση της συνολικής πρωτεΐνης c-ΚΟΑ, καθώς και. Οι αλλαγές αυτές παρατηρήθηκαν όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φυσιολογικά ή χωρίς ορό συνθήκες (ξεχωριστά πειράματα). Η ανάλυση στυπώματος Western των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από κυτταρικές σειρές ΗΤ29 LM δεν έδειξε καμία αλλαγή στο pAkt (Ser473), Akt, p85α, ΡΤΕΝ, pERK (Tyr 1234/1235), ΕΚΚ, η έκφραση της πρωτεΐνης του K-ras (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η αύξηση του μεταστατικού δυναμικού των παράγωγων ΗΤ29 κυτταρικές γραμμές σχετίζεται με ενεργοποίηση του μονοπατιού c-ΜΕΤ.

ΗΤ29 LM1, LM2, LM3 και γονική κυτταρική σειρά καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο για 24 (πρώτες 4 λωρίδες). Σε ένα άλλο πείραμα, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες και διεγείρονται με πλήρες μέσο για 10 λεπτά (υπόλοιπα 4 λωρίδες). προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με κηλίδα Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Έκφραση CD44 πρωτεΐνης είναι σημαντικά αυξημένη στο ΗΤ29 κυτταρικές γραμμές που παράγονται

Η έκφραση των βασικών πρωτεϊνών στο CD44, β-κατενίνης και μονοπάτια ΡΑΚ, τα οποία διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην CRC μετάσταση [7] – [9] αναλύθηκε επόμενο. Παρατηρήσαμε μια σταδιακή αύξηση του υψηλού μοριακού βάρους έκφρασης CD44 παρατηρείται σε -150 kDa σε κυτταρικές γραμμές ΗΤ29 LM, με μέγιστη έκφραση CD44 σε ΗΤ29 LM3 σε σύγκριση με την γονική κυτταρική γραμμή ΗΤ29 (Σχήμα 3Α). Η ανάλυση στυπώματος Western των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από κυτταρικές σειρές ΗΤ29 LM δεν έδειξε καμία αλλαγή στο ρ-β-κατενίνης (S675), β-κατενίνης, ρ-FAK (Tyr397) και η έκφραση πρωτεΐνης ΡΑΚ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση μας

στο

vitro

ευρήματα, αναλύσαμε τη γονική ΗΤ29 και τομές ιστού ήπατος μετάσταση ΗΤ29 ΠΝ 3 από την IHC. Συνεπής με ανάλυση Western blot, έκφραση και των δύο π-ΜΕΤ και CD44 ήταν σημαντικά αυξημένη σε ΗΤ29 LM3 σε σύγκριση με ΗΤ29 LM1 (Σχήμα 3Β). CD44 κυτταρικής επιφάνειας ροής κυτταρομετρίας ανάλυση κατέδειξε επίσης υψηλότερο επίπεδο έκφρασης CD44 στην επιφάνεια των κυττάρων ΗΤ29 LM3 συγκριτικά με γονικά κύτταρα ΗΤ29 (Σχήμα 3C). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ενισχυμένη μεταστατικό δυναμικό των κυτταρικών σειρών ΗΤ29 LM σχετίζεται με μια αύξηση στην έκφραση CD44.

(Α) ΗΤ29 LM1, LM2, LM3 και γονική κυτταρική σειρά καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο για 24 h. προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με κηλίδα Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) IHC ανάλυση των CD44 και έκφραση p-ΚΟΑ σε τομές ιστών μετάσταση στο ήπαρ ΗΤ29 LM1 και ΗΤ29 LM3. (C) με κυτταρομετρία ροής των CD44 γεωμετρική μέση ένταση φθορισμού σε γονική ΗΤ29 και κύτταρα ΗΤ29 ΠΝ 3.

Η

Υψηλού Επιπέδου ενεργοποίηση c-met σε ΗΤ29 ΠΝ 3 είναι ανεξάρτητη της έκφρασης CD44

