Αφηρημένο

Διαιτητικά συμπληρώματα σεληνίου και πράσινο τσάι κατέχει υπόσχεση στην πρόληψη του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, αξιολογήθηκαν οι αποτελεσματικότητες του σεληνίου και το πράσινο τσάι χορηγούνται μεμονωμένα και σε συνδυασμό εναντίον καρκίνου του παχέος εντέρου σε αζοξυμεθάνιο (ΑΟΜ) παχέος μοντέλο καρκινογένεσης επαγόμενη αρουραίου και προσδιορίζεται των υποκείμενων μηχανισμών προστασίας. Ηλικίας τεσσάρων εβδομάδων αρσενικούς αρουραίους Sprague-Dawley τράφηκαν με δίαιτες που περιέχουν εκχύλισμα πράσινου τσαγιού 0.5%, 1 ppm σελήνιο ως σελήνιο εμπλουτισμένου πρωτεΐνη γάλακτος, ή συνδυασμό 1 ppm σελήνιο και εκχύλισμα πράσινου τσαγιού 0,5%. Τα ζώα έλαβαν 2 ΑΟΜ (15 mg /kg) θεραπείες για την επαγωγή του κόλου ογκογένεση. Οι αρουραίοι θανατώθηκαν 8 ή 30 εβδομάδων αργότερα μετά την τελευταία ΑΟΜ να εξετάσει την επίδραση της διατροφικής παρέμβασης στην παρεκκλίνουσα κρυπτικών εστιών (ACF) σχηματισμός ή η ανάπτυξη του όγκου. Στις θυσία, κόλον εξετάστηκαν για ACF και των όγκων, τα επίπεδα mRNA του

SFRP5

και

Κυκλίνη D1

, και οι πρωτεΐνες επίπεδα β-κατενίνης, COX-2, Ki-67, DNMT1 και ακετυλο ιστόνης Η3. Ο συνδυασμός του σεληνίου και πράσινο τσάι ως αποτέλεσμα τη σημαντική προσθετική αναστολή των μεγάλων ACF σχηματισμού, αυτή η επίδραση ήταν μεγαλύτερη από είτε σεληνίου ή πράσινο τσάι μόνο,

P

& lt? 0,01? ο συνδυασμός είχε επίσης σημαντική επίδραση αναστολή πρόσθετης ύλης για όλα τα τελικά σημεία των όγκων, η επίδραση της διατροφής συνδυασμό σχετικά με την επίπτωση του όγκου, την πολλαπλότητα και το μέγεθος ήταν μεγαλύτερο από ό, τι σεληνίου ή του πράσινου τσαγιού μόνο,

P

& lt? 0,01. Οι αρουραίοι τρέφονται η διατροφή συνδυασμός έδειξε σημαντική μείωση της έκφρασης DNMT1 και επαγωγή της ιστόνης Η3 ακετυλίωση, τα οποία συνοδεύονταν από την αποκατάσταση της

SFRP5

mRNA σε κανονικό εμφανίζονται παχέος κρύπτες. Η δίαιτα συνδυασμός επίσης μείωσε σημαντικά την β-κατενίνης πυρηνική μετατόπιση,

κυκλίνης D1

έκφρασης και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν, για πρώτη φορά, ότι ο συνδυασμός του σεληνίου και το πράσινο τσάι είναι πιο αποτελεσματική στην καταστολή του παχέος ογκογένεση από οποιονδήποτε παράγοντα μεμονωμένα. Η προληπτική δράση συνδέεται με τη ρύθμιση των γενετικών και επιγενετικών βιοδεικτών που εμπλέκονται στην καρκινογένεση του παχέος

Παράθεση:. Hu Υ, McIntosh GH, Le Leu RK, Nyskohus LS, Γούντμαν RJ, Νέοι GP (2013) Συνδυασμός Σελήνιο και το πράσινο τσάι αυξάνει την αποτελεσματικότητα της χημειοπροφύλαξης σε Rat καρκίνο του παχέος εντέρου Μοντέλο διαμορφώνοντας Γενετικές και επιγενετικές βιοδείκτες. PLoS ONE 8 (5): e64362. doi: 10.1371 /journal.pone.0064362

Επιμέλεια: Devanand Sarkar, Βιρτζίνια Πανεπιστήμιο της Κοινοπολιτείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Δεκ, 2012? Αποδεκτές: 12 του Απριλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: May 23, 2013

Copyright: © 2013 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση δόθηκε από την Εθνική Υγεία και επιχορήγηση Ιατρικό Συμβούλιο Έρευνας και Καρκίνος του Συμβουλίου της Νοτίου Αυστραλίας (αριθμός έργου 1007501 και 525925). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο σε όλο τον κόσμο? διαφορετικά σε άλλες μορφές καρκίνου, η σημασία της περιβαλλοντικής έκθεσης (ειδικά η διατροφή) στην αιτιολογία της CRC τονίζεται από το γεγονός ότι & lt? 50% της αιτιώδους συνάφειας μπορεί να αποδοθεί σε οικογενή παράγοντες, ενώ οι διαιτητικοί παράγοντες συμβάλλουν έως και 70% [1] . Ειδικές διατροφικές στρατηγικές μπορεί να αποδειχθεί πολύτιμο στην προστασία κατά του καρκίνου [2]. Σε αυτό το πλαίσιο, οι συσχετισμοί μεταξύ της διατροφής και του τρόπου ζωής έχουν θεσπιστεί για την πρόληψη CRC, και έχει υπολογιστεί ότι το 30-50% των CRC θα μπορούσε να είναι δυνητικά μπορεί να προληφθεί με την κατανάλωση μιας υγιεινής διατροφής [3].

Τα τελευταία χρόνια , φυσικά παράγοντες που υπάρχουν σε ό, τι τρώμε ή το ποτό που συμβαίνουν έχουν επιστήσει μεγάλη προσοχή με την δυνητική τους ικανότητα για την πρόληψη ή /και θεραπεία του καρκίνου λόγω των διαφόρων οφέλη για την υγεία τους και το περιθώριο ευρεία ασφάλειας [2], [4]. Σελήνιο (Se), ένα ουσιαστικό ίχνος μικροθρεπτικά συστατικά, και το πράσινο τσάι, το πιο κοινό ρόφημα που καταναλώνεται σε όλο τον κόσμο, έχουν ταυτοποιηθεί ως παράγοντες προφύλαξης για διάφορους καρκίνους. Επιδημιολογικές, κλινικές και προκλινικές μελέτες προτείνουν μια αντίστροφη σχέση μεταξύ της πρόσληψης Se, κατανάλωσης πράσινου τσαγιού και του κινδύνου εμφάνισης ορισμένων μορφών καρκίνου [5] – [7]. Μελέτες με ζωικά μοντέλα έχουν επίσης δείξει ότι η Se και το πράσινο τσάι έχουν ένα ευρύ φάσμα των προληπτικών δραστικότητα έναντι CRC [8] – [10]. Παρά τα ελπιδοφόρα αποτελέσματα σε προκλινικές ρυθμίσεις, τρέχοντα δεδομένα των κλινικών δοκιμών που σχετίζονται με την Se και το πράσινο συμπληρώματα τσαγιού δεν είναι αρκετά πειστικά ώστε να επιτρέψει μια γενική σύσταση για τη χρήση Se ή το πράσινο τσάι ως ένα αποτελεσματικό μέσο για την χημειοπροφύλαξη του καρκίνου στον άνθρωπο [11] – [13] . Ο περιορισμός οποιουδήποτε μεμονωμένου διαιτητικών παράγων για την αποτελεσματική πρόληψη μπορεί να οφείλεται στη μείωση δραστικότητας των διατροφικών παραγόντων, ενώ φυσικές ενώσεις έχουν δείξει μεγαλύτερη δραστικότητα όταν είναι παρόντα σε ένα μίγμα [14]. Θα μπορούσε να είναι δυνατή η επίτευξη προσθετική ή συνεργιστική προληπτικά αποτελέσματα συνδυάζοντας διαιτητικών παραγόντων που ασκούν συμπληρωματικούς μηχανισμούς σε αντι-καρκινογόνο δράση τους [2], [15], [16]. Σημαντική δεδομένα από ζωικά και ανθρώπινα μελέτες δείχνουν ότι οι συνδυασμοί των διατροφικών παραγόντων είναι πιο αποτελεσματική από ένα ενιαίο μέσο [17], [18]. Για παράδειγμα, το πράσινο τσάι έχει αποδειχθεί ότι συνεργιστικά ή προσθετικά να αυξήσει την αποτελεσματικότητα άλλων φαρμάκων ή διατροφικών παραγόντων

in vitro

και

in vivo

[19] – [22].

Παρά το αυξανόμενο ενδιαφέρον για την χημειοπροληπτικές ρόλο του Se ή πράσινο τσάι, είναι άγνωστο εάν ο συνδυασμός της Se και το πράσινο τσάι έχει ευεργετική επίδραση στην chemopreventive CRC. Παρά το γεγονός ότι οι προκλινικές και κλινικές αναφορές που συνδυάζουν Se και το πράσινο τσάι λείπει, συνδυασμός προσεγγίσεων με Se ή το πράσινο τσάι έχουν μελετηθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου και άλλα μοντέλα καρκίνου [23]. Για παράδειγμα, ένας συνδυασμός Se και γενιστεΐνη έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τον καρκίνο του μαστού σε ένα μοντέλο αρουραίου [24]? ένας συνδυασμός Se και η βιταμίνη Ε έχει παράσχει μεγαλύτερη προστασία έναντι του οισοφάγου καρκινογένεση σε αρουραίους [22]. Ο συνδυασμός του πράσινου τσαγιού και κουρκουμίνη ή ο συνδυασμός πράσινου τσαγιού και σουλινδάκ έχει οδηγήσει σε συνεργιστική chemopreventive επίδραση σε ένα μοντέλο ΑΟΜ CRC [25], [26].

Se και το πράσινο τσάι είναι ιδιαίτερα ενδιαφέροντα ως συνδυασμός όχι μόνο επειδή μπορούν να εύκολα συν-χορηγείται με την τροφή, αλλά και επειδή έχει δυνητικά συμπληρωματικούς μηχανισμούς δράσης. αφαίρεση αποπτωτικών και το ένζυμο επιδιόρθωσης του DNA O

6 αλκυλο-γουανίνη DNA αλκυλοτρανσφεράσης (MGMT) μεσολάβηση επιδιόρθωση του DNA είναι δύο σημαντικά έμφυτη κυτταρικές αποκρίσεις σε καρκινογόνο που προκαλείται από βλάβες του περιβάλλοντος ογκογόνο DNA. Το πράσινο τσάι έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζουν MGMT δραστηριότητα στο παχύ έντερο αρουραίου σε προηγούμενη μελέτη μας (αδημοσίευτα δεδομένα) από ένα επιγενετικές μηχανισμό που θα αναμενόταν να επισκευάσει το είδος του προϊόντος προσθήκης που επάγεται από αζοξυμεθάνιο (ΑΟΜ) [27]. Διαιτητικά Se έχει αποδειχθεί από την ομάδα μας για την ενεργοποίηση αποπτωτικών διαγραφή των κυττάρων ΑΟΜ-επηρεάζονται [28]. Υποθέτουμε ότι ο κίνδυνος ανάπτυξης CRC θα μειωθεί με το συνδυασμό παραγόντων που στοχεύουν διαφορετικές πτυχές της έμφυτης κυτταρικών αποκρίσεων σε ογκογόνους βλάβες του DNA. Αυτό δικαιολογείται από το γεγονός ότι η CRC έχει μια μεγάλη αρχική περίοδο λανθάνουσας κατάστασης, περιλαμβάνει πολλαπλά στάδια και μονοπάτια, και συνδυαστική προσέγγιση μπορεί ταυτόχρονα ρυθμίζουν πολλαπλές μοριακών και κυτταρικών στόχων που εμπλέκονται στη διαδικασία της CRC [29].

μας αυξημένη κατανόηση των CRC στις επιγενετικές /γενετικό επίπεδο ανοίγει επίσης ευκαιρίες για να διακόψει και να αντιστρέψει την έναρξη και την πρόοδο της CRC και παρέχει πολλές στόχοι για διαιτητική παρέμβαση [30]. Το ΑΟΜ που προκαλείται μοντέλο CRC έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς τόσο μηχανιστικές και chemepreventive μελέτες [31], επειδή ανακεφαλαιώνει πολλές από τις κλινικές, παθολογικές, και μοριακά χαρακτηριστικά της ανθρώπινης CRC, όπως προνεοπλαστικών βλαβών, μη-φυσιολογικών κρυπτών εστίες (ACF), μεταλλάξεις σε

K-ras ογκογονιδίου

, και η απορρύθμιση των μονοπατιών σηματοδότησης στην WNT /β-κατενίνης και τη φλεγμονή [31], [32]. Αν και οι ρόλοι των WNT-ανταγωνιστές (όπως εκκρινόμενες κατσαρωμένα συγγενείς πρωτεΐνες (SFRPs)), μεθυλτρανσφεράσες DNA (DNMT) και απακετυλίωση ιστόνης σε ανθρώπινο κολονικό καρκινογένεση είναι καλά τεκμηριωμένη, η έκφραση του DNMT1, SFRR5 και ακετυλίωση της ιστόνης Η3 σε αυτό το μοντέλο είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες? τα οποία παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των ανθρώπινων καρκίνων του παχέος εντέρου [33] – [35]. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να αξιολογήσει την χημειοπροληπτική επίδραση του συνδυασμού διαιτητικών παραγόντων Se και πράσινο τσάι κατά του κόλου καρκινογένεση, χρησιμοποιώντας ACF και οι όγκοι του κόλου ως τελικά σημεία. Εξετάστηκαν επίσης οι επιπτώσεις αυτού του συνδυασμού για τις γενετικές /επιγενετικό βιοδείκτες.

Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

ΑΟΜ και εκχύλισμα πράσινου τσαγιού αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich Pty. Ltd. Πράσινη εκχύλισμα τσαγιού (P1204) περιέχει 65% σε κατεχίνες, συμπεριλαμβανομένων 34,5% επιγαλλοκατεχίνη (EGCG). πρωτεΐνη γάλακτος (0.34ppm Se) και Se-εμπλουτισμένη πρωτεΐνη γάλακτος (5 ppm Se) δόθηκαν από Tatura γάλα Industries (VIC, Αυστραλία) [28]. Se-εμπλουτισμένο πρωτεΐνης γάλακτος περιέχει 83% σεληνομεθειονίνης, 5% selenocysteine ​​και 4% άγνωστος συστατικά [36].

Ζώα

Ένα σύνολο 160 αρσενικούς αρουραίους Sprague-Dawley ελήφθησαν από την Resource Animal Κέντρο, το Πανεπιστήμιο της Αδελαΐδας, στην Αυστραλία. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή Μέριμνας Ζώων του Πανεπιστημίου Flinders (# 651/07). Δύο πειράματα πραγματοποιήθηκαν, 60 αρουραίους για ένα πείραμα ACF και 100 για ένα πείραμα μακροπρόθεσμης όγκου.

Για κάθε πείραμα, οι αρουραίοι χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ίσες πειραματικές ομάδες (με συγκρίσιμα αρχικά βάρη σώματος), που στεγάζεται σε πλαστικά κλουβιά (τέσσερα ανά κλουβί) και διατηρούνται σε θερμοκρασία και υγρασία ελεγχόμενες εγκατάσταση ζώων με έναν κύκλο φωτός /σκότους 12 h φως σε θερμοκρασία 22 ± 2 ° C και 80 ± 10% υγρασία. Οι αρουραίοι είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε νερό, ζυγίζονται εβδομαδιαία και παρακολουθήθηκαν στενά για κλινικά σημεία κακής υγείας σε όλη τη μελέτη. Οι αρουραίοι που φαίνονται άρρωστα θανατώθηκαν αμέσως.

Δίαιτες

Οι πειραματικές δίαιτες βασίστηκαν σε μια τροποποιημένη δίαιτα ΑΙΝ-76Α και περιείχε 19% ηλιέλαιο κατά βάρος, έτσι ώστε να «εξανθρωπίσει» τη συμβολή του λίπους στην ενεργειακή πρόσληψη σε -35% [28]. πρωτεΐνη γάλακτος χρησιμοποιήθηκε ως πηγή πρωτεΐνης για τον έλεγχο και το πράσινο τσάι δίαιτες? Se-εμπλουτισμένο πρωτεΐνης γάλακτος χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη, καθώς και μια πηγή Se συμπληρωματικό για τη διατροφή υψηλή Se και τη δίαιτα συνδυασμός? δίαιτα ελέγχου περιείχε ούτε Se ούτε το πράσινο τσάι. Επιλογή του 0,5% το πράσινο τσάι βασίστηκε σε προηγούμενη μελέτη μας ότι αυτή η πρόσληψη αυξήθηκε σημαντικά έκφρασης MGMT (mRNA και της δραστηριότητας) στο παχύ έντερο του αρουραίου (αδημοσίευτα δεδομένα). Αυτή η δόση περιέχει 172,5 mg EGCG /100 g διατροφή και την παροχή 25,9 mg EGCG /αρουραίο /ημέρα, η οποία όταν υπολογίζονται ανά σωματικού βάση βάρους θα παρέχει το ισοδύναμο πρόσληψη σε έναν ενήλικο άνθρωπο από 3-4 φλιτζάνια πράσινο τσάι ημερησίως. Αυτή η αγωγή σίτιση ήταν καλά ανεκτή από τα ζώα [37]. 1 ppm Se επιλέχθηκε επειδή προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι Se εμπλουτισμένου πρωτεΐνης γάλακτος στο 1 ppm σημαντικά προστατεύονται έναντι καρκίνων του παχέος εντέρου σε ποντικούς [28]. Οι δίαιτες παρασκευάστηκαν φρέσκα σε 4-εβδομαδιαία διαστήματα, σφαιροποιήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Οι λεπτομέρειες της διατροφής που παρέχονται στον Πίνακα 1.

Η

Πείραμα 1 (μελέτη ACF)

Ξεκινώντας από 5 εβδομάδες της ηλικίας, οι αρουραίοι (15 /ομάδα) τροφοδοτήθηκαν σε κάθε μία από τέσσερις δίαιτες . Μετά από 2 εβδομάδες σε δίαιτες, οι αρουραίοι έλαβαν 2 ενέσεις ΑΟΜ (15 mg /kg βάρους σώματος) μία εβδομάδα χώρια. Οι αρουραίοι παρέμειναν στο ίδιο δίαιτα καθ ‘όλη τη μελέτη μέχρι σκοτώθηκε από CO

2 ασφυξία 8 εβδομάδες μετά την τελευταία ένεση ΑΟΜ (Σχήμα 1Α). Παχύ έντερο άνοιξαν επίπεδη διάρκεια της νύχτας σε χαρτί hibond C για ανάλυση ACF. Μετά την ανάλυση, ένα περιφερικό τμήμα του κανονικού εμφανίζονται κόλου (2 cm) κόβονται και χρωματίζονται με Ki-67, COX-2 και τα αντισώματα β-κατενίνης (12 /ομάδα)

μελέτη ACF (Α).: ομάδες αρουραίων (n = 15) είχαν τραφεί ελέγχου, Se, το πράσινο τσάι ή διατροφή που περιέχει Se και πράσινο σε ηλικία 5 εβδομάδων. 2 εβδομάδες αργότερα, οι αρουραίοι έλαβαν 15 (mg /kg /σωματικού βάρους) ΑΟΜ, μία φορά την εβδομάδα για 2 εβδομάδες. 8 εβδομάδες μετά την τελευταία θεραπεία ΑΟΜ, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε ευθανασία και κόλον αξιολογήθηκαν για ACF? κανονικής εμφανίζονται κρύπτες εξετάστηκαν επίσης για β-κατενίνης, COX-2 και Ki-67 έκφρασης. μελέτη των όγκων (Β): ομάδες αρουραίων (n = 25) είχαν τραφεί ελέγχου, Se, το πράσινο τσάι ή δίαιτα που περιέχει Se και το πράσινο στην ηλικία των 5 εβδομάδων. Αρουραίους δόθηκαν δύο εβδομαδιαίες θεραπείες ΑΟΜ παρόμοια με τη μελέτη ACF. 30 εβδ μετά τη θεραπεία ΑΟΜ, οι αρουραίοι υποβλήθηκαν σε ευθανασία και κόλον ιστορικά αξιολογήθηκαν για αποτελέσματα όγκου? κανονικό εμφανίζονται κρύπτες εξετάστηκαν επίσης για την β-κατενίνης, DNMT1, Ac-Η3, καθώς και

SFRP5

και

κυκλίνης D1

έκφρασης.

Η

Πείραμα 2 ( μελέτη όγκου)

αρουραίων ηλικίας

5 εβδ (25 /ομάδα) τροφοδοτήθηκαν σε καθένα από τέσσερα δίαιτες, παρόμοια με τη μελέτη ACF. Οι αρουραίοι έλαβαν 2 εβδομαδιαίες ενέσεις ΑΟΜ (15 mg /kg), αλλά θανατώθηκαν 30 εβδομάδες μετά την τελευταία ΑΟΜ (Εικόνα 1Β). Παχύ έντερο εξετάσθηκαν για τα τελικά σημεία των όγκων και την περαιτέρω επεξεργασία για ιστοπαθολογική αξιολόγηση. Ένα περιφερικό τμήμα του κανονικού εμφανίζονται κόλον (2 εκατ) δωρεάν νεοπλασμάτων αποκόπηκε για ανοσοϊστοχημεία της β-κατενίνης, DNMT1 και ακετυλιωμένης ιστόνης Η3 (Ac-Η3) (12 /ομάδα) ή καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο για ανάλυση κηλίδας Western (6 /ομάδα) ή να τοποθετηθούν σε RNAlater (Ambion) για την ποσοτική ανάλυση RT-PCR (6 /ομάδα).

Η ποσοτικοποίηση των ACF

Άνω και κάτω τελεία βάφτηκαν με διάλυμα κυανού του μεθυλενίου 0,1% και αξιολογείται σε × 40 μεγέθυνσης χρησιμοποιώντας ένα τεμαχίζοντας μικροσκόπιο σε μια τυφλή διαδικασία βαθμολόγησης. Συνολικός αριθμός ACF σε ολόκληρο το κόλον βαθμολογήθηκε από το περιφερικό προς το κεντρικό άκρο του παχέος εντέρου. ACF διακρίθηκαν από τα γύρω φυσιολογικό κρύπτες από το αυξημένο μέγεθος τους, αυξημένη εμφάνιση και τη σχισμή όπως το σχήμα του ανοίγματος του αυλού. Κρύπτη πολλαπλότητα ορίστηκε ως ο αριθμός των κρυπτών σε κάθε εστίασης, και κατηγοριοποιούνται ως μικρές (1-3 κρύπτες /εστίαση) και μεγάλων ACF (4 ή περισσότερες κρύπτες /εστίαση).

Η ιστοπαθολογική εξέταση των όγκων

Ο αριθμός, η θέση και το μέγεθος του κάθε όγκου βαθμολογήθηκαν από έναν ανεξάρτητο παρατηρητή αγνοεί την διαιτητική θεραπεία. Οι όγκοι κατηγοριοποιούνται ως αδενώματα και αδενοκαρκινώματα όπως περιγράφηκε προηγουμένως από εμάς [28]. Καταληκτικά σημεία ήταν η συχνότητα εμφάνισης όγκων του παχέος εντέρου (δηλαδή ποσοστό των αρουραίων με όγκους, με αδενώματα ή αδενοκαρκινώματα), τον αριθμό των όγκων (αριθμός των όγκων /αρουραίος) και το μέγεθος του όγκου (καρκινικών μέγεθος /αρουραίο). Το μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε από τον τύπο:. log

10 [Σ (π (diameter1 + διαμέτρου 2))

2/2] [38]

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση

Η πρωτογενή αντισώματα εναντίον Ki-67 (ΜΙΒ-5, # M7248) αγοράστηκαν από την Dako, Αυστραλία? COX-2 (Μ-19-R, # SC-1747-R), β-κατενίνης (Ε5, # SC-7963) και DNMT1 (H-300 # SC-2701) από την Santa Cruz Biotechnology, την Αυστραλία και Ac-Η3 (Lys9 /Lys14, # 9677) από την κυτταρική σηματοδότηση, USA. Οι λεπτομερείς διαδικασίες για ανοσοϊστοχημική ανάλυση έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [28]. Εν συντομία, η ανάκτηση αντιγόνου διεξήχθη με τμήματα θερμάνσεως σε ρυθμιστικό 0,1 Μ κιτρικό χύτρα πλαστική σκάφη για 1 ώρα. Οι τομές επωάστηκαν με Ki-67 αντίσωμα (1:1000), αντίσωμα COX-2 (1:500), αντίσωμα β-κατενίνης (1:1,000), αντίσωμα DNMT1 (1:2,000), και Ac-Η3 αντίσωμα (1: 5000) για μια νύχτα μετά από επώαση σε 3% Η

2O

2 για 20 λεπτά. Ανίχνευση για Ki-67 και COX-2 ήταν βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντίσωμα κουνελιού αντι-ποντικού (1:200) (Dako) για 30 λεπτά και /βιοτινυλιωμένης υπεροξειδάσης αβιδίνης (Signet Laboratories) επί 20 λεπτά. Ανίχνευση για DNMT1 και β-κατενίνης ήταν από ένα πολυμερές σύνδεσης HRP. Τα πλακίδια έγιναν ορατά με επώαση με υπόστρωμα 3′-diaminobenzamine και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Μια θετική χρώση προσδιορίζονται από καφεκόκκινο ίζημα στον πυρήνα για Ki-67, DNMT1 και Ac-Η3, στο κυτταρόπλασμα για COX-2 και σε μεμβράνη /πυρήνα για β-κατενίνης. 20 άθικτα κάθετος καλά προσανατολισμένη κανονικής εμφανίζονται κρυπτών (που εκτείνεται από το μυϊκό βλεννογόνο στο κολονικό αυλό) εξετάστηκαν για κάθε δείγμα κόλον. Ο δείκτης της κολονικής κρύπτης κύτταρα που εκφράζουν το Ki-67, COX-2, DNMT1 και Ac-Η3 υπολογίστηκε ως ο αριθμός των θετικών κυττάρων ανά στήλη κρύπτη διαιρούμενο με το συνολικό αριθμό των κυττάρων και πολλαπλασιάζεται με 100. Η μεμβράνη και η πυρηνική χρώση β-κατενίνης κύτταρα μετρήθηκαν χωριστά. Η ανώμαλη έκφραση των β-κατενίνης, DNMT1 και Ac-Η3 εξετάστηκε επίσης σε ιστούς όγκων.

Western Blot ανάλυση

Δείγματα του φυσιολογικού εμφανίζονται ιστοί κόλου από έξι αρουραίους ανά ομάδα συνενώθηκαν και ομογενοποιούνται σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris, 1% ΝΡ40, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 0.1% SDS, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF και αναστολείς πρωτεάσης) και φυγοκεντρείται (14000 χ g για 25 λεπτά στους 4 ° C) . Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στα υπερκείμενα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Bio-Rad. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών (30 μ§) διαχωρίστηκαν σε 4-20% γέλες SDS-PAGE, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης χρησιμοποιώντας ημι-ξηρή μεταφορά και η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε με 5% αποβουτυρωμένο γάλα, ανιχνεύθηκαν με β-κατενίνης, DNMT1 και Ac-Η3 αντισώματα και χρωματίστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα (μια υπεροξειδάση αρμορακίας σημασμένο IgG αντι-κουνελιού ή γίδινη αντι-ποντικού IgG). κηλίδα Western επαναλήφθηκε τρεις φορές για κάθε δείγμα. Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας φως ανίχνευσης. Κάθε μεμβράνη επανα-διερευνήθηκαν με αντίσωμα αντι-β-ακτίνης (Sigma) ή αντι-ιστόνης Η3 αντίσωμα (# 4499, κυτταρική σηματοδότηση). εντάσεις Band για β-κατενίνης, DNMT1were ποσοτικά με Image J και κανονικοποιήθηκε με β-ακτίνη, ενώ ένταση ζώνης του Ac-Η3, ομαλοποιήθηκε με H3 ιστόνης. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως αναλογία προς β-ακτίνη ή Η3 ιστόνης.

Ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από άνω και κάτω τελεία αρουραίου χρησιμοποιώντας ένα QIAGEN RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany). Η συγκέντρωση και η καθαρότητα του ολικού RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα NanoDrop® ND-1000 UV-Vis φασματοφωτόμετρο με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 και 280 nm. Συμπληρωματικό DNA (cDNA) συντέθηκε από 0,3 μg ολικού RNA για κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας QIAGEN QuantiTect Reverse Transcription Kit. Η

SFRP5

και

κυκλίνης D1

γονίδια συν-ενισχύθηκαν με

GAPDH

γονιδίου, η οποία χρησίμευσε ως ένα γονίδιο καθαριότητας. Αστάρια για το

SFRP5

γονίδιο αγοράστηκαν από Qiagne, Rn_Sfrp5_1_SG QuantiTect Primer Αναλύσεις (NM_001107591, XM_001055342, XM_219887, XM_347305- Cat # QT01624056). Εκκινητές για

Κυκλίνη D1

γονίδιο (NM_171992) ήταν 5′-ATGAGAACAAGCAGATCATCC-3 ‘(εμπρόσθιος εκκινητής) και 5′-TAGCAGGAGAGGAAGTTGTTG-3’ (Reverse Primer). Εκκινητές για το

GAPDH

γονίδιο (NM_017008) ήταν 5′-AACATCATCCCTGCATCCAC-3 ‘(εμπρόσθιος εκκινητής) και 5′-TTGAAGTCRCAGGAGACAAC-3’ (Reverse Primer). Real-time PCR διεξήχθη με κιτ QuantiTect SYBR Green PCR σε ένα ρότορα Gene 3000 Cycler (Corbett, Αυστραλία). Οι συνθήκες των κύκλων του 40 κύκλοι ήταν 94 ° C /15 s, 55 ° C /30 s και 72 ° C /30 s. Κάθε δείγμα τρέχει σε τριπλή επανάληψη και κανονικοποιούνται με

GAPDH

. Για κάθε εκτέλεση PCR, μια αντίδραση μη-πρότυπο συμπεριλήφθηκε ως αρνητικοί μάρτυρες. Όλα τα δεδομένα PCR αναλύθηκαν με το λογισμικό Q-Gene όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36], [39].

Στατιστικές αναλύσεις

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS έκδοση 17.0 (SPSS Inc., Chicago , Illinois) και Stata έκδοση 11.1 (StataCorp, Τέξας). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± τυπικό σφάλμα του μέσου για κανονικά κατανεμημένα δεδομένα. Συγκρίσεις μεταξύ ομάδων για το βάρος, Ki-67, COX-2, β-κατενίνης, DNMT1, Ac-Η3,

SFRP5

και

Κυκλίνη D1

διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA με διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις με δοκιμασία post hoc Tukey, ένα

P

-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά μεταξύ των ομάδων. Μεταξύ των ομάδων συγκρίσεις των μετρήσεων ACF και τα μέτρα όγκου αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τα 2 × 2 σχέδια παραγοντικό με πράσινο τσάι και Se ως τους δύο βασικούς παράγοντες. Binary logistic και αρνητικά πρότυπα διωνυμική παλινδρόμηση χρησιμοποιήθηκαν για να ελέγξετε για τις κύριες επιδράσεις του πράσινου τσαγιού και Se και για τις πιθανές επιδράσεις της αλληλεπίδρασης μεταξύ του πράσινου τσαγιού και Se. Post-hoc συγκρίσεις για καθένα από τα 3 δίαιτες παρέμβαση με δίαιτα ελέγχου ως ομάδα σύγκρισης, καθώς και συγκρίσεις για το συνδυασμό δίαιτας μόνο με την Se ή πράσινο τσάι μόνοι πραγματοποιήθηκαν επίσης. Ένα

P

-τιμή του & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική για κάθε κύρια επίδραση και αλληλεπίδραση

Αποτελέσματα

Γενική παρατήρηση

Οι δίαιτες έτυχαν καλής υποδοχής. και καταναλώνονται από τέσσερις ομάδες αρουραίων. Όλοι οι αρουραίοι ανεξάρτητα από διαιτητική ομάδα παρέμβασης έδειξε φυσιολογική αύξηση του σωματικού βάρους κατά τη διάρκεια των δύο πειραμάτων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)? δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στην κατανάλωση τροφής μεταξύ των διατροφικών ομάδων. Η εξέταση του λεπτού εντέρου, του ήπατος και των νεφρών δεν αποκάλυψε καμία ανωμαλία σε κάθε μελέτη, που δείχνει διαιτητική συμπλήρωση με 1 ppm Se ή 0,5% το πράσινο τσάι, ή το συνδυασμό Se και το πράσινο τσάι δεν προκαλεί καμία εμφανή τοξικότητα. Έξι άρρωστα ποντίκια σκοτώθηκαν πριν από τη λήξη της μελέτης του όγκου? είχαν διανεμηθεί στις τρεις ομάδες θεραπείας και τα τελικά σημεία των όγκων από αυτά τα ποντίκια δεν ήταν σε θέση να συμπεριληφθούν.

Η διατροφή συνδυασμός αναστέλλει αποτελεσματικά το σχηματισμό ACF στην ΑΟΜ μοντέλο

ΑΟΜ προκαλείται από ACF παρατηρήθηκαν κυρίως στο περιφερικό και μεσαία του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματα της Se, το πράσινο τσάι και ο συνδυασμός δίαιτας επί του σχηματισμού ACF φαίνονται στον Πίνακα 2. Αν και ο συνολικός αριθμός των ACF /αρουραίο από τη μελέτη μας ήταν κάπως χαμηλότερη σε σύγκριση με άλλες προηγουμένως δημοσιευμένες μελέτες [40], οι αρουραίοι τρέφονται πράσινο τσάι μόνο είχε καμία επίδραση στη συνολική ACF και μικρές ACF /αρουραίο, παρόλο που μείωσε σημαντικά μεγάλες ACF /αρουραίο,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με εκείνους που τροφοδοτείται την δίαιτα ελέγχου. Αντίθετα, όλες οι κατηγορίες των ACF κρύπτη πολλαπλότητα (σύνολο, μικρές και μεγάλες ACF /αρουραίος) μειώθηκαν σημαντικά από την Se μόνο (

P

& lt? 0,05) και η δίαιτα συνδυασμού (

P

& lt ? 0,01), σε σύγκριση με την δίαιτα ελέγχου. Είναι σημαντικό, η διατροφή συνδυασμός έδειξε μεγίστη αναστολή σε μεγάλες ACF (δηλαδή ACF που περιέχει τέσσερα ή περισσότερα κρύπτη εστίες, η πιο σχετική για την πρόβλεψη της μετέπειτα επεμβατική καρκινικές βλάβες) σε σύγκριση είτε με Se ή πράσινου τσαγιού και μόνο: με περίπου 70% μεγαλύτερη αναστολή σε σχέση με το πράσινο τσάι δίαιτα και 66% αναστολή μεγαλύτερη σε σχέση με Se δίαιτα (μέσος αριθμός = 8.4 ± 1.3, 7.5 ± 1.6 και 2.5 ± 0.5 για το πράσινο τσάι, Se και ο συνδυασμός δίαιτας αντίστοιχα,

P

& lt? 0,05 για τον συνδυασμό δίαιτας έναντι κάθε του πράσινου τσαγιού και Se).

Η

Η διατροφή συνδυασμός αναστέλλει αποτελεσματικά το σχηματισμό όγκων στο μοντέλο ΑΟΜ

Οι σημαντικές μειώσεις στον αριθμό των ACF είναι σύμφωνες με τις χαμηλότερες επιβαρύνσεις του όγκου που παρατηρείται σε οι αρουραίοι που έλαβαν το συνδυασμό δίαιτας (Πίνακας 3). Υπήρξε μια σημαντική αλληλεπίδραση μεταξύ Se και το πράσινο τσάι,

P

& lt? 0,05, με τη δίαιτα συνδυασμό δείχνουν προσθετικό ανασταλτική επίδραση σε όλες τις παραμέτρους όγκου σε σχέση με ένα μόνο διαιτητικές παράγοντα όπως το πράσινο τσάι ή Se,

P

& lt? 0,01. Όγκου συχνότητα, πολλαπλότητα και ο όγκος μεγέθους μειώθηκαν κατά 73,9, 80,4%, 73,4% σε σχέση με το πράσινο τσάι δίαιτα, και από 65,2%, 72,7%, 63% έναντι Se δίαιτα, αντίστοιχα. Το πράσινο τσάι από μόνο του δεν επηρέασε σημαντικά κάθε τελικό σημείο του όγκου, ενώ η Se μόνο ήταν λιγότερο αποτελεσματικό από τη δίαιτα συνδυασμού. Ανάλυση της επίδρασης του διαιτητική παρέμβαση στο σχηματισμό του καρκίνου πραγματοποιήθηκε ειδικά μετά ιστοπαθολογική εξέταση των όγκων. Η συχνότητα εμφάνισης αδενώματος στον έλεγχο, το πράσινο τσάι, Se και τις δίαιτες συνδυασμό, ήταν 26,1%, 20,8%, 16,7% και 4,3%, αντίστοιχα. Υπήρξε μια σημαντική μείωση στους αρουραίους που τρέφονταν με τη δίαιτα συνδυασμό, μειώθηκε κατά 79,3% σε σχέση με το πράσινο τσάι δίαιτα, και κατά 74,2% έναντι Se δίαιτα,

P

& lt? 0,01, αντίστοιχα. Η συχνότητα εμφάνισης αδενοκαρκινωμάτων μειώθηκε κατά παρόμοιο μοτίβο? 17,4% σε αρουραίους τρέφονται μία δίαιτα ελέγχου σε σύγκριση με 4,3% το εκείνους που τρέφονται τη δίαιτα συνδυασμού, ενώ το μόνο του το πράσινο τσάι, η επίπτωση ήταν 12,5% και για το Se και μόνο η επίπτωση ήταν 8,3%. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η διατροφή συνδυασμός μείωσε την επίπτωση του αδενοκαρκινώματος κατά 65,6% σε σχέση με το πράσινο τσάι δίαιτα, και κατά 48,2% σε σχέση με Se δίαιτα, αλλά οι αριθμοί ήταν μικρά και τα αποτελέσματα δεν έφθασαν σημασία.

Η

Η δίαιτα συνδυασμός αποτρέπει ΑΟΜ επαγόμενη SS-κατενίνης πυρηνική μετατόπιση, έκφραση COX-2 και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Επιδράσεις της Se, το πράσινο τσάι και ο συνδυασμός δίαιτας για SS-κατενίνης, COX-2 και Ki-67 έκφρασης εξετάστηκαν ιστολογικά κανονική-εμφανίζεται κρύπτες από τη μελέτη ACF. Πρέπει πρώτα συνέκρινε το πρότυπο χρώσης των β-κατενίνης μεταξύ ΑΟΜ-ανεπεξέργαστων κανονική κρύπτες και ΑΟΜ που έλαβαν κρύπτες. χρώση β-κατενίνης σε κανονική κρύπτες μη επεξεργασμένων αρουραίων έδειξε χαμηλό επίπεδο χρώσης β- κατενίνης περιορίζεται σε κυτταρική μεμβράνη, με περιορισμένη πυρηνική χρώση (Σχήμα 2Α), ενώ κρύπτες από ΑΟΜ-αγωγή αρουραίους έδειξαν αυξημένη χρώση των β-κατενίνης στον πυρήνα (Σχήμα 2Β). Σύγκριση μεμβράνη β-κατενίνης και τα κύτταρα πυρηνική χρώση για τα 4 διατροφικές ομάδες παρουσιάζεται στην Εικόνα 2Β και Σχήμα 2C. Se και μόνο, πράσινο τσάι μόνο και ο συνδυασμός δεν επηρέασε το ποσοστό των κυττάρων που δείχνουν χρώση μεμβράνη θετικού β-κατενίνης. Αλλά Se μόνο (

P

& lt? 0,05) και ο συνδυασμός δίαιτα (

P

& lt? 0,01) μείωσε σημαντικά το ποσοστό των κυττάρων που παρουσιάζουν θετικό πυρηνική χρώση β-κατενίνης, σε σύγκριση με τον έλεγχο, χωρίς σημαντική διαφορά μεταξύ Se μόνο και τη δίαιτα συνδυασμού, ενώ το πράσινο τσάι από μόνο του δεν είχε μειώσει την πυρηνική χρώση β-κατενίνης. Το ποσοστό των κυττάρων που δείχνουν Ki-67 πυρηνική χρώση μειώθηκε σε ένα παρόμοιο μοτίβο με Se μόνο (

P

& lt? 0,05) και η δίαιτα συνδυασμού (

P

& lt? 0,01), το πράσινο τσάι μόνη της δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 2Β και 2D), με χαμηλό επίπεδο χρώσης Ki-67 σε ΑΟΜ-χωρίς θεραπεία κανονικό κρύπτες (Σχήμα 2Α). Συγκρίναμε επίσης τον πρότυπο χρώσης COX-2 μεταξύ ΑΟΜ-ανεπεξέργαστων κανονική κρύπτες και ΑΟΜ που έλαβαν φυσιολογικό εμφανίζονται κρύπτες. ΑΟΜ χωρίς θεραπεία αρουραίους έδειξαν ένα χαμηλό επίπεδο κυτταροπλασματική χρώση για COX-2 στο κόλον (Σχήμα 2Α), ενώ ΑΟΜ-αγωγή αρουραίους έδειξαν αυξημένη χρώση του COX-2 (Σχήμα 2Β). Βρήκαμε ότι η οι τρεις δίαιτες ανέστειλε σημαντικά την COX-2 κυτταροπλασματική χρώση (

P

& lt? 0,05), σε σύγκριση με τον έλεγχο, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των δίαιτες του πειράματος (Σχήμα 2Β και 2D)

.

Ένα αντιπροσωπευτικό τμήμα των ανοσοϊστοχημική χρώση των β-κατενίνης, Ki-67and COX-2 σε ΑΟΜ-ανεπεξέργαστων κανονική κρύπτες (Α), ΑΟΜ που έλαβαν φυσιολογικό να εμφανίζονται κρύπτες από τον έλεγχο, το πράσινο τσάι, Se και τη διατροφή συνδυασμού (Β )? δείκτης σήμανσης για β-κατενίνης (μεμβράνης και της πυρηνικής θετικών κυττάρων, που υπολογίζεται ως ο αριθμός των θετικών κυττάρων ανά στήλη κρύπτη διαιρούμενο με το συνολικό αριθμό των κυττάρων και πολλαπλασιάζεται με το 100 (n = 12) (C)? δείκτης σήμανσης για την COX-2 και Ki-67 (n = 12) (D). β-κατενίνης και πυρηνική χρώση Κί-67 μειώθηκε σημαντικά από τη διατροφή συνδυασμό και Se και μόνο, αλλά όχι το πράσινο τσάι. COX-2 κυτταροπλασματική χρώση μειώθηκε σημαντικά από το πράσινο τσάι, Se . και ο συνδυασμός δίαιτας στατιστική σημαντικότητα της διατροφικής παρέμβασης μεταξύ των ομάδων αναλύθηκε με ANOVA, τιμές με διαφορετικά εκθέτες σε κάθε στήλη ήταν στατιστικά διαφορετικές (

P

& lt? 0.05), Μπαρ:. μέση τιμή ± SEM

επόμενο σύγκρινε το πρότυπο χρώσης για β-κατενίνης μεταξύ κανονικής εμφανίζονται κρύπτες ΑΟΜ-θεραπεία και ΑΟΜ επαγόμενη όγκων. αυξημένη χρώση β-κατενίνης, ιδίως ισχυρότερη πυρηνική χρώση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε όγκους του παχέος εντέρου σε σχέση με το φυσιολογικό -appearing κρύπτες συνεπής με μετατόπιση της β-κατενίνης (Σχήμα 3Β). Καμία από τις δίαιτες επηρεάζονται σημαντικά χρώση μεμβράνης για β-κατενίνης σε φυσιολογικά εμφανιζόμενο κρύπτες από τη μελέτη του όγκου, αλλά Se δίαιτα μόνη της (

P & lt? 0,05

) και η δίαιτα συνδυασμού (

P & lt? 0,01

) έδειξε συνεπή ανασταλτικά αποτελέσματα επί της β-κατενίνης πυρηνική συσσώρευση (Σχήμα 3C). Η επίδραση της διατροφικής παρέμβασης στην έκφραση β-κατενίνης υποστηρίχθηκε περαιτέρω με ανάλυση κηλίδος Western, δείχνει συνολική β-κατενίνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε φυσιολογικά εμφανιζόμενο κρύπτες αρουραίων τροφοδοτείται ο συνδυασμός δίαιτα ή Se μόνο του (Σχήμα 3Ε και 3F).

Ένα αντιπροσωπευτικό τμήμα της ανοσοϊστοχημική χρώση β-κατενίνης, DNMT1 και Ac-Η3 στην ΑΟΜ-ανεπεξέργαστων κανονική κρύπτες (Α), ΑΟΜ που έλαβαν φυσιολογικό να εμφανίζονται κρύπτες από τον έλεγχο, το πράσινο τσάι, Se και η δίαιτα συνδυασμού (Β) και όγκους? δείκτης σήμανσης για β-κατενίνης (μεμβράνη και πυρηνική θετικά κύτταρα) (n = 12) (C) και του δείκτη επισήμανσης για DNMT1 και Ac-Η3 (n = 12) (D). Η ανάλυση στυπώματος Western των β-κατενίνης, DNMT1 και Ac-Η3 για δείγματα κόλου (n = 6) (Ε), η έκφραση της β-κατενίνης και DNMT1 ομαλοποιήθηκε με εκείνη της β-ακτίνης και την έκφραση του Ac-Η3 κανονικοποιήθηκε σε ότι του Η3, δεδομένα παρουσιάζονται ως precent ελέγχου (F). Αυξημένη ισχυρή χρώση και DNMT1 υπερέκφραση πυρηνικής β-κατενίνης εκτέθηκαν σε ΑΟΜ επαγόμενη όγκων, ενώ ασθενέστερη έκφραση Ac-Η3 σημειώθηκε σε όγκους του παχέος εντέρου. πυρηνική χρώση β-κατενίνης ήταν σημαντικά μειωμένη από την δίαιτα συνδυασμού και Se και μόνο, αλλά όχι το πράσινο τσάι? DNMT1 μειώθηκε σημαντικά από τη διατροφή συνδυασμό και πράσινο τσάι μόνο, αλλά όχι Se? πυρηνική χρώση Ac-Η3 αυξήθηκε σημαντικά με τη δίαιτα συνδυασμού και Se και μόνο, αλλά όχι το πράσινο τσάι. Η στατιστική σημαντικότητα της διατροφικής παρέμβασης μεταξύ των ομάδων αναλύθηκε με ANOVA, τιμές με διαφορετικά εκθέτες σε κάθε στήλη ήταν στατιστικά διαφορετικές (

P

& lt? 0.05), Μπαρ:. Μέση τιμή ± SEM

Η

Η δίαιτα συνδυασμός αναστέλλει την έκφραση DNMT1 και αυξημένη ιστόνης Η3 ακετυλίωση

μεθυλοτρανσφεράσες DNA DNMT και τροποποιήσεις των ιστονών παίζουν σημαντικό ρόλο στη μεθυλίωση του DNA, με υπερέκφραση DNMT1 και αποακετυλίωση ιστόνης Η3 ή Η4 αναφερθεί σε καρκίνο του παχέος εντέρου [33]. Με αυτό κατά νου εξετάσαμε την πρότυπο χρώσης των DNMT1 και Ac-Η3 σε προκαλούμενη ΑΟΜ όγκων του παχέος εντέρου, σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ΑΟΜ-φυσιολογική κρύπτες καθώς ΑΟΜ επεξεργασμένο κανονικής εμφανίζονται κρύπτες. Ισχυρή πυρηνική χρώση των DNMT1 και λιγότερο έντονη πυρηνική χρώση των Ac-Η3 παρατηρήθηκαν σε όγκους ΑΟΜ-επαγώμενη (Σχήμα 3Β)? σχέση με το φυσιολογικό κρύπτη (Σχήμα 3Α) και κανονικής εμφανίζονται κρύπτες (Σχήμα 3Β), όπου DNMT1 και AC-H3 θετικά κύτταρα που βρίσκονται κυρίως σε πολλαπλασιαστική διαμέρισμα (Εικόνα 3Β).

Για να καθοριστεί εάν DNMT1 και Ac- Η3 σε φυσιολογικά εμφανιζόμενο κρύπτες ρυθμίζονταν από Se και μόνο, πράσινο τσάι μόνο και οι δίαιτες συνδυασμού, μετρήσαμε το ποσοστό των DNMT1 και Ac-Η3 θετικά κύτταρα για τα 4 διατροφικές ομάδες (Σχήμα 3D). Σημαντική αναστολή της DNMT1 παρατηρήθηκε σε αρουραίους τρέφονται ο συνδυασμός δίαιτας και πράσινο τσάι μόνο,

P

& lt? 0,05 έναντι ελέγχου, ενώ μόνος Se δεν είχε σημαντική επίδραση στην έκφραση DNMT1. Κατά τη σύγκριση Ac-Η3 μεταξύ των διατροφικών ομάδων, ισχυρότερη επαγωγή της Ac-Η3 παρατηρήθηκε σε αρουραίους τρέφονται τη δίαιτα συνδυασμού, το Se μόνη της επίσης αυξηθεί σημαντικά Ac-Η3,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τη δίαιτα ελέγχου , αλλά το πράσινο τσάι και μόνο δεν είχε καμία επίδραση (Σχήμα 3D).