Αφηρημένο

Ιστορικό

χρόνιας ηπατίτιδας C (HCV) και συνδέονται κίρρωση του ήπατος αποτελούν σημαντικό παράγοντα κινδύνου για ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) ανάπτυξη. TGF-β είναι ένας σημαντικός οδηγός του ήπατος ινωδογενέσεως και του καρκίνου? Ωστόσο, ο πραγματικός της αντίκτυπος στην εξέλιξη του ανθρώπινου καρκίνου εξακολουθεί να είναι ελάχιστα γνωστό. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει το ρόλο του HCC που προέρχονται πυρήνα HCV φυσικές παραλλαγές στην εξέλιξη του καρκίνου μέσω της επίδρασής τους στη σηματοδότηση TGF-β.

Κύρια Ευρήματα

Σας παρέχουν αποδείξεις ότι HCC- προέρχονται πυρήνα έκφραση πρωτεΐνης σε πρωτογενείς ανθρώπου ή ποντικού ηπατοκυττάρων ανακουφίζει αποκρίσεις TGF-β από την άποψη ή την αναστολή της ανάπτυξης ή απόπτωσης. Αντ ‘αυτού, σε αυτά τα ηπατοκύτταρα ΤΟΡ-β ήταν ακόμη σε θέση να επάγουν μια επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβασης (ΕΜΤ), μια διαδικασία που συμβάλλει στην προώθηση της κυτταρικής εισβολής και της μετάστασης. Επιπλέον, έχουμε αποδείξει ότι διαφορετικά κατώτατα όρια της ενεργοποίησης Smad3 υπαγορεύουν ΤΟΡ-β αποκρίσεις σε ηπατικά κύτταρα και ότι πυρήνα HCV πρωτεΐνη, μειώνοντας την ενεργοποίηση Smad3, μπορούν να στραφούν ανασταλτικά αποτελέσματα ανάπτυξης ΤΟΡ-β σε αποκρίσεις προώθηση όγκου.

Συμπέρασμα /Σημασία

Τα στοιχεία μας δείχνουν την ικανότητα των ηπατοκυττάρων να αναπτύξουν EMT και πλαστικότητα κάτω TGF-β, δίνουν έμφαση στο ρόλο του πυρήνα του HCV πρωτεΐνης στη δυναμική αυτών των επιπτώσεων και παρέχουν ενδείξεις για ένα παράδειγμα όπου μια ιική πρωτεΐνη εμπλέκεται στην ογκογένεση είναι ικανή να μετατοπίσει TGF-β απαντήσεις από κυτταροστατικά επιπτώσεις στην EMT ανάπτυξη

Παράθεση:. Battaglia S, Benzoubir Ν, Nobilet S, Charneau P, Samuel D, Zignego aL, et al. (2009) Liver λαμβάνεται από καρκίνο του ιού της ηπατίτιδας C πρωτεΐνες πυρήνα Shift ΤΟΡ-β Αντιδράσεις από Tumor καταστολή στα επιθηλιακά-μεσεγχυματικά Μετάβασης. PLoS ONE 4 (2): e4355. doi: 10.1371 /journal.pone.0004355

Επιμέλεια: Mauricio Rojas, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Ιουλίου 2008? Αποδεκτές: 18 Δεκ 2008? Δημοσιεύθηκε: 3η Φεβρουαρίου 2009

Copyright: © 2009 Battaglia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από INSERM, Association pour la Recherche sur le Καρκίνο (ARC), Agence Nationale de Recherche sur le SIDA (ANRS) και της Ευρωπαϊκής Κοινότητας (VIRGIL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) ορίζεται ως μια διαδικασία κατά την οποία τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν φαινοτυπική τους χαρακτηριστικά και να αποκτήσουν χαρακτηριστικά μεσεγχυματικών κυττάρων. Ενώ EMT εμπλέκεται στο πλαίσιο της εμβρυϊκής ανάπτυξης διαδραματίζει επίσης έναν ρόλο στην γένεση των ινοβλαστών κατά τη διάρκεια της ίνωσης οργάνων σε ενήλικες ιστούς και θα μπορούσε να συμβάλει στην ανάπτυξη μεταστατικού καρκινώματος [1]. Πράγματι, EMT αναγνωρίζεται ολοένα και περισσότερο ως ένα κρίσιμο βήμα που προάγει την κυτταρική μετανάστευση, όγκων εισβολής και της μετάστασης [2] και έχει επίσης εμπλακεί πρόσφατα σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα εμφάνιση [3]. Στο ήπαρ, τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα (HCS) θεωρούνται ως τα σημαντικότερα ινωτικών πρόδρομα κύτταρα που transdifferentiate να ινογόνων, εξωκυττάρια μήτρα μυοϊνοβλάστες παράγουν στη φλεγμονώδη ιστό ήπατος κατά σηματοδότηση ΤΟΡ-β, ενώ ηπατοκύτταρα υφίστανται απόπτωση μετά σηματοδότηση από την κυτοκίνη αυτή. Ωστόσο, ο προσδιορισμός των διαφόρων ινογόνων πληθυσμούς εκτός των αστεροειδών κυττάρων που κατοικούν [4], καθώς και συγκλίνουσα αποτελέσματα πρόσφατων μελετών αμφισβήτησαν το παράδειγμα της HSC ως βασική πηγή των μυοϊνοβλαστών ήπατος και προκύπτει ένα σημαντικό ρόλο για ηπατοκύτταρα στο ήπαρ ινωδογενέσεως. Πράγματι, έχει αναφερθεί πρόσφατα ότι ηπατοκύτταρα αρουραίου ή ποντικού ανταποκρίνονται τόσο