Met είναι ένα ουσιαστικό κινάσης τυροσίνης υποδοχέα (RTK) που διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, διαφοροποίηση, τη μετανάστευση και την επιβίωση [10]. Met παροδικά ενεργοποιείται μετά την επαγωγή HGF και απαιτεί ειδικές ισομορφές CD44 για την ενεργοποίηση της σε διάφορους καρκίνους [11], [12]. Για την καλύτερη κατανόηση της αλληλεπίδρασης μεταξύ της ενεργοποίησης ΚΟΑ και CD44 στο πατρικό ΗΤ29 και κύτταρα ΗΤ29 LM3, αναλύσαμε τα αποτελέσματα του HGF διέγερση στις δύο κυτταρικές σειρές. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, HGF-θεραπεία αυξάνει την ενεργοποίηση του c-ΜΕΤ στα δύο γονικών ΗΤ29 και ΗΤ29 LM3, με ελαφρώς υψηλότερη ενεργοποίηση στην κυτταρική γραμμή ΗΤ29 LM3 σε σύγκριση με την γονική κυτταρική γραμμή ΗΤ29. Εμείς επόμενη επιμολυσμένα κύτταρα ΗΤ29 LM3 με siRNA εναντίον όλων των ισομορφών CD44 και στη συνέχεια κατεργάζεται αυτά τα κύτταρα με HGF. Το Σχήμα 4Β δείχνει παρόμοια επίπεδα φωσφορυλίωσης ο-ΜΕΤ σε παρουσία ή απουσία HGF, υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού c-ΜΕΤ στα κύτταρα ΗΤ29 LM3 είναι ανεξάρτητη της έκφρασης CD44.

(Α) Ανάλυση της CD44, ρ-ΜΕΤ, c-met, ρ-ΑΚΤ και την έκφραση της ΑΚΤ σε γονικά ΗΤ29 και ΗΤ29 LM3 μετά HGF διέγερση (50 ng /mL? 5 λεπτά) με κηλίδα Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) ΗΤ29 LM3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με CD44 siRNA και διεγείρονται με HGF (50 ng /mL? 5 λεπτά) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA. (C) έκφραση CD44 σε ΗΤ29 LM3 και τομές ιστού μετάσταση γονική ΗΤ29 ήπατος αναλύθηκαν με IHC. (D) Κύτταρα ΗΤ29 LM3 ταξινομήθηκαν για υψηλή και χαμηλή έκφραση CD44. Τα κύτταρα περιφραγμένη και ταξινομούνται για να συλλέξει το 10% των κυττάρων με υψηλή έκφραση CD44 και τα κύτταρα με χαμηλή έκφραση CD44. (Ε) Ανάλυση των CD44, π-ΚΟΑ, και γ-ΜΕΤ έκφραση σε γονική ΗΤ29, ΗΤ29 ΠΝ 3 CD44-, και ΗΤ29 ΠΝ 3 CD44 + κύτταρα. (F) Ανάλυση ρ-ΜΕΤ, c-met, CD44, ρ-ΑΚΤ, και έκφραση της ΑΚΤ σε γονική ΗΤ29, ΗΤ29 LM3 CD44-, και ΗΤ29 LM3 CD44 + κυττάρων μετά HGF (50 ng /mL? 5 λεπτά). Διέγερση

IHC ανάλυση του CD44 σε τομές ιστών ΗΤ29 LM3 αποδειχθεί μεταβλητή έκφραση CD44 σε μεταστάσεις στο ήπαρ? συστάδες ηπατικές μεταστάσεις με υψηλή έκφραση του CD44 δίπλα σε μεταστάσεις με χαμηλή έκφραση CD44 (Σχήμα 4C). Για να αναλυθεί περαιτέρω αυτό το φαινόμενο, χρησιμοποιήσαμε κυτταρομετρία ροής και κυτταρική διαλογή για την απομόνωση δύο πληθυσμούς κυττάρων με βάση την έκφραση CD44 κυτταρικής επιφάνειας. Δύο κυτταρικές γραμμές με υψηλή έκφραση CD44 (ΗΤ29 Ι_Μ3 CD44 +) και χαμηλή έκφραση CD44 (ΗΤ29 Ι_Μ3 CD44-) έχουν καθοριστεί (Εικόνα 4D). έκφραση CD44 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Τόσο CD44 + και CD44- κυτταρικές σειρές είχαν υψηλότερα ενεργοποίηση του c-Met σε σύγκριση με την γονική κυτταρική γραμμή (Σχήμα 4Ε).

