Αφηρημένο

Σε συγκεκριμένους τύπους κυττάρων όπως τα κερατινοκύτταρα, σηματοδότησης Notch παίζει σημαντικό προ-διαφοροποίηση και καταστολής όγκων λειτουργία, με κάτω-ρύθμιση του γονιδίου Notch 1 που σχετίζεται με την ανάπτυξη του καρκίνου. Εκτός ελέγχεται από p53, τίποτε άλλο είναι γνωστά σχετικά με τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης Notch 1 σε αυτό το πλαίσιο. Αναφέρουμε εδώ ότι η μεταγραφή αυτού του γονιδίου κατευθύνεται από μια-λιγότερο ΤΑΤΑ «οξεία κορυφή» προαγωγός και ότι η ελάχιστη λειτουργική περιοχή αυτού του υποκινητή, η οποία εκτείνεται από τη θέση -342 bp προς το κωδικόνιο έναρξης, είναι διαφορικά ενεργός σε κανονικά έναντι του καρκίνου κύτταρα. Αυτή η πλούσια περιοχή GC στερείται ρ53 θέσεις δέσμευσης, αλλά δεσμεύει Klf4 και SP3. Αυτό το εύρημα είναι πιθανό να είναι βιολογικής σημασίας, όπως Klf4 και, σε μικρότερο βαθμό, Sp3 τα επάνω ρυθμισμένη σε έναν αριθμό καρκινικών κυττάρων όπου η έκφραση Notch 1 είναι κάτω διαμορφωμένο, και Klf4 υπερ-έκφραση σε φυσιολογικά κύτταρα είναι επαρκής για την προς τα κάτω -modulate μεταγραφή του γονιδίου Notch 1. Η συνδυασμένη knock-down της Klf4 και Sp3 ήταν αναγκαία για την αντίστροφη επίδραση της αύξησης της μεταγραφής Notch1, σύμφωνα με τα δύο παράγοντες ασκούν μια επικαλυπτόμενη λειτουργία καταστολέα μέσω της σύνδεσης τους με τον υποκινητή Notch1

Παράθεση:. Lambertini C, Pantano S, Dotto GP (2010) Έλεγχος διαφορικού του Notch1 μεταγραφής γονιδίων από Klf4 και Sp3 Μεταγραφή παράγοντες στην Κανονική έναντι λαμβάνεται από καρκίνο κερατινοκύτταρα. PLoS ONE 5 (4): e10369. doi: 10.1371 /journal.pone.0010369

Επιμέλεια: Ιωάννα Μαρία Bridger, Πανεπιστήμιο Brunel, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 24 Νοέμβρη 2009? Αποδεκτές: 22 Μάρτη 2010? Δημοσιεύθηκε: 28, Απριλίου 2010

Copyright: © 2010 Lambertini et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Swiss, μια επιχορήγηση από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Epistem, έκτο Πρόγραμμα πλαίσιο, LSHB-CT-2005 – 019067), και ΝΙΗ επιχορηγήσεις AR39190 και AR054856 και να GPD Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σηματοδότηση Notch παίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του προσδιορισμού κυτταρικής τύχης, ανάπτυξη και διαφοροποίηση [1], [2]. Είναι επίσης ένας καθοριστικός παράγοντας της καρκινογένεσης, είτε με ένα θετικό ή αρνητικό ρόλο ανάλογα με τον τύπο κυττάρου και συγκεκριμένο πλαίσιο [3], [4]. Το καλύτερο που χαρακτηρίζεται «κανονική» μονοπάτι της ενεργοποίησης Notch περιλαμβάνει την πρωτεολυτική διάσπαση και μετατόπιση της κυτταροπλασματικής περιοχής του υποδοχέα προς τον πυρήνα, όπου συνδέεται με την πρόσδεση DNA πρωτεΐνη CSL μετατρέποντάς το από ένα καταστολέα σε έναν ενεργοποιητή της μεταγραφής [1], [ ,,,0],2]. Οι περισσότεροι προσοχή έχει δοθεί στον έλεγχο του μονοπατιού Notch στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο, συμπεριλαμβανομένης της επεξεργασίας και την ωρίμανση των υποδοχέων Notch, ενεργοποίηση από συνδέτες στην επιφάνεια του κυττάρου, και τροποποίηση πρωτεϊνών και την υποβάθμιση [1], [2]. Ωστόσο, μια κύρια μορφή της ρύθμισης μπορεί επίσης να είναι στο επίπεδο της γονιδιακής μεταγραφής. Η έκφραση των τεσσάρων γονιδίων υποδοχέα Notch και τους συνδέτες τους ρυθμίζεται σε συγκεκριμένα κυτταρικά πλαίσια και μπορεί να μεταβληθεί στην ανάπτυξη καρκίνου [3], [5]. Επιπλέον, η ενεργοποίηση ενός υποδοχέα είναι επιδεκτική των ιδίων έκφρασης του, καθώς και από άλλα μέλη της οικογένειας, και μπορούν επίσης να επηρεάσουν, με θετικό ή αρνητικό τρόπο, επί της έκφρασης συνδέτη [1], [2].