in vitro

και

in vivo

να ΤΟΡ-β, όχι μόνο από την άποψη της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων και την απόπτωση, αλλά και όσον αφορά επαγωγής της ΕΜΤ [5] – [7]. Κατά συνέπεια, έχει δειχθεί ότι ΤΟΡ-β και λαμινίνης 5 μετατρέψει μη επεμβατική κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος σε διηθητικό κυττάρων μέσω επαγωγής ενός πλήρους [8] EMT. Ωστόσο, αν και οι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την ανάπτυξη EMT έχουν μελετηθεί εκτενώς, ελάχιστα στοιχεία είναι διαθέσιμα σχετικά με τις φυσιολογικές λειτουργίες και τη σημασία της σε ασθένειες του ανθρώπου.

Ένας από τους μηχανισμούς με τους οποίους τα κύτταρα υφίστανται νεοπλασματικό μετασχηματισμό και να ξεφύγουν από τον φυσιολογικό έλεγχο της ανάπτυξης προϋποθέτει μια αλλαγμένη απάντηση στις κυτταροστατικά αποτελέσματα του ΤΟΡ-β [9], [10]. Επιπλέον, κατά τα τελευταία στάδια της ογκογένεσης, ΤΟΡ-β μπορούν να διεγείρουν την εισβολή κυρίως μέσω επαγωγής της EMT. Είναι πλέον γενικά αποδεκτό ότι ο ΤΟΡ-β έχει διττό ρόλο στην ογκογένεση και μπορεί να δράσει ως καταστολέας όγκου ή παράγοντα προαγωγού όγκου ανάλογα με κυτταρικό περιβάλλον [11], [12], αλλά οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στον διακόπτη του ΤΟΡ-β αποκρίσεις προς κακοήθεια δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

In vivo

, έχει αποδειχθεί ότι η απώλεια του ΤΟΡ-β σηματοδότηση μειώθηκε σημαντικά λανθάνουσα όγκου και αύξησε το ποσοστό της μετάστασης σε διάφορα μοντέλα ποντικού [13].

ΤΟΡ-β εκκινεί αποκρίσεις την επαφή των δύο τύπων trans-μεμβράνης κινασών σερίνης /θρεονίνης που ονομάζονται υποδοχείς τύπου Ι και τύπου II, την προώθηση της ενεργοποίησης του τύπου Ι από την κινάση τύπου II. Το ενεργοποιημένο υποδοχέα τύπου Ι τότε διαδίδεται το σήμα προς τον πυρήνα με φωσφορυλίωση Smad2 και Smad3. Μόλις φωσφορυλιωμένα, Smad2 και Smad3 συνεργάτης με τον κοινόχρηστο εταίρο Smad4 και τα σύμπλοκα συσσωρεύονται στον πυρήνα, όπου ρυθμίζουν την έκφραση του ΤΟΡ-β γονίδια στόχους μέσω της συνεργατικής αλληλεπιδράσεων με μεταγραφικές συνεργάτες [14], [15], [16]. Η διακοπή της σηματοδότησης ΤΟΡ-β, είτε μέσω μεταλλάξεων αδρανοποίηση των συστατικών του μονοπατιού σηματοδότησης, ή με τροποποίηση της έκφρασης ή της λειτουργίας τους, είναι σήμερα γνωστό ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόοδο του όγκου. Παρ ‘όλες αυτές τις αποδείξεις, η κλινική επίπτωση του TGF-β σε εξέλιξη μετάσταση παραμένει ασαφής.

χρόνιας ηπατίτιδας C (HCV) και συνδέονται κίρρωση του ήπατος αποτελούν σημαντικό παράγοντα κινδύνου για ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) ανάπτυξη, και παρά τις επιδημιολογικές ενδείξεις που συνδέουν λοίμωξη HCV με HCC, η κλινική επίπτωση αυτού του ιού σε ηπατοκαρκινογένεσης είναι ακόμα ασαφής [17]. Επειδή HCV RNA δείχνει υψηλή γενετικής ποικιλομορφίας, χρόνια λοίμωξη HCV καταλήγει σε ένα συγκρότημα πληθυσμό διαφορετικών αλλά στενά συνδεδεμένα ιικών παραλλαγών που συνήθως αναφέρονται ως οιονεί είδος [18], [19]. Η μη τυχαία κατανομή των HCV οιονεί έχει παρατηρηθεί μεταξύ των καρκινικών και μη καρκινικών ήπατος που υποδηλώνει τη δυνατότητα επιλογής των οιονεί με τροποποιημένες λειτουργικές ιδιότητες που θα μπορούσαν να συμβάλουν στην ανάπτυξη ίνωσης, καθώς και η διαδικασία ογκογένεσης [20].