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι η ενεργοποίηση της c-ΜΕΤ είναι ανεξάρτητη της έκφρασης CD44 στο κύτταρο ΗΤ29 LM3 γραμμή, οι πληθυσμοί κυττάρων CD44 + και CD44- διεγέρθηκαν με HGF και αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 4F, ένα παρόμοιο επίπεδο ενεργοποίησης c-ΜΕΤ σε CD44 + και CD44- κυττάρων παρατηρήθηκε. Ως εκ τούτου, δείχνουμε ότι το επίπεδο της έκφρασης CD44 σε

σε

vivo

εκπαιδευμένο ΗΤ29 LM3 κύτταρα δεν συσχετίζεται με τα επίπεδα ενεργοποίησης c-Met με φυσικό συνδετήρα του, HGF, περαιτέρω επιβεβαιώνοντας ότι C- ΚΟΑ δρα ανεξάρτητα από CD44 στην κυτταρική σειρά ΗΤ29 ΠΝ 3.

Επιθετική μεταστατική συμπεριφορά των ΗΤ29 ΠΝ 3 συνδέεται με αυξημένη ικανότητα να προσκολληθούν σε ενδοθηλιακά κύτταρα, αλλά δεν οδηγείται από έκφραση CD44

καρκινικών κυττάρων προσκόλληση σε ενδοθηλιακά κύτταρα είναι ένα σημαντικό βήμα της μετάστασης και είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται από CD44 σε πολλά καρκινικά κύτταρα [13]. ΗΤ29 ΠΝ 3 και κυτταρικές σειρές μητρικών ΗΤ29 επισημάνθηκαν με ικανότητα σύνδεσης Calcein ΑΜ και ΗΤ29 ΠΝ 3 στα ενδοθηλιακά κύτταρα αξιολογήθηκε με

στο

vitro δοκιμασία προσκόλλησης

. Δείξαμε ότι τα κύτταρα ΗΤ29 LM3 είχε μια αυξημένη ικανότητα να αποδίδουν σε ενδοθηλιακά κύτταρα, σε σύγκριση με γονικά κύτταρα ΗΤ29 (Σχήμα 5Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ο πιο επιθετικό μεταστατικό φαινότυπο των κυττάρων ΗΤ29 LM3 είναι μπορεί να είναι το αποτέλεσμα της αύξησης της κυτταρικής προσκόλλησης σε ενδοθηλιακά κύτταρα.

(Α) Προσκόλληση της γονικής ΗΤ29 και κύτταρα ΗΤ29 LM3 να HMVEC-L κύτταρα αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται ως μέση πολλαπλάσια αλλαγές στον αριθμό των γονικών κυττάρων ΗΤ29 που συνδέονται με HMVEC-L κυττάρων έναντι κυττάρων ΗΤ29 LM3 (* ρ & lt? 0.001). Εκπρόσωπος εικόνες δείχνουν την προσκόλληση των γονικών ΗΤ29 και κύτταρα ΗΤ29 ΠΝ 3 στα κύτταρα HMVEC-L. (Β) φθορισμού GFP απεικόνιση των ηπατικών μεταστάσεων 4 εβδομάδες μετά ενδοσπληνική ένεση ΗΤ29 LM3 CD44 + και τα κύτταρα ΗΤ29 ΠΝ 3 CD44- (5 × 10

6? 100 μλ PBS). IHC ανάλυση της έκφρασης CD44 σε CD44 υψηλή και χαμηλή CD44 CRC μετάσταση στο ήπαρ.

Η

μας

στο

vitro

ανάλυση των

στο

vivo

κυτταρικές σειρές επιλέγονται ΗΤ29 προσδιορίζεται μια αύξηση στην έκφραση CD44 και ενεργοποίηση c-Met. Από προσκόλληση σε ενδοθηλιακά κύτταρα είναι ένα πρώτο περιοριστικό του ρυθμού στάδιο της αιματογενούς μετάστασης ήπατος CRC κρίσιμη μετά ενδοσπληνική ένεση και τον υποδοχέα CD44 είναι γνωστό ότι ρυθμίζει τα καρκινικά κύτταρα προσκόλληση [7], [12], από την επόμενη αξιολογηθεί ο ρόλος του CD44 στο CRC μετάσταση

σε

vivo

. κύτταρα ΗΤ29 LM3 CD44 + και CD44- ΗΤ29 LM3 ενέθηκαν σε σπλήνες αθυμικών γυμνών ποντικών. Τέσσερις εβδ μετά την ένεση, φθορισμού GFP απεικόνιση της CRC ηπατικές μεταστάσεις έγινε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, το επίπεδο της έκφρασης CD44 δεν είχε καμία σημαντική επίδραση στην CRC μετάσταση στο ήπαρ. επίπεδο έκφρασης CD44 στα CD44 + και CD44- ηπατικές μεταστάσεις επιβεβαιώθηκε με χρώση IHC. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση της μόνη της CD44 δεν είναι επαρκής για την ενίσχυση της CRC μετάσταση στο ήπαρ και ότι άλλες οδοί είναι πιθανόν εμπλέκονται.

Συζήτηση

Η πιο καταστροφική πτυχή της CRC είναι η εμφάνιση του ήπατος μεταστάσεις, η οποία είναι υπεύθυνη για την πλειονότητα των θανάτων από τη νόσο αυτή. Έτσι, για να κατανοήσουν τους μοριακούς μηχανισμούς της μετάστασης είναι ένα από τα πιο σημαντικά θέματα στην έρευνα για τον καρκίνο. Σύμφωνα με την έννοια της ετερογένειας των κυττάρων του όγκου, ιδιαίτερα μεταστατικά κύτταρα είναι παρόντα ως υπο-πληθυσμού ενός πρωτογενούς όγκου [14]. Προς το παρόν, είναι αδύνατο προσδιορίσει μεταστατικών και μη-μεταστατικών κυττάρων στον πρωτογενή όγκο. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα

στο

vivo

μοντέλο επιλογής για τον εντοπισμό μοριακών δεικτών για την πρόβλεψη των μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων CRC. Αυτό το μοντέλο της ενέσιμης καρκινικών κυττάρων στο σπλήνα, συγκομιδή ηπατικές μεταστάσεις, και την εκ νέου έγχυση στο σπλήνα, δημιουργεί ιδιαίτερα μεταστατικές κυτταρικές γραμμές, όπως επιβεβαιώνεται από ένα μεγαλύτερο αριθμό λέμφου και ηπατικές μεταστάσεις [15]. Ομοίως, η μελέτη μας έδειξε ότι τα κύτταρα που δημιουργούνται μέσω

στο

vivo

κύκλο επιλογής απέδωσε εκτεταμένη μετάσταση στο ήπαρ και ότι η επιθετική συμπεριφορά αυτών των κυττάρων σχετίζεται με μεταβολές στην έκφραση CD44, γ-ΜΕΤ δραστηριότητα και αυξημένη ικανότητα των κυττάρων να προσκολλώνται CRC σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Ως εκ τούτου, το μοντέλο του

στο

vivo

επιλογή για μεταστατικά κύτταρα μπορεί να είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη των γενετικών αλλαγών που συμβαίνουν στα κύτταρα όταν αποκτούν το μεταστατικό φαινότυπο. Επιπλέον, η χρήση αυτού του μοντέλου επιτρέπει την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν την εξέλιξη του καρκίνου και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για την ανακάλυψη και ανάπτυξη πιθανών θεραπευτικών στόχων για CRC μετάσταση.

ο-ΜΕΤ και CD44 συν -expressed σε έναν αριθμό καρκίνων, όπως του καρκίνου του παγκρέατος και CRC [16], [17]. Παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με υψηλή έκφραση τόσο ο-ΜΕΤ και CD44 αποδείχθηκε ότι έχουν μια μεγαλύτερη ογκογόνο δυναμικό [17]. Επιπλέον, η έκφραση και των δύο πρωτεϊνών έχουν συσχετιστεί με μικρότερη περίοδο επιβίωσης ασθενών σε CRC [3], και μια πρόσφατη μελέτη από το εργαστήριο μας έδειξαν ότι η ενεργοποίηση CD44 και ο-ΜΕΤ συνδέεται με μια αύξηση στην CRC μετάσταση [18]. Συνεπής με αυτά τα ευρήματα, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης μας δείχνουν ότι μια αύξηση τόσο της έκφρασης των CD44 και την ενεργοποίηση του c-ΜΕΤ συσχετίζεται με την αύξηση του μεταστατικού δυναμικού της κυτταρικής γραμμής ΗΤ29 LM3. CD44 και ο-ΜΕΤ συνεργασία, και οι αλληλεπιδράσεις τους επί της μεμβράνης του πλάσματος, να οδηγήσει στην ενεργοποίηση του κατάντη οδών σηματοδότησης που προωθούν την εξέλιξη του καρκίνου [19] – [21]. Από την άλλη πλευρά, αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η ενεργοποίηση του c-ΜΕΤ είναι ανεξάρτητο από CD44 [22], [23]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι στην κυτταρική σειρά ΗΤ29 LM3, CD44 και ο-ΜΕΤ ενεργεί ανεξάρτητα κατά την παρουσία ή απουσία HGF, ένα πρόσδεμα c-ΜΕΤ. Διαφορές μεταξύ των μελετών θα μπορούσε να εξηγηθεί από τις διαφορές στις κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν και δείχνουν ότι η έκταση της αλληλεπίδρασης μεταξύ CD44 και c-Met μπορεί να τύπος κυττάρου. Όπως και οι δύο πρωτεΐνες που έχουν συσχετιστεί με κακή πρόγνωση σε ένα πλήθος καρκίνων, η περαιτέρω μελέτη της αλληλεπίδρασης τους με μεταστατικό κυτταρικές σειρές είναι εξαιρετικά σημαντική και μπορεί να οδηγήσει σε νέες θεραπευτικές στόχους.

Για να κατανοήσουμε καλύτερα το ρόλο του CD44 , χρησιμοποιήσαμε δύο πληθυσμοί ΗΤ29 κυττάρων που προέρχονται, CD44 + και CD44-. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η CD44 δεν είναι η βασική πρωτεΐνη οδήγηση των παράγωγων ΗΤ29 κύτταρα να γίνονται όλο και πιο μεταστατικό και ότι κατά πάσα πιθανότητα, η ενεργοποίηση c-Met ή άλλων οδών ενισχύσει CRC μετάσταση στο ήπαρ. Στο μοντέλο μας, CD44 και το σήμα c-MET ανεξάρτητα, γεγονός που δείχνει ότι ο-ΜΕΤ σηματοδότηση δεν έχει υποστεί απομείωση στην CD44- κύτταρα και συνεχίζει να οδηγεί τη μετάσταση. Επιπλέον, υπάρχουν πολλές ισομορφές του CD44, λόγω εναλλακτικού ματίσματος, που παίζουν διαφορετικούς ρόλους στη μετάσταση, η οποία μπορεί να εξηγήσει την ασυμφωνία μεταξύ των ρόλων των CD44 στην μετάσταση. Κάθε ισόμορφο έχει διαφορετικό ρόλο σε καρκινικά κύτταρα και ορισμένες μορφές καρκίνου εκφράζουν μόνο μία από τις ισομορφές, ενώ άλλα εκφράζουν πολλαπλές ισομορφές [7]. Ως εκ τούτου, να προσδιορίσει τον ακριβή λειτουργία που CD44 παίζει σε κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου γίνεται όλο και πιο σημαντική για την αξιοποίηση των CD44 ως θεραπευτικό στόχο.

Συμπεράσματα

Μια λεπτομερής κατανόηση των γενετικών μηχανισμών που κινεί το μεταστατικό καταρράκτη και την προώθηση CRC μετάσταση υποτροπής στο ήπαρ είναι σημαντική για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών θεραπειών. Καθαρό κλωνική πληθυσμούς των απομονωμένων μεταστατικών κυττάρων του ήπατος-Tropic μας επέτρεψε να επιλεκτικά μελετήσει και να συγκρίνει βιολογικούς μηχανισμούς που μεσολαβούν CRC μετάσταση στο ήπαρ. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας δείχνουν ότι η επιθετική μεταστατικό φαινότυπο του

στο

vivo

επιλεγμένα ΗΤ29 κυτταρική σειρά σχετίζεται με υπερέκφραση του CD44 και ενεργοποίηση του c-MET. Έχουμε αποδείξει ότι η ενεργοποίηση c-Met είναι CD44 ανεξάρτητη κατά την HGF διέγερση και να επιβεβαιώσει ότι η έκφραση CD44 στην κυτταρική γραμμή ΗΤ29 ΠΝ 3 δεν είναι υπεύθυνη για την αύξηση του μεταστατικού διεισδυτικότητα στην κυτταρική γραμμή ΗΤ29 LM3. Είναι σημαντικό, έχουμε αποδείξει ότι το μοντέλο του

στο

vivo

επιλογή για μεταστατικά κύτταρα CRC αποτελεί ένα πολύτιμο εργαλείο για τον εντοπισμό των μηχανισμών που συμβάλλουν στην μετάσταση στο ήπαρ σε CRC και τον προσδιορισμό μοριακών οδών για μια στοχευμένη θεραπεία του CRC μετάσταση στο ήπαρ.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ευχαριστήσω Donna Gilbreath και Heather Russell Simmons-για βοήθεια με την προετοιμασία του χειρογράφου, Jennifer Strange και Greg Bauman για βοήθεια σχετικά με FACS, και Dana Napier για την εργασία της με η Markey Biospecimen και ιστών διευκόλυνση κοινόχρηστο πόρο.