ένα παράδειγμα αυτού του συμπλόκου τρόπου ρύθμισης της έκφρασης του Notch έχει παρασχεθεί από μελέτες σε κερατινοκύτταρα, όπου αυτή η οδός παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην προώθηση της διαφοροποίησης και την καταστολή της ογκογένεσης [3]. Στην βασική στιβάδα της επιδερμίδας, των αμοιβαίων αρνητική ρύθμιση μεταξύ συνδετών της οικογένειας Delta και Notch υποδοχέων έχει προταθεί για τον έλεγχο της ισορροπίας μεταξύ των πληθυσμών των βλαστοκυττάρων υποθετικών κερατινοκυττάρων και τα κύτταρα δεσμεύτηκε να διαφοροποίηση [6]. Από την άλλη πλευρά, η θετική ρύθμιση ανάδρασης μεταξύ υποδοχείς Notch και συνδετήρες της οικογένειας Jagged έχει ενοχοποιηθεί ως πιθανός μηχανισμός για το συγχρονισμό της μετάβασης κερατινοκυττάρων από την βασική πολλαπλασιαζόμενα να υπερβασικά διαφοροποίηση στρώματα της επιδερμίδας [7]. Ενώ και οι δύο Notch 1 και Notch2 υποδοχείς που εκφράζονται στα ενδοφολιδωτά επιδερμίδα, η ρύθμιση και η λειτουργία τους είναι μόνο εν μέρει επικαλυπτόμενες. Συγκεκριμένα, ενώ τα επίπεδα Notch2 είναι ομοιόμορφα αυξημένα στα διαφοροποίηση στρώματα της επιδερμίδας, η έκφραση του Notch1 κλείνει στις εξόχως απόκεντρες στρώματα [7]. Αυτό μπορεί να έχει λειτουργική σημασία, δεδομένου ότι αυξημένα Notch1 δραστηριότητα, ενώ απαιτείται για τη δέσμευση και την έναρξη της διαφοροποίησης, μπορεί στη συνέχεια να καταστείλει τις τελευταίες βήματα αυτής της διαδικασίας [7], [8]. Ομοίως, σε όγκους κερατινοκύτταρα που προέρχονται, όπως δερματικό ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (κλώνοι ενός κυττάρου), καρκινωμάτων των βασικών κυττάρων (BCCs) [9], [10] και την όψιμη φάση του τραχήλου της μήτρας καρκινώματα [11], η έκφραση Notch 1 μειώνεται σε σημαντικά μεγαλύτερο βαθμό από ό, Notch2 . Αυτό είναι πιθανό λειτουργικής σημασίας, όπως, ακόμα και με την παρουσία του Notch2, διαγραφή του γονιδίου Notch 1 είναι από μόνη της αρκετή για να προωθήσει την ανάπτυξη των κερατινοκυττάρων όγκου [9], [11], [12].

Εκπληκτικά λίγα είναι γνωρίζουμε σχετικά με τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης Notch 1. Σε κερατινοκύτταρα, ενδογενές ρ53 δεσμεύεται στον προαγωγό Notch 1, αυξάνοντας την μεταγραφή του, και διακυβεύεται η λειτουργία ρ53 μπορεί να εξηγήσει, τουλάχιστον εν μέρει, την σχετιζόμενο με όγκο κάτω διαμόρφωση της έκφρασης Notch 1 [9], [13], [14]. Ομοίως, μειωμένα επίπεδα p53 μέσω ιικών Ε6-εξαρτώμενη αποδόμηση μπορεί να εξηγήσει το έχει ήδη αναφερθεί τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Notch 1 σε κύτταρα HPV-θετικών τραχηλικό καρκίνωμα [14]. Ο έλεγχος της έκφρασης Notch 1 από p53 είναι επίσης ενδιαφέρον για την αντιμετώπιση των κερατινοκυττάρων σε υπεριώδες φως, ένα σημαντικό αιτιολογικό παράγοντα της γήρανσης του δέρματος και του καρκίνου [13], [14]. Εκτός κερατινοκύτταρα, και κακοήθη αντίστοιχά τους, η έκφραση Notch 1 είναι υπό θετικό έλεγχο ρ53 στον πνεύμονα και κύτταρα καρκίνου του προστάτη, άλλους τύπους κυττάρων στους οποίους αυξημένη Notch σηματοδότηση προκαλεί καταστολή της ανάπτυξης [15], καθώς και σε χρόνια λεμφοκυτταρική κύτταρα λευχαιμίας Β-κυττάρων, όπου σηματοδότηση Notch ενισχύει κυτταρική επιβίωση [16]. Σε πολλές από αυτές τις περιπτώσεις, ρ53 βρέθηκε να εμπλέκεται ειδικά στον έλεγχο του γονιδίου Notch 1 με μικρή ή καθόλου επιδράσεις σε άλλα μέλη της οικογένειας [9], [14], [15]. Είναι ενδιαφέρον, καμία τέτοια ρύθμιση βρέθηκε σε κύτταρα καρκινώματος παχέως εντέρου, παρά πρόσδεση του ρ53 με τον προαγωγέα Notch 1 ακόμη και σε αυτά τα κύτταρα, που δείχνουν προς την πιθανή αλληλεπίδραση μεταξύ ρ53 και άλλων, ακόμη μη καθοριστικούς παράγοντες της μεταγραφής του γονιδίου Notch 1 [9].

Η οικογένεια Sp /KLF των παραγόντων μεταγραφής αποτελείται από πρωτεΐνες με τρεις εξαιρετικά διατηρημένες περιοχές δακτύλου ψευδαργύρου δέσμευσης DNA, τα οποία αναγνωρίζουν GC /κουτιά CACCC απαντάται σε πολλά πλούσια σε GC υποκινητές [17]. Αυτοί οι παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο στην μεταγραφή των γονιδίων housekeeping καθώς και γονίδια με πιο περιορισμένο συγκεκριμένες λειτουργίες κυτταρικό τύπο [18]. Μεταξύ των μελών της οικογένειας KLF, Klf4 έχει προσελκύσει τα τελευταία προσοχή λόγω της ικανότητάς του, σε συνεννόηση με άλλους παράγοντες, για να επαναπρογραμματίσει τον καθορισμό της κυτταρικής τύχης [19], καθώς και την προώθηση ή την καταστολή της ανάπτυξης καρκίνου σε ένα πλαίσιο εξαρτώμενο τρόπο [20]. Αναφέρουμε εδώ ότι σε κερατινοκύτταρα Klf4 δεσμεύεται στον προαγωγό Notch 1 και, μαζί με SP3, λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής της γονιδιακής μεταγραφής Notch 1, που επηρεάζουν την πρόσληψη του συμπλόκου PolII προέναρξης μέσω ενός ξεχωριστό μηχανισμό από ρ53. Αναστολή της έκφρασης Notch 1 από Klf4 είναι συνεπής με τον ουσιαστικό ρόλο των Klf4 στα τελευταία στάδια της διαφοροποίησης των κερατινοκυττάρων [21], για την οποία πρέπει να απενεργοποιηθεί [7] έκφραση του γονιδίου Notch 1. Ωστόσο, το ίδιο ρυθμιστικό μηχανισμό μπορεί επίσης να συμβάλει στην κάτω-ρύθμιση της έκφρασης Notch 1 σε όγκους κερατινοκύτταρα, όπου Klf4 μπορεί να είναι παρεκκλίνοντα υπερ-εκφράζεται.

Αποτελέσματα

1. Η μεταγραφή του γονιδίου Notch 1 από μια «απότομη κορυφή» ΤΑΤΑ λιγότερο υποστηρικτής

Εκτός από τη συμμετοχή της p53 [9], [13], [14], [22], λίγα είναι γνωστά σχετικά με τον έλεγχο της μεταγραφής του γονιδίου Notch 1 . Το ανθρώπινο γονίδιο Notch 1 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9 και διαρθρώνεται σε 34 εξώνια, τα οποία κωδικοποιούν μία μεγάλη πρωτεΐνη των περίπου 270 kDa. Για περαιτέρω πληροφορίες σε μεταγραφικό έλεγχο αυτού του γονιδίου, συγκρίναμε ανάντι μη-κωδικοποιητική αλληλουχία του στην ανθρώπινη έναντι γονιδιωμάτων ποντικού. Αρκετές θέσεις πρόσδεσης προβλεφθεί ρ53 είναι παρούσες στα 3,0 kb ανάντη αλληλουχία του ποντικού και ανθρώπου υποκινητές Notch 1 αν και σε διαφορετικές θέσεις σε σχέση με το κωδικόνιο έναρξης (Εικ. 1Α). Μία κλίση αυξανόμενων ομολογία αλληλουχίας ευρέθη προς τα κωδικόνια του ανθρώπου και την έναρξη ποντίκι, με & gt? 70% ταυτότητα αλληλουχίας στο πεδίο πλούσια σε GC από τη θέση -500 bp προς το ATG. Ανάλυση νουκλεοτιδίων περαιτέρω μυτερό σε μια πιθανή θέση TFIID δεσμευτική γύρω από τη θέση -230 bp που περιβάλλεται από άπω ​​βασικά στοιχεία, ενώ δεν κουτιά ΤΑΤΑ μπορεί να αναγνωριστεί (με τη χρήση των προγραμμάτων TESS, Consite ή Genomatix? www.cbil.upenn.edu/cgi-bin /Tess /Tess? asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite?. www.genomatix.de) (Εικόνα 1Β)

(Α) Νουκλεοτιδική σύγκριση αλληλουχία του 3.0. kb ανάντη περιοχή του ανθρώπινου και γονίδια ποντικού Notch 1, με την αύξηση της ομολογίας προς την κωδικεύουσα περιοχή που απεικονίζεται με ένα γκρι κλίση ένταση. Η θέση του υποθετικές θέσεις p53-δέσμευσης, όπως προβλέπεται από ένα πρόγραμμα βιοπληροφορικής (MatInspector, https://www.genomatix.de) υποδεικνύεται, σε σχέση με το κωδικόνιο έναρξης. Οι θέσεις p53-δεσμευτικές «κανονικό» που αποτελείται από δύο ημι-θέσεις με την αλληλουχία νουκλεοτιδίων RRRCA /T-T /AGYYY (με R = πουρίνη? και Υ = πυριμιδίνη), χωρίζονται από ένα διαχωριστικό από 0-21 νουκλεοτίδια. Τρίμηνο-sites (RRRCW και WGYYY) μπορεί να υπάρχει σε ένα κεφάλι με κεφάλι ή το κεφάλι μέχρι την ουρά προσανατολισμό, όπως υποδεικνύεται από τα βέλη (→ ή ←). Οι αριθμοί πάνω και κάτω αναφέρονται στο σκορ ταίριασμα μεταξύ της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του κάθε τόπου και την προβλεπόμενη μήτρα, με ένα τέλειο ταίρι = 1.00, και ένα «καλό» αγώνα & gt? 0,80. (Β) Βασικά στοιχεία υποκινητή του ανθρώπινου γονιδίου Notch 1 με ένδειξη της εγγύς περιοχής πλούσια σε GC, θεωρούμενη θέση TFIID δεσμευτικές και άπω βασικά στοιχεία (DCE) [53] (όπως προσδιορίζονται από το πρόγραμμα TESS) και θέσεις έναρξης της μεταγραφής Notch 1 ( TSS). (C) Πειραματικός προσδιορισμός της Notch 1 TSS από 5 ‘RACE. Ανθρώπινα πρωτογενή κερατινοκύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή του ολικού RNA για ενίσχυση 5 ‘RACE με τη χρήση GeneRacer και ένα ειδικό αντίστροφο έναυσμα που βρίσκεται στο 242 bp από το κωδικόνιο έναρξης. Κλωνοποίηση και αλληλούχιση του προϊόντος αντίδρασης ενίσχυσης (όπως φαίνεται μετά από ηλεκτροφόρηση πηκτής) έδειξε ένα μείζον TSS στη θέση -262 και μία δεύτερη θέση στο -259. Η σειρά των επικαλυπτόμενων στοιχείων εκκινητή (Py Py Α (1) ΝΤ (3) Py Py), σε περίπτωση που TCA μας (1) CT (3) AG για το μεγαλύτερο TSS, και CTA (1) GT ( 3) GC για το δεύτερο TSS, υποδεικνύεται με έντονους χαρακτήρες, ενώ τα πρώτα νουκλεοτίδια των δύο TSS είναι σε πλάγια γραφή.

η

για να διαπιστωθεί πειραματικά η θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) της μεταγραφής του Notch 1 στο πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (HKC), μπορούμε κλωνοποιηθεί και αλληλουχηθεί τα προϊόντα της 5′-RACE (ταχεία ενίσχυση των 5 ‘συμπληρωματικού DNA άκρα) αντίδρασης από αυτά τα κύτταρα (Σχ. 1 C). Τα αποτελέσματα έδειξε ένα κύριο TSS του ανθρώπινου Notch 1 γονίδιο στη θέση -262 bp από το ATG, με ένα δεύτερο ανήλικο TSS σε -259 bp. Έτσι, η μεταγραφή του γονιδίου Notch 1 οδηγείται από ένα νησί υποκινητή CpG, η οποία, σε αντίθεση με τους περισσότερους φορείς αυτής της κατηγορίας [23], έχει τα χαρακτηριστικά ενός υποκινητή «οξεία κορυφή», με ακριβείς TSSs πιθανώς προσδιορίζεται από ένα επικαλυπτόμενο εκκινητή (INR) στοιχείο [24].

2. Χαρτογράφηση της περιοχής του υποκινητή λειτουργική Notch1 στη φυσιολογική έκφραση του mRNA έναντι καρκινικών κυττάρων

μπορεί να ελέγχεται σε πολλαπλά επίπεδα, από τα πρώτα βήματα της μεταγραφής (έναρξη /επιμήκυνση) με την επεξεργασία και τη σταθερότητα [25] RNA. Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR με εκκινητές ειδικούς για την 5 ‘και 3’ περιοχές του μεταγραφήματος Notch 1 και πρώτο ιντρόνιο έδειξε ότι η υψηλότερη έκφραση του Notch 1 mRNA που αναφέρθηκαν προηγουμένως σε HKC έναντι κερατινοκύτταρα που προέρχονται καρκινικά κύτταρα [9], [11] ήταν διατηρείται ανεξάρτητα από τις συγκεκριμένες περιοχές της απομαγνητοφώνησης Notch1 που αναλύθηκαν (Σχ. 2).

(Α) Οργάνωση του γονιδίου Notch 1, με ένδειξη του ανοικτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) με κωδικοποίηση εξώνια και παρεμβαίνει εσώνια (μαύρο παχύ κουτιά και τις γραμμές, αντίστοιχα) και 5 ‘και 3’ αμετάφραστες περιοχές (UTR). Η θέση των διαφορετικών συνόλων εκκινητών που χρησιμοποιούνται για πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση αναφέρεται επίσης (λεπτή βέλη). (Β) Ολικό RNA από πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (HKC), κύτταρα κολπικού καρκινώματος (HeLa, Caski και SiHa), και δέρματος (SCC13) και από του στόματος πλακώδη κύτταρα καρκινώματος (SCCO28) αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR με εκκινητές που αντιστοιχούν σε διαφορετική περιοχή του γονιδίου Notch 1 όπως αναφέρεται στο (Α). Γι ‘αυτό και όλα τα άλλα σχήματα, οι τιμές ομαλοποιήθηκαν προς 36Β4 ή /και τα επίπεδα 18S RNA, και εκφράζεται ως σχέση με εκείνες των πρωτογενών κερατινοκυττάρων.

Η

Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η μεταγραφή του γονιδίου Notch 1 είναι διαφορικά ελεγχόμενη σε κανονικά έναντι καρκινικών κυττάρων που έχουν ήδη στα αρχικά στάδια της μεταγραφής. Για να δοκιμαστεί περαιτέρω αυτή η πιθανότητα, προσδιορίσαμε την ελάχιστη λειτουργική περιοχή του υποκινητή Notch 1 και αξιολόγησε κατά πόσο αυτή περιοχή είναι διαφορικά ενεργός σε κανονικά έναντι καρκινικών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, η περιοχή 2.4 kb του προαγωγού Notch 1 ανοδικά του κωδικονίου έναρξης κλωνοποιήθηκε σε ένα ανταποκριτή λουσιφεράσης, που ακολουθείται από δοκιμασίες δραστηριότητας προαγωγέα σε HKCs έναντι κύτταρα HeLa. Δοκιμές μία σειρά θραυσμάτων με προοδευτικά μειωμένο μήκος από το 5 ‘άκρο έδειξαν ότι μια περιοχή 342 bp από το κωδικόνιο έναρξης διατηρεί πλήρη δραστικότητα προαγωγού σε HKCs, ενώ περαιτέρω βράχυνση του υποκινητή Notch 1 για να -315 bp και -300 bp περιοχές κατέληξαν σε προοδευτικά μειωμένη δραστηριότητα (Εικ. 3Α). περιφέρειες Notch 1 προαγωγέα με πλήρη δραστηριότητα σε HKCs ήταν σημαντικά λιγότερο δραστικό σε κύτταρα HeLa, αντανακλώντας τις διαφορές στην ενδογενή μεταγραφή Notch 1 γονιδίου, ενώ η διαφορά στην δραστηριότητα προαγωγέα έγινε λιγότερο με βραχύτερα θραύσματα Notch 1 προαγωγέα (Σχ. 3Α).

(Α) διαφορετικά θραύσματα του προαγωγέα ανθρώπινης Notch 1 με μειούμενη 5 ‘άκρα κλωνοποιήθηκαν σε ένα πλασμίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης, που ακολουθείται από παροδική επιμόλυνση σε πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα και τα κύτταρα HeLa (μαύρο και γκρι μπάρες, αντίστοιχα) μαζί με ένα Renilla ελάχιστη ρεπόρτερ για ομαλοποίηση . δραστικότητα υποστηρικτής μετρήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. δραστηριότητα σχετική υποστηρικτής των διαφόρων δημοσιογράφους στο HKC έναντι HeLa επίσης υπολογίστηκε (δεξιά πίνακας). (Β) θραύσματα του ανθρώπινου Notch 1 προαγωγέα με μερική ή ολική διαγραφή της αλληλουχίας από το TSS στο κωδικόνιο έναρξης (που στερείται τα νουκλεοτίδια -159 έως -1 και -262 έως -1, αντίστοιχα) κλωνοποιήθηκαν σε ένα πλασμίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης, ακολουθούμενη από προσδιορισμούς παροδικής ενεργότητα επιμόλυνσης /υποκινητή σε πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα και κύτταρα HeLa όπως στην προηγούμενη οθόνη. δραστηριότητα σχετική υποκινητή σε HKC έναντι HeLa υπολογίστηκε επίσης. (C) Ολικό RNA από πρωτογενή κερατινοκύτταρα και διάφορες γραμμές καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των PC3, Caski, και HeLa από δύο διαφορετικές πηγές (HeLa # 1 και 2), χρησιμοποιήθηκε για ενίσχυση RT-PCR της περιοχής 5 ‘UTR του Notch 1 γονίδιο (αστάρι θέση -262 /-174). Σημειώστε την ταχύτερη μεταναστευτική ζώνη που λαμβάνεται με τα δείγματα HeLa. Κλωνοποίηση και αλληλούχιση του επικαλυπτόμενη περιοχή γονιδιώματος (από τη θέση -392 bp έως -1 του υποκινητή Notch 1) έδειξε μια διαγραφή από τη θέση -215 έως -202 σε κύτταρα HeLa. (D) Η ίδια γονιδιωματική περιοχή Notch 1 συν /μείον την ανωτέρω διαγραφή κλωνοποιήθηκε σε ένα πλασμίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης, που ακολουθείται από δοκιμασίες δραστηριότητας προαγωγέα σε HKC έναντι κύτταρα HeLa, μετρούμενη όπως στο (Α) και (Β).

Η

οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες προς τα κάτω του θέσεις έναρξης μεταγραφής (TSS) παίζουν επίσης έναν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της δραστηριότητας προαγωγού, που απαιτούνται για το σχηματισμό των συμπλοκών μεταγραφής προ-εκκίνηση και έναρξη [26]. Συνεπής με τη σημασία αυτής της περιοχής, η δραστικότητα προαγωγέα ουσιαστικά μειώνεται όταν η αλληλουχία του υποκινητή Notch 1 κατάντη του TSS στο κωδικόνιο έναρξης (από -262 έως -1) διαγράφηκε μερικώς ή ολικώς (με υποκινητή κατασκευάσματα που στερείται τα νουκλεοτίδια -159 έως -1, και -262 στην τιμή -1 αντίστοιχα) (Σχ. 3Β). Ακόμη και σε αυτή την περίπτωση, εγγενώς μειωμένη δραστηριότητα υποκινητή συνοδεύτηκε από μια μικρότερη διαφορά μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων (Σχ. 3Β).

ενίσχυση PCR του γονιδιωματικού DNA, με στόχο την αξιολόγηση της κατάστασης μεθυλίωσης του, όπως φαίνεται πιο κάτω, αποκάλυψε η ύπαρξη ενός μικρού διαγραφή στην περιοχή του υποκινητή του Notch 1 δύο διαφορετικά στελέχη κυττάρων HeLa, τα οποία δεν ήταν παρούσα σε άλλα καρκινικά κύτταρα, όπως PC3 και Caski (Σχ. 3C). Με κλωνοποίηση και αλληλούχιση αυτή την περιοχή, έχουμε χαρτογραφηθεί τη διαγραφή στη θέση -215 έως -202 bp, ακριβώς κατάντη του TSS. Λειτουργικές δοκιμασίες δραστικότητας προαγωγέα του κλωνοποιημένου προαγωγέα περιοχή προαγωγού σε HKC έναντι κύτταρα HeLa έδειξε ότι αυτή η διαγραφή 10 νουκλεοτιδίων δεν επηρέασε προαγωγού δραστηριότητα ούτε απόκλιση ρύθμιση του σε φυσιολογικά έναντι καρκινικών κυττάρων (Σχ. 3D).

3. Αρνητικό έλεγχο της μεταγραφής του γονιδίου Notch 1 από Klf4 και Sp3

Η δραστηριότητα μεταγραφή διαφορικό του GC-πλούσιο εγγύς περιοχή του υποκινητή Notch 1 μπορεί να συνδέεται με μια διαφορετική κατάσταση μεθυλίωσης σε HKCs έναντι κύτταρα HeLa. Τραβήξτε προς τα κάτω προσδιορισμοί με αντισώματα έναντι μεθυλιωμένο DNA που ακολουθείται από PCR ενίσχυση έδειξε ένα σημαντικό επίπεδο μεθυλίωσης της πρώτης ιντρονική περιοχή (μεταξύ των νουκλεοτιδίων + 1168 /+ 1798) σε κύτταρα Hela αλλά όχι σε HKCs, η οποία θα μπορούσε να συμβάλει σε διαφορετικές μεταγραφή του Notch 1 γονίδιο (Εικ. 4Α). Ωστόσο, καμία ανιχνεύσιμη μεθυλίωση βρέθηκε στην περιοχή του υποκινητή Notch 1 που μπορεί να ευθύνεται για τα διαφορετικά επίπεδα της δραστηριότητας των δύο κυττάρων. Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι η δραστικότητα προαγωγέα Notch 1 απόκλιση είναι συνδεδεμένο με τους παράγοντες μεταγραφής που προσδένονται σε αυτή την περιοχή και να ελέγχει τη δράση του. παράγοντες μεταγραφής με την υψηλότερη πιθανότητα να συνδέεται με πλούσια σε GC περιοχές, όπως εκείνος που υπάρχουν στον υποκινητή εγγύς περιοχή Notch 1 είναι πρωτεΐνες ψευδαργύρου-δακτύλου των οικογενειών Sp- και KLF [27]. Ένα ή περισσότερα από αυτούς τους παράγοντες μπορεί να εκφράζονται διαφορικά σε κανονικά έναντι καρκινικών κυττάρων. Στην πραγματικότητα, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR του HKCs έναντι ενός πάνελ καρκινώματος του τραχήλου και SCC κερατινοκυττάρων προερχόμενα έδειξε ότι, από τα διάφορα μέλη της οικογένειας Sp /KLF που εξετάστηκαν, Klf4 ήταν έντονα και σταθερά επάνω ρυθμισμένη σε καρκινικά κύτταρα (Σχ . 4Β). Sp1 και Sp3 ήταν επίσης πάνω ρυθμισμένα σε αυτά τα κύτταρα, αν και σε μικρότερο βαθμό από ό, τι Klf4, ενώ η έκφραση άλλων μελών της οικογένειας, όπως KLF5, ή KLF10a επηρεάστηκε ελαφρά μόνο και /ή προς τα κάτω-διαμορφωμένο (Εικ. 4Β). Λιγότερο παρατηρήθηκαν διαφορές στο επίπεδο πρωτεΐνης, πιθανώς ως αποτέλεσμα της μετα-μεταγραφικής και /ή πρωτεΐνη εκδηλώσεις αποσταθεροποίηση (Εικ. 4C).

(Α) πυρηνικά εκχυλίσματα από πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (HKC) και κύτταρα HeLa ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντισώματα έναντι μεθυλιωμένο DNA, που ακολουθείται από ανάλυση PCR του καταβυθισμένου DNA με εκκινητές ειδικούς για τις υποδεικνυόμενες περιοχές του προαγωγού Notch 1 και του πρώτου ιντρονικές περιοχή. PCR με εκκινητές ειδικούς για μεθυλιωμένο ένα γνωστό γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. (Β) Το συνολικό RNA δείγματα από πρωτογενή ανθρώπινα κερατινοκύτταρα (HKC) και τις υποδεικνυόμενες κυτταρικές γραμμές καρκίνου αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR με εκκινητές ειδικούς για Sp1, SP3, Klf4, KLF5 και KLF10a. (C) Πρωτογενής κερατινοκύτταρα, HeLa και SCC13 κύτταρα αναλύθηκαν με ανοσοστύπωση με αντισώματα έναντι Sp1, Sp3 και Klf4, με β-ακτίνη ως ισότιμο έλεγχο φόρτωσης.

Η

Για να εκτιμήσει τις λειτουργικές συνέπειες της αυξημένης έκφρασης Klf4 για Notch1 μεταγραφή, δύο συμπληρωματικές προσεγγίσεις έγιναν. Στην πρώτη, HKCs επιμολύνθηκαν παροδικά με ένα ρεπόρτερ Notch 1? δράση υποκινητή καταστάλθηκε από την ταυτόχρονη επιμόλυνση με ένα φορέα έκφρασης Klf4 (Εικ. 5Α). Ως δεύτερη προσέγγιση, HKC μολύνθηκαν με Klf4 εκφράζουν ρετροϊό. Πραγματικού χρόνου RT-PCR, καθώς και ανάλυση ανοσοστυπώματος έδειξε ότι η ενδογενής Notch 1 έκφρασης ήταν σημαντικά μειωμένη σε αυτά τα κύτταρα ως συνέπεια της Klf4 υπερ-έκφραση (Σχ. 5Β, C).

(Α) Πρωτογενής κερατινοκύτταρα συν -επιμολυσμένα με ένα ρεπόρτερ που περιέχει τον ελάχιστο λειτουργικό προαγωγό Notch 1 (από -392pGL4) μαζί με ένα φορέα έκφρασης για την ανθρώπινη Klf4 ή κενό φορέα ελέγχου. Renilla ελάχιστη ανταποκριτής χρησιμοποιήθηκε για εσωτερική ομαλοποίηση και η δραστικότητα προαγωγού μετρήθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Δεικνύονται τα αποτελέσματα δύο διαφορετικών πειραμάτων. (Β) Πρωτογενή κερατινοκύτταρα μολύνθηκαν με ρετροϊικό φορέα που εκφράζει KlfF4 (pMSKlf4) ή κενό φορέα ελέγχου και συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες, που ακολουθείται από προσδιορισμό της έκφρασης Klf4 και Notch 1 mRNA με πραγματικού χρόνου PCR. Αποτελεσματικότητα της λοίμωξης με τον ιό pMSKlf4 εκτιμήθηκε επίσης από τις εκτεταμένες μορφολογικές αλλαγές με επιπέδωσης των κυττάρων (άνω πλαίσια). (C) Πρωτογενής κερατινοκύτταρα μολύνθηκαν με ένα KlfF4 εκφράζουν ρετροϊό έναντι ενός κενού ελέγχου φορέα όπως και στην προηγούμενη πάνελ, που ακολουθείται από ανάλυση ανοσοστυπώματος με αντισώματα έναντι Notch 1, Klf4 και γ-τουμπουλίνης ως ισότιμο έλεγχο φόρτωσης. Δεξιό πλαίσιο: δεδομένα ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρική σάρωση του αυτοραδιογραφήματος και εκφράζεται ως αυθαίρετες μονάδες μετά από κανονικοποίηση για έκφραση γ-τουμπουλίνης. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ένα δεύτερο ανεξάρτητο πείραμα.

Η

Αντίθετα, για να ελεγχθεί αν η καταστολή Klf4 οδηγεί σε Notch 1 πάνω ρύθμιση, HKC καθώς και κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με τα siRNA για Klf4. Αποτελεσματική κάτω διαμόρφωση αυτού του γονιδίου δεν είχε επιπτώσεις στην γονιδιακή μεταγραφή Notch 1, και παρόμοια έλλειψη αποτελεσμάτων παρατηρήθηκε μετά από knock-down του Sp3 και Sp1 (Σχ. 6Α και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, η συνδυασμένη siRNA μεσολάβηση knockdown του Klf4 και Sp3 οδήγησε σε συνεπή προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης Notch 1 και στα δύο HKCs και καρκινικά κύτταρα (HeLa και SCC13 κύτταρα), με την ταυτόχρονη knock-down του Sp1 που δεν έχει επιπλέον αποτελέσματα (Σχ. 6Β , Γ και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Πρωτογενή κερατινοκύτταρα επιμολύνθηκαν με δύο σύνολα siRNAs για Klf4, Sp1 ή Sp3 παράλληλα με περιπλεγμένο ελέγχους siRNA για 48 ώρες, ακολουθούμενη από ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων στοχοθετημένων σε πραγματικό χρόνο RT-PCR και ανοσοστύπωμα (αριστερά και μεσαία πάνελ, αντιστοίχως) Τα ίδια δείγματα RNA αναλύθηκαν επίσης για επίπεδα έκφρασης Notch 1 (δεξί πάνελ). (Β) την πρωτογενή κερατινοκύτταρα, επιμολύνθηκαν όπως και στην προηγούμενη πίνακα με δύο διαφορετικά σύνολα siRNAs για Klf4 και Sp3 (siRNA-1, siRNA-2) (αριστερά στήλες) ή με siRNAs για Klf4, Sp1 και Sp3 (δεξιά στήλες), ακολουθούμενη από πραγματικού χρόνου RT-PCR ανάλυση της έκφρασης Notch 1. Ορατή είναι η υπολογισμένη μέσος όρος τεσσάρων διαφορετικών πειραμάτων χρησιμοποιώντας 36β4 και 18S RNA για εσωτερική ομαλοποίηση. (Γ) HeLa και SCC13 κύτταρα επιμολύνθηκαν με δύο διαφορετικά σύνολα siRNAs για Klf4 και Sp3 (siRNA-1, siRNA-2) που ακολουθείται από προσδιορισμό της έκφρασης Notch 1 με πραγματικού χρόνου RT-PCR όπως και στην προηγούμενη οθόνη. Πρωτογενή κερατινοκύτταρα και τα κύτταρα SCC13 επιμολύνθηκαν με τα siRNA κατά τα υποδεικνυόμενα γονίδια που ακολουθείται από ανάλυση ανοσοστυπώματος έκφρασης πρωτεΐνης Notch 1 με γ-τουμπουλίνης ως ισότιμο έλεγχο φόρτωσης. Δεξιό πλαίσιο: δεδομένα ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρική σάρωση του αυτοραδιογραφήματος και εκφράζεται ως αυθαίρετες μονάδες μετά από κανονικοποίηση για έκφραση γ-τουμπουλίνης

Η

Η απαιτούμενη συνδυασμένη knockdown του Klf4 και SP3 για αυξητική ρύθμιση της έκφρασης Notch 1 μπορεί. να εξηγηθεί από την πρόσδεση των παραγόντων αυτών με τον προαγωγέα Notch 1 ταυτόχρονη. Στην πραγματικότητα, χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασίες έδειξαν, σε κύτταρα HeLa και HKCs, ότι τόσο Klf4 και Sp3 δεσμεύοντας την πλούσια σε GC εγγύς περιοχή του Notch 1 προαγωγέα (Σχ. 7Α-D). Είναι ενδιαφέρον, στην HKCs, Sp1 βρέθηκε επίσης να συνδέεται προς αυτή την περιοχή, αλλά σε πολύ μικρότερο βαθμό από ό, τι στην εγγύς περιοχή του προαγωγέα p21WAF1 /Cip1, μια καθιερωμένη στόχος Sp1 [28]. Αριθ σύνδεση με τον υποκινητή Notch 1 Sp1 βρέθηκε σε κύτταρα HeLa (Σχ. 7Β). Παρόμοιες δοκιμασίες Chip πραγματοποιήθηκαν επίσης με αντισώματα κατά ενός άσχετο παράγοντα μεταγραφής GC-δεσμευτική, Maz [29]. Ενώ Maz1 βρέθηκε να συνδέεται με τον προαγωγό ρ21 παρόμοια με Sp1, Sp3 και Klf4, υπήρχε μικρή ή καθόλου δέσμευση της πρωτεΐνης αυτής στο εγγύς περιοχή του προαγωγέα Notch 1 (Σχ. 7Β, C).

( α) προβλεπόμενη θέσεις πρόσδεσης Klf4- και Sp1 /Sp3 στην περιοχή του υποκινητή της -340 /-300 bp Notch 1. Παρίσταται η αλληλουχία νουκλεοτιδίων αυτής της περιοχής με, στην κορυφή, οι προβλεπόμενες θέσεις σύνδεσης για Klf4- και Sp1 /SP3. (Β και C) Πρωτογενής κερατινοκύτταρα (HKC) και κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρωματίνη ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) ανάλυση με αντισώματα έναντι Sp1, Sp3 (Β), Klf4 (C) ή Maz, όπως υποδεικνύεται, ακολουθούμενες από ενίσχυση δύο περιοχών Notch 1 προαγωγού που βρίσκεται μεταξύ bp -740 /-262 (Chip 1) και περίπου -6600 bp (Chip 2), οι οποίες περιέχουν και την έλλειψη, αντίστοιχα, υποθετικών /Sp3 και Klf4 θέσεις δέσμευσης Sp1. Ενίσχυση της περιοχής εγγύς υποκινητή του p21

WAF1 /Cip1 γονίδιο (Chip p21) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Un-καθιζάνουν προετοιμασίες χρωματίνης χρησιμοποιήθηκαν για αντιδράσεις παράλληλη ενίσχυση ως έλεγχοι DNA »εισόδου». δοκιμασίες (D) Chip με αντι-Sp3 και Klf4 αντισώματα και μη άνοση IgGs όπως στα προηγούμενα πάνελ ακολούθησε πραγματικό χρόνο PCR ενίσχυση του region1 του προαγωγέα Notch 1. Η ποσότητα του καθιζάνει DNA υπολογίστηκε σε σχέση με το συνολικό χρωματίνη εισόδου και εκφράζεται ως ποσοστό του συνολικού σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο [54]: ποσοστό συνολικής = 2ΔCt × 5, όπου ΔCt = Ct (είσοδος) – Ct (ανοσοκαταβύθιση), και Ct είναι το όριο του κύκλου.

η

4. Απέναντι από τον έλεγχο του Notch1 μεταγραφή από ρ53 έναντι Klf4 /Sp3

Ένα σημαντικό ερώτημα είναι αν p53 και ελέγχου Klf4 /Sp3 μεταγραφή του γονιδίου Notch 1 μέσω χωριστών ή συγκλίνουσες μηχανισμούς. Ένα βασικό ρυθμιστικό στάδιο είναι μεταγραφής παράγοντα-εξαρτώμενο πρόσληψη του συμπλόκου προ-έναρξης μεταγραφής, που περιέχει RNA πολυμεράσης II (PolII), για τη στόχευση υποκινητές [30]. Για να εκτιμηθεί κατά πόσον αυτό το αρχικό στάδιο της Notch 1 μεταγραφής είναι υπό p53 και ελέγχου Klf4 /SP3, δύο συμπληρωματικές προσεγγίσεις έγιναν. Σε κύτταρα HeLa, όπου τα επίπεδα της ρ53 είναι πολύ χαμηλά λόγω εξαρτώμενη E6 αποικοδόμηση, αξιολογήσαμε τις επιδράσεις της αυξημένης ρ53 με έκφραση over-αδενοϊικό μεσολάβηση. Κατά τον έλεγχο κύτταρα HeLa, δοκιμασίες ChIP έδειξαν μικρή ή καθόλου πρόσδεση του PolII με τον υποκινητή και 3’UTR του γονιδίου Notch 1, ενώ τέτοια πρόσδεση ήταν εύκολα ανιχνεύσιμη σε κύτταρα με αυξημένη έκφραση p53 (Εικ. 8Α). Σε HKC, όπου τα επίπεδα των Klf4 είναι συνήθως χαμηλή, αξιολογήσαμε την επίδραση της αυξημένης έκφρασης Klf4 μέσω ρετροϊικής μόλυνσης. δοκιμασίες ChIP έδειξαν πρόσδεση του PolII με τον υποκινητή και την 3’UTR του γονιδίου Notch 1 σε HKCs ελέγχου, ενώ καμία τέτοια δεσμευτική ήταν ανιχνεύσιμη σε κύτταρα με αυξημένη έκφραση Klf4 (Εικ. 8Β).

(Α) HeLa κύτταρα μολύνθηκαν με ανασυνδυασμένο αδενοϊό που εκφράζει άγριου-τύπου ρ53 (Adp53) ή ελέγχου GFP (AdGFP) και υποβάλλονται σε επεξεργασία για δοκιμασίες τσιπ με αντισώματα έναντι RNA πολυμεράσης II (α-PolII) και μη-άνοσο IgGs ως έλεγχος. PCR ενίσχυση των υποδεικνυόμενων περιοχές του γονιδίου Notch 1 διεξήχθη, παράλληλα με παρόμοια ενίσχυση του DNA χρωματίνης εισόδου. Δεξιά πλαίσια: για ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων, η χρωματίνη ανοσοκαταβυθισμένο υλικό αναλύθηκε επίσης με πραγματικού χρόνου PCR ενίσχυση των υποδεικνυόμενων περιοχών του υποκινητή Notch 1, παράλληλα με τη συμβολή χρωματίνης DNA, που ακολουθείται από ένα υπολογισμό της πρόσδεσης σύμφωνα με την ίδια συνταγή που χρησιμοποιείται στην Σύκο. 7D. (Β) Δημοτικό κερατινοκύτταρα (HKC) μολύνθηκαν με έναν ρετρο-ιικού φορέα που υπερεκφράζουν Klf4 (pMSKlf4) ή κενό φορέα ελέγχου (Ctrl) για 48 ώρες που ακολουθείται από δοκιμασίες ChIP για PolII δεσμευτική όπως και στο προηγούμενο πίνακα, συμπεριλαμβανομένης της ποσοτικοποίησης των αποτελεσμάτων από πραγματικού χρόνου PCR (δεξιά πάνελ).

Η

Λειτουργικά, για να εκτιμηθεί κατά πόσον η αυξημένη έκφραση p53 και Klf4 /Sp3 κάτω διαμόρφωση μπορεί να συνεργήσει, δύο συμπληρωματικές προσεγγίσεις έγιναν. Στην πρώτη, τα κύτταρα HeLa μολύνθηκαν με ρ53 που εκφράζουν αδενοϊό συν /πλην knock-down του Klf4 και Sp3 έκφρασης. Στη δεύτερη περίπτωση, τα κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με siRNAs ειδικό για την πρωτεΐνη UBE3A, ένας αρνητικός ρυθμιστής της σταθερότητας p53, ως μέθοδος για την αύξηση της έκφρασης ενδογενούς ρ53 [14]. Αυξημένα επίπεδα p53 είτε με προσεγγίσεις προκάλεσε την αναμενόμενη επαγωγή της έκφρασης Notch 1. Η συνδυασμένη νοκ ντάουν της Klf4 και Sp3 προκάλεσε επίσης αύξηση της έκφρασης Notch 1, αλλά όχι πρόσθετο ή συνεργιστικά αποτελέσματα παρατηρήθηκαν από την ταυτόχρονη αύξηση της της p53 και το knock-down του Klf4 και Sp3 (Εικ. 9Α και Β).

(Α) κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με siRNAs για Sp3 και Klf4 παράλληλα με περιπλεγμένο ελέγχους siRNA που ακολουθείται, 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, από μόλυνση με ένα ρ53 που εκφράζουν αδενοϊό (Adp53) ή ελέγχου GFP (AdGFP), για 24 ώρες. Τα επίπεδα έκφρασης Notch 1 mRNA προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Οι αναμενόμενες αλλαγές του p53, Sp3 και έκφραση Klf4 επιβεβαιώθηκαν και από πραγματικό χρόνο RT-PCR, με αποτελέσματα παρόμοια με αυτά που απεικονίζονται στα προηγούμενα σχήματα. κύτταρα (Β) HeLa διαμολύνθηκαν με siRNAs για UBE3A, Klf4 και Sp3 μόνος ή σε συνδυασμούς, όπως αναφέρεται, παράλληλα με τα ανακατωμένα ελέγχους siRNA. UBE3A και έκφραση Notch 1 αξιολογήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. (Γ και Δ) Πρωτογενής κερατινοκύτταρα (HKC) (C) και HeLa και SCC13 κύτταρα (D μολύνθηκαν με Klf4 εκφράζουν ρετροϊό ή κενό φορέα ελέγχου για 48 ώρες, που ακολουθείται από μόλυνση με τους ιούς Adp53 ή AdGFP για 24 ώρες. Notch 1 mRNA επίπεδα αξιολογήθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR.

η

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον Klf4 μπορεί να καταστείλει τις επαγωγικές επιδράσεις των κυττάρων p53, HKCs, HeLa και SCC13 μολύνθηκαν με τους Klf4 εκφράζει ρετροϊό ή κενό φορέα ελέγχου, που ακολουθείται από μόλυνση με τον ρ53 που εκφράζουν αδενοϊό ή GFP ελέγχου. αυξημένα επίπεδα ρ53 που προκλήθηκε επαγωγή της έκφρασης Notch 1 σε HKCs ελέγχου καθώς και σε HKCs όπου το γονίδιο Notch 1 ήταν κάτω διαμορφωμένου ως συνέπεια της αυξημένης έκφρασης Klf4 (Σχ. 9C). Α πιο ουσιαστική επαγωγή της έκφρασης Notch 1 προκλήθηκε από μόλυνση Ad-p53 των καρκινικών κυττάρων, όπως HeLa και SCC13 κύτταρα, τα οποία μοιράζονται μια μεταλλαγμένη ή σιωπηλή μονοπάτι ρ53 και χαμηλά επίπεδα ενδογενούς Notch 1 [9], [11]. Σε αυτά τα κύτταρα, τα οποία εκφράζουν υψηλό επίπεδο ενδογενούς Klf4, περαιτέρω έκφραση Klf4 δεν μειώνει την έκφραση Notch 1 και δεν παρεμβαίνει με επαγωγή της από ρ53 (Σχ. 9D).

Έτσι, p53 και Klf4 συγκλίνουν για τον έλεγχο της μεταγραφής του γονιδίου Notch 1 στο αρχικό στάδιο της πρόσληψης PolII, με επαγωγή ρ53 συμβαίνει μέσω ενός ξεχωριστού μηχανισμού από Klf4 /Sp3 καταστολή.

Συζήτηση