Το δομικό συστατικό του HCV, πρωτεΐνη πυρήνα HCV έχει προσελκύσει ιδιαίτερη προσοχή μετά το χαρακτηρισμό της και διάφορες εκθέσεις έχουν προτείνει δυναμικό ρόλο της στην παθογένεση του HCV. Πράγματι, εκτός από το ρόλο της στην ιική συσκευασία RNA, πυρήνα HCV πρωτεΐνη έχει αναφερθεί ότι αλληλεπιδρά με διάφορες κυτταρικές πρωτεΐνες όπως TNFR [21], PKR [22], Stat3 pRB ή p53 [23] που οδηγεί στην διαμόρφωση της μεταγραφής των γονιδίων που εξαρτώνται από την αυτές οι καταρράκτες και συνεπώς σε διαμόρφωση ενός αριθμού κυτταρικών ρυθμιστικές λειτουργίες. Στην πραγματικότητα, πολλά στοιχεία έχουν προτείνει μια πιθανή εμπλοκή πυρήνα HCV πρωτεΐνης στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης παρόλο Ορισμένα αποτελέσματα αμφιλεγόμενο δεδομένου ότι πρωτεΐνη πυρήνα έχει αναφερθεί ότι εμφανίζουν Pro ή αντιαποπτωτικά αποτελέσματα ανάλογα με το πειραματικό σύστημα που χρησιμοποιήθηκε [24] , [25]. Επιπλέον αυτές οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση κυρίως αποπτωτικούς παράγοντες από την οικογένεια TNF και όχι με ΤΟΡ-β. Η διαφορά αυτή θα μπορούσε επίσης να οφείλεται σε γενετική ετερογένεια των διαφόρων γονοτύπων του HCV.

Εμείς και άλλοι αποδείξαμε προηγουμένως και μία αλληλεπίδραση μεταξύ Smad3 και του πυρήνα του HCV πρωτεΐνη [26], [27]. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε επίσης ότι διαφορετικές φυσικές πυρήνας των παραλλαγών που απομονώνονται από όγκο ή μη οζίδια όγκου θα μπορούσε διαφορετικά δεσμεύουν Smad3, και κατά συνέπεια αναστέλλουν την ΤΟΡ-β επαγόμενη μεταγραφική δραστηριότητα Smad3 υποδηλώνοντας ότι ο πυρήνας του HCV πρωτεΐνη μπορεί να ρυθμίζουν σηματοδότηση ΤΟΡ-β και κατάντη βιολογικές αποκρίσεις του [ ,,,0],27]. Εμείς hypothetised ότι το μοριακό ετερογένεια του HCV παρατηρήθηκαν σε μολυσμένους ασθενείς θα μπορούσαν να εμπλέκονται στην κλινική πορεία της ανάπτυξης του καρκίνου.

Η υπερέκφραση του ΤΟΡ-β και ταυτόχρονη μείωση στην αναστολή της ανάπτυξης των ηπατοκυττάρων παρατηρείται συχνά σε HCC υποστηρίζοντας την ιδέα ότι TGF-β θα μπορούσαν να διαδραματίσουν έναν όγκο προώθηση ρόλο στον καρκίνο του ήπατος [28]. Ωστόσο, η λειτουργική εμπλοκή του ΤΟΡ-β στο ήπαρ ογκογένεση, καθώς και η επίπτωση της EMT σε ανάπτυξη HCC δεν έχουν ακόμη διευκρινιστεί. Παρομοίως, τα αποτελέσματα των ογκογόνων ιογενή ηπατίτιδα Β ή C πρωτεϊνών για την ανάπτυξη EMT δεν έχουν μελετηθεί κατά τη διάρκεια της διαδικασίας ηπατοκαρκινώματος. Επίδειξη αλληλεπίδραση μεταξύ HCV λοίμωξης και TGF-β μεσολάβηση EMT μπορεί να παρέχει ένα νέο μοντέλο για να αποκτήσουν γνώσεις στους μηχανισμούς της ηπατικής καρκινογένεσης.

Σε αυτή τη μελέτη, κάναμε χρήση του φυσικού πυρήνα HCV παραλλαγών που έχουν απομονωθεί από HCV που σχετίζονται με HCC ιστούς για να αναλυθούν οι επιπτώσεις τους στη διπλή λειτουργία της TGF-β σε ένα pathophysiogically-σχετικός όρος. Έτσι, ερευνώνται οι επιδράσεις των βασικών πρωτεϊνών παραλλαγών που απομονώνεται από τις δύο όγκων ή μη καρκινικά κίρρωση περιοχές στην πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα? Πράγματι, η κίρρωση είναι ένα πολύ γνωστό προνεοπλασματική κατάσταση, που συνδέονται σε τουλάχιστον 90% των περιπτώσεων ηπατοκυτταρικού καρκινώματος. Χρησιμοποιώντας αυτές τις παραλλαγές που παρέχουν ενδείξεις για ένα παράδειγμα στο οποίο μια ιική πρωτεΐνη είναι ικανή να μετατοπίσει τις αποκρίσεις TGF-β από κυτταροστατική δράση στην ανάπτυξη EMT.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

ανασυνδυασμένο ΤΟΡ-β1 και ανασυνδυασμένο TRAIL /Apo2L αγοράστηκαν από Abcys, ο χημικός αναστολέας του ΤΟΡ-β σηματοδότηση SB-431542 που δρα ειδικά παρεμβαίνοντας με τον τύπο Ι υποδοχέα [29] ήταν από την Calbiochem, την φθορίζουσα χρωστική DiOC

6 (3,3’dihexylocarbocyanine ιωδίδιο) ήταν από την Molecular Probes.

Vectors

αλληλουχίες πυρήνα μήκους HCV Πλήρης ενισχύθηκαν από το HCV-RNA που εξάγεται από όγκου (Τ) ή με κίρρωση (ΝΤ) οζίδια ενός ασθενούς (ασθενής Β) μολυσμένα με HCV γονότυπο 1 b όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. PCR προϊόντα απευθείας αλληλουχήθηκαν και εισάγεται στον φορέα pcDNA3.1. Η αλληλουχία αυτών των δύο παραλλαγών έχει περιγραφεί προηγουμένως [27]. Η σειρά T διαφέρει από τη μια NT με 2 αλλαγές στην αα 118 (N → D) και αα 189 (A → V).

(CAGA)

9-Luc παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr JM Gauthier . Οι φορείς έκφρασης για το ΗΑ-TβRI.act, και Flag-TβRImL45.act ήταν ένα δώρο από τον Dr. Υ.Ε. Zhang [30]. Το πλασμίδιο pRetroSuper-puro που περιέχει μικρή αντιπληροφοριακό φουρκέτες RNA κατά Smad3 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr J. Massagué [31]. Ένα πλασμίδιο pRetroSuper-puro περιέχει αγωνίζομαι σύντομο φουρκέτες RNA χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. pIRES-GFP αποκτήθηκε από Stratagene, pCMV-Renilla-Luc ήταν από την Promega. Myc-Smad3 φορέας έκφρασης περιγράφηκε προηγουμένως [32].

διαγονιδιακά ποντίκια

Για να ληφθούν διαγονιδιακά ποντίκια, τα πυρήνας HCV cDNAs που απομονώνονται από όγκο (Τ) ή με κίρρωση οζίδια (ΝΤ) κλωνοποιήθηκαν προς τα κάτω του ιού της ηπατίτιδας Β ρυθμιστικά στοιχεία και να εισαχθούν σε C57BL /6 έμβρυα (Institut Clinique de la Σουρής, Στρασβούργο, Γαλλία). Τα διαγονιδιακά ποντίκια πιστοποιήθηκαν με υποβολή 1 μα DNA ουράς για ενίσχυση με PCR.

Κυτταρική καλλιέργεια

Η κυτταρική γραμμή ανθρώπινου ηπατώματος Huh7 [33] διατηρήθηκε σε Dulbecco Τροποποιημένο μέσο που περιέχει 10% εμβρυϊκό ορό ορού (FCS). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα διαφορετικά διανύσματα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο LipofectAMINE (Invitrogen) και τα σταθερά διαμολυνθέντα επιλέχθηκαν με επώαση των κυττάρων με το αντιβιοτικό που αντιστοιχεί στο γονίδιο επιλογής.

Απομόνωση και καλλιέργεια πρωτογενούς ηπατοκυττάρων

Πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού απομονώθηκαν από το ήπαρ έγχυση με ένα μίγμα κολλαγενάσης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34]. Μετά την απομόνωση, τα ηπατοκύτταρα εναιωρήθηκαν εκ νέου σε μέσο Williams συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 100 U /ml πενικιλίνη, 250 ng /ml fungizone ( «μέσο επιμετάλλωση») και επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

4 κύτταρα /cm

2. Μετά από 4 ώρες, το μέσο που περιέχει ορό απομακρύνθηκε και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Williams συμπληρωμένο με 1 mg /ml αλβουμίνη βόειου ορού, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 100 U /ml πενικιλίνη, 250 ng /ml fungizone, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ΤΟΡ- β 2 ng /ml ή 1 μΜ SB431542.

Πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα απομονώθηκαν από τον υγιή ιστό του ήπατος του χειρουργικά δείγματα βιοψίας ήπατος που συλλέχθηκαν μετά ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από ασθενή που υποβάλλεται σε θεραπευτική μερική ηπατεκτομή για μετάσταση στο ήπαρ και καλοηθών ηπατικών όγκων. Η κολλαγενάση (Sigma Aldrich) αιμάτωσης (500 μg /ml, 2,4 mg /ml CaCl

2 σε ρυθμιστικό διάλυμα HEPES, ρΗ 7.4) προηγήθηκε από εκτεταμένη πλύση του ιστού του ήπατος με HEPES /ρυθμιστικό EDTA (ρΗ 7.4) χρησιμοποιώντας ένα καθετήρα που εισάγεται στα σκάφη στην επιφάνεια κοπής της εκτομή θραύσματος. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές και τα ηπατοκύτταρα διαχωρίστηκαν από nonparenchymatous κύτταρα με Percoll κλασματοποίηση (30% ισοτονικό διάλυμα Percoll, φυγοκεντρήθηκε στα 450 g για 4 λεπτά) και αμέσως μολύνθηκαν σε 37 ° C για 2 ώρες με λεντοϊκούς φορείς, πλύθηκαν και απλώθηκαν σε μέσο Williams συμπληρωμένο όπως περιγράφεται αλλού [35]. Δώδεκα ώρες αργότερα, υποβλήθηκαν σε θεραπεία ή όχι με TGF-β ή SB431542 για διάφορες χρονικές περιόδους.

Οι φορείς λεντοϊών

TRIP-ΔU3-CMV-T, TRIP-ΔU3-CMV-NT και TRIP-ΔU3-CMV-CINV φορείς ελήφθησαν αντικαθιστώντας GFP στο TRIP-ΔU3-CMV-GFP με cDNA που κωδικοποιεί για τις βασικές HCV αλληλουχιών. Μία ανεστραμμένη αλληλουχία πυρήνα TRIP-ΔU3-CMV-CINV χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

σωματιδίων φορέα παρήχθησαν με παροδική συν-επιμόλυνση φωσφορικού ασβεστίου των κυττάρων 293Τ ως προηγουμένως περιγράφεται [36]. Οι συγκεντρώσεις Vector κανονικοποιήθηκαν σύμφωνα με την ρ24 (HIV-1 πρωτεΐνης καψιδίου) περιεκτικότητα των υπερκειμένων.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 0.5% SDS και Benzon νουκλεάσης. Οι πρωτεΐνες ποσοτικοποιήθηκαν με τον προσδιορισμό πρωτεΐνης Bio-Rad (Bio-Rad, Γαλλία) και 30 μg των εκχυλισμάτων διαχωρίστηκαν σε SDS πηκτή πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και στυπώθηκε χρησιμοποιώντας διαφορετικά πρωτογενή αντισώματα που κατευθύνονται έναντι πρωτεΐνης πυρήνα HCV, Ε-καδερίνης, Ινωδονεκτίνης (Santa Cruz Biotechnology), βιμεντίνη (Chemicon), φωσφο-Smad3 (Cell σηματοδότησης), Smad3 (Abcam), σημαία, Myc και ετικέτες ΗΑ (Sigma). Οι μεμβράνες αποκαλύφθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης chemioluminescence (ECL Plus, GE Healthcare).

χρώση κυττάρων

πρωτογενή ηπατοκύτταρα ποντικού καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες με ή χωρίς ΤΟΡ-β (2 ng /ml) και ρουτίνα κηλίδα αιματοξυλίνης-ηωσίνης πραγματοποιήθηκε μετά από στερέωση των κυττάρων με EtOH 70% στους 4 ° C για 15 λεπτά.

ανοσοφθορισμού χρώση

τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% PFA διάλυμα στους 4 ° C για 20 λεπτά που ακολουθήθηκε από μεθανόλη διαπερατότητας για 5 λεπτά στους -20 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα αντι-βιμεντίνη πρωτογενή ποντικού, κουνελιού αντι-αSMA, ή κουνελιού αντι-Ε-καδερίνης αντίσωμα και έπειτα με ένα Alexa Fluor 488 συζευγμένο αντίσωμα αντι-ποντικού και ενός αντισώματος αντι-κουνελιού συζευγμένου κατσίκας Alexa Fluor 594 (Molecular ανιχνευτές). Αυτά στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Hoechst και εξετάστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού.

πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την απόπτωση δοκιμασίες

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με BrdU ενσωμάτωση (Roche), η βιωσιμότητα των κυττάρων και δραστικότητα κασπάσης 3 εκτιμήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ΟθΙΙϋίθΓ-Glo δοκιμασία φωταύγειας κυτταρικής βιωσιμότητας ή η δοκιμασία CaspaseGlo 3/7 αντιστοίχως (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Μιτοχονδριακή διαμεμβρανικό δυναμικό (ΔΨm) αξιολογήθηκε με χρώση των κυττάρων (10

6) με το φθορίζουσα χρωστική DiOC

6 σε μια τελική συγκέντρωση των 40 ηΜ για 15 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα αμέσως διαχωρίστηκαν με θρυψίνη και ο φθορισμός τους εκτιμήθηκε με ανάλυση με ένα κυτταρόμετρο ροής FACScan (Becton-Dickinson) με τη χρήση του καναλιού FL1 [37].

διαλογή κυττάρων

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και η διαλογή ήταν εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας μία ροή FacsDiva κυτταρόμετρο (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Forward Scatter (FSC) και πλευρική σκέδαση (SSC) συλλέχθηκαν μέσω ενός φίλτρου. Το σήμα GFP συλλέχθηκε στο κανάλι FL1. Ένα ελαφρύ πύλη συντάχθηκε στην SSC έναντι FSC να απαγορεύσει τα νεκρά κύτταρα /συντρίμμια. Κυττάρων στην πύλη εκτέθηκαν σε biparameter ιστόγραμμα (FS έναντι FL1) και η τελική ρυθμίσεις περίφραξη αποφασισμένοι να συλλέγουν τα σημασμένα κύτταρα. GFP θετικά κύτταρα ταξινομήθηκαν σε 5000 κύτταρα /sec.

Μεταγραφική ανάλυση

Τα κύτταρα συνδιαμολύνθηκαν με φορείς που κωδικοποιούν για το γονίδιο ενδιαφέροντος μαζί με το CAGA-luc πλασμίδιο ανταποκριτή και του πλασμιδίου λουσιφεράσης Renilla να ομαλοποίηση των αποτελεσμάτων. Αυτά επωάστηκαν 24 ώρες αργότερα με την απουσία ή την παρουσία του ΤΟΡ-β για άλλες 18 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε με το σύστημα δοκιμασίας ανταποκριτή διπλής λουσιφεράσης (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική ανάλυση

Η σημασία μεταξύ των διαφορετικών συνθηκών και τον έλεγχό τους προσδιορίστηκε με ζευγαρωμένα του Student

t

δοκιμή με τη χρήση του λογισμικού GraphPad Prism. Μια ρ-value≤0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

πυρήνα HCV παραλλαγές ανακουφίσει ΤΟΡ-β κυτταροστατικές αποκρίσεις και να αυξήσει την ΤΟΡ-β μεσολάβηση EMT σε ποντικό ή ανθρώπινα πρωτογενή ηπατοκύτταρα

Έχουμε αποδείξει στο παρελθόν ότι, όταν εκφράζεται παροδικά σε ηπατικά κύτταρα, πυρήνα HCV πρωτεΐνες που απομονώνονται από όγκο ή με κίρρωση οζίδια δεσμεύουν Smad3 με διαφορετικό τρόπο και ότι αυτή η αλληλεπίδραση αναστέλλει Smad3 εξαρτώμενη μεταγραφική δραστηριότητα [27]. Για να εξακριβωθεί η φυσιολογική σημασία αυτής της παρατήρησης, ερευνήσαμε πρώτα την επίδραση αυτών των δεσμευτικών για ΤΟΡ-β βιολογικές αντιδράσεις σε ηπατοκύτταρα που απομονώνονται από διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν αυτές τις HCV όγκου (Τ) ή με κίρρωση (ΝΤ) πυρήνας παραλλαγές υπό τον έλεγχο του υποκινητή HBx και η οποία εκφράζεται κυρίως στο ήπαρ. Τα ηπατοκύτταρα απομονώθηκαν από ήπατα ποντικών ηλικίας 2 μήνα και κατεργάζεται ή όχι με ΤΟΡ-β για 48 ώρες. Παρατηρήσαμε ότι ο ΤΟΡ-β ήταν λιγότερο ισχυρή να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ηπατοκύτταρα που απομονώνονται από διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν τις βασικές πρωτεΐνες του HCV σε σχέση με ηπατοκύτταρα που απομονώνονται από ένα ποντικό ελέγχου (Εικ. 1Α). Κατά συνέπεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν λιγότερο μειώθηκε κατά ΤΟΡ-β σε κύτταρα που εκφράζουν τις πρωτεΐνες πυρήνα σε σύγκριση με τον τύπο των κυττάρων άγριου (Εικ. 1Β). Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση του πυρήνα HCV πρωτεΐνες ανέστειλαν ΤΟΡ-β-μεσολαβούμενη απόπτωση, όπως φαίνεται από την ενεργοποίηση της κασπάσης 3, η οποία αντιπροσωπεύει μια καλά καθορισμένη χαρακτηριστικό γνώρισμα της απόπτωσης (Σχ. 1 C). Είναι ενδιαφέρον ότι, ο πυρήνας έκφραση Τ μειώθηκε ΤΟΡ-β μεσολάβηση απόπτωση ή την αναστολή της κυτταρικής βιωσιμότητας σε μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι στον πυρήνα NT δείχνει μια λειτουργική σημασία της αυξημένης αλληλεπίδρασης αυτού του πυρήνα παραλλαγής με Smad3 [27]. Για να επαληθευθεί ότι αυτός ο HCV πυρήνα επαγόμενη μείωση της απόπτωσης που παρατηρήθηκε μετά από αγωγή ΤΟΡ-β ήταν ειδική, χρησιμοποιήσαμε ένα άλλο επαγωγέας απόπτωσης, TRAIL. ηπατοκύτταρα ποντικών που εκφράζουν ή όχι οι πρωτεΐνες πυρήνα HCV ανταποκριθεί σε TRAIL με παρόμοιο τρόπο από την άποψη της κασπάσης 3 ενεργοποίησης που υποδηλώνει ότι η συνολική διαδικασία της απόπτωσης δεν τροποποιήθηκε με πυρήνα έκφρασης (Σχ. 1D). Το αποτέλεσμα αυτό είναι σε συμφωνία με προηγούμενη έκθεση στην οποία αναφέρεται ότι ο πυρήνας του HCV οδηγεί σε TRAIL επαγόμενη απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του μιτοχονδριακού σηματοδότησης μονοπατιού [38].

(Α, Β, Γ) ηπατοκύτταρα ποντίκι που λαμβάνονται από τα συκώτια των διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν ή όχι πυρήνα HCV πρωτεΐνες που απομονώνονται από όγκο (Τ) ή με κίρρωση (ΝΤ) ιστοί υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β για 48 ώρες πριν από τον προσδιορισμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, εκτιμάται από ενσωμάτωσης BrdU (Α), η βιωσιμότητα των κυττάρων (Β) ή κασπάση 3 δραστηριότητα (C). (D) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με TRAIL (20 ng /ml) για 18 ώρες πριν από τον προσδιορισμό της δραστικότητας caspase3. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή +/- SD των τριπλών από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. * P ≤ 0,05, ** p≤0.005, *** p≤0.0005.

Η

Αρκετές γραμμές αποδείξεων υποστηρίζουν την ιδέα ότι τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα χάνουν την ικανότητά τους να ανταποκριθούν στις κυτταροστατικά αποτελέσματα TGF-β, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις, να διατηρούν την ικανότητά τους να ανταποκρίνονται σε άλλες TGF-β μεσολάβηση λειτουργίες, όπως η EMT. Η παρατήρηση ότι πυρήνας HCV πρωτεΐνες παρεμβαίνουν στην ικανότητα του ΤΟΡ-β για να εκτελέσει την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και τη θανάτωση των κυττάρων μας ώθησε να εξετάσουμε την πιθανότητα ότι αυτές οι πρωτεΐνες θα μπορούσαν να επηρεάσουν ΤΟΡ-β μεσολάβηση EMT. Από πρόσφατα ευρήματα απέδειξαν ότι ο ΤΟΡ-β θα μπορούσε να προκαλέσει μια EMT σε ώριμα ηπατοκύτταρα ποντικού

in vitro

[6], [7], ερευνήσαμε αν πυρήνα HCV πρωτεΐνες μπορεί να διαμορφώσει την ικανότητα του ΤΟΡ-β για την προώθηση της EMT στα ίδια πρωτογενή ηπατοκύτταρα. παρατήρηση μικροσκόπιο αντίθεσης αποκάλυψε ότι μετά από θεραπεία για 30 ώρες με ΤΟΡ-β κάποιες ηπατοκύτταρα αποκτήσει ινοβλάστη μορφολογία που μοιάζει υποδηλώνουν ΕΜΤ και ότι αυτή η επίδραση ήταν περισσότερο έντονη όταν αυτά τα ηπατοκύτταρα εκφράζουν την πρωτεΐνη πυρήνα που δείχνουν ότι η κυτταρική πλαστικότητα θα μπορούσε να αυξηθεί σε ηπατοκύτταρα ποντικών που εκφράζουν πυρήνα HCV Τ πρωτεΐνη (Εικ. 2Α). Αυτή η παρατήρηση αυτή ενισχύθηκε από βιντεομικροσκοπία παρατήρησης (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Για να επιβεβαιώσετε ότι αυτές οι αλλαγές που παρατηρήθηκαν φαινοτυπική ήταν αντανακλαστική μιας EMT, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις ανοσοφθορισμού σε ηπατοκύτταρα που απομονώνονται από τον έλεγχο ή από διαγονιδιακά ποντίκια. Σύμφωνα με τα προηγούμενα ευρήματα, η αγωγή ΤΟΡ-β των ηπατοκυττάρων ποντικού ελέγχου συνοδεύτηκε από μια πολύ μεγάλη αύξηση στον πολυμερισμό του μεσεγχυματικών άλφα σημειωτή των λείων μυών ακτίνης (αSMA) σύμφωνο με φαινότυπο του EMT (Εικ. 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, ο πυρήνας HCV πρωτεΐνες και ιδιαίτερα ο ένας Τ θα μπορούσε να αυξήσει τις ίνες αSMA απουσία εξωγενώς προστιθέμενης ΤΟΡ-β. Για να εκτιμηθεί εάν αυτοκρινή αποδέσμευση του ΤΟΡ-β θα μπορούσαν να συμμετέχουν στον σχηματισμό ινών στρες αSMA σε HCV πυρήνα εκφράζοντα κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε ένα συγκεκριμένο αναστολέα TGFβR1, SB431542. Όταν αυτά τα κύτταρα που εκφράζουν υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυτού του αναστολέα, αSMA ίνες εξαφανιστεί εντελώς, γεγονός που υποδηλώνει ότι η επίδραση της πρωτεΐνης πυρήνα για την ανάπτυξη ΕΜΤ διαμεσολαβείται από μία ενδογενή παραγωγή του ΤΟΡ-β (Σχ. 2Β). Σύμφωνα, κηλίδες Western αναλύσεις έδειξαν επίσης ότι η έκφραση Ε-καδερίνης, ένα επιθηλιακό δείκτη είναι γνωστό ότι χάνεται σε μεσεγχυματικά κύτταρα, μειώθηκε σημαντικά από ΤΟΡ-β και αποκατασταθεί πλήρως με την προσθήκη του SB431542 (Σχ. 2C).

(Α) μορφολογικές μεταβολές των ηπατοκυττάρων ποντικού που εκφράζουν ή όχι πυρήνας Τ πρωτεΐνη HCV παρατηρήθηκαν μετά από 48 ώρες καλλιέργειας με ή χωρίς ΤΟΡ-β (2 ng /ml). (Β) Τα ηπατοκύτταρα που απομονώνονται από διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν πρωτεΐνες πυρήνα HCV υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΤΟΡ-β (2 ng /ml) ή SB431542 (1 μΜ) για 48 ώρες και η έκφραση του αSMA εξετάστηκε με ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα αSMA. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Γ) Τα ηπατοκύτταρα που απομονώνονται από διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν πρωτεΐνες πυρήνα HCV υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΤΟΡ-β ή SB431542 για 48 ώρες και η έκφραση Ε-καδερίνης προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western. Anti-p38 κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε ως φόρτωση ελέγχου. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Για να ληφθεί περαιτέρω απόδειξη ότι πυρήνας HCV πρωτεΐνες μπορεί να διαμορφώσει το μέγεθος των αρνητικών ανάπτυξης ρυθμιστικές επιδράσεις του ΤΟΡ-β εκτελέσαμε επίσης πειράματα σε ανθρώπινα πρωτογενή ηπατοκύτταρα. Προσφάτως απομονωμένα ηπατοκύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊούς που κωδικοποιούν τις βασικές παραλλαγές Τ ή NT ή ανεστραμμένη αλληλουχία πυρήνα ως έλεγχος. αναλύσεις κηλίδος Western επιβεβαίωσε την έκφραση των πρωτεϊνών πυρήνα (Σχ. 3Α). Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή ή όχι με ΤΟΡ-β για 96 ώρες πριν από την ανάλυση για τη βιωσιμότητα των κυττάρων ή κασπάσης 3 ενεργοποίηση. Τόσο ΤΟΡ-β-διαμεσολαβούμενη μείωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχ. 3Β) και αποπτωτικά αποκρίσεις (Σχ. 3C) έχουν μετριασθεί με πυρήνα HCV έκφραση επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σε ηπατοκύτταρα ποντικού.

Προσφάτως απομονωθέντα κύτταρα μολύνθηκαν με φακοϊούς που κωδικοποιούν τις παραλλαγές πυρήνα του HCV πρωτεΐνη ή ένα ανεστραμμένο αλληλουχία πυρήνα ως έλεγχος (CTL) (Α) Επίπεδα πυρήνα έκφρασης εκτιμήθηκαν με ανάλυση Western blot διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την μεταγωγή φακοϊό. (B, C) Προσδιορισμός της βιωσιμότητας των κυττάρων (Β) ή δραστικότητα κασπάσης 3 (C) πραγματοποιήθηκε μετά από 96 ώρες της θεραπείας με ΤΟΡ-β (5 ng /ml). Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή +/- SD των τριπλών από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. * P ≤ 0,05, *** p≤0.0005.

Η

Αν και ο ΤΟΡ-β μεσολάβηση ΕΜΤ έχει περιγραφεί σε πρωτογενή ηπατοκύτταρα αρουραίου ή ποντικού καθώς επίσης και σε καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου, καμία τέτοια μελέτη ήταν ακόμη διερευνηθεί σε πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα in vitro. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ότι τα ανθρώπινα ηπατοκύτταρα θα μπορούσε να εκφράσει ίνες στρες ως αιχμές βρίσκονται κυρίως σε προεξοχές μεμβράνη υπό θεραπεία ΤΟΡ-β (Σχ. 4Α). Έκφραση των βασικών πρωτεϊνών HCV αυξημένη αυτή TGF-β αποτέλεσμα. Εδώ πάλι η έκφραση των HCV πρωτεϊνών πυρήνα αυξημένη πολυμερισμού αSMA ακόμη και απουσία εξωγενώς προστιθέμενης ΤΟΡ-β. Αυτή η επίδραση θα μπορούσε να περιλαμβάνει ενδογενή ΤΟΡ-β, δεδομένου ότι καταργήθηκε πλήρως με την παρουσία του αναστολέα του υποδοχέα ΤΟΡ. Για να επιβεβαιωθεί αυτό το αποτέλεσμα, μελετήσαμε την έκφραση του άλλου δείκτη μεσεγχυματικών, βιμεντίνη. Σύμφωνα με τα δεδομένα που ελήφθησαν με αSMA, παρατηρήσαμε ότι σε ηπατοκύτταρα έλεγχος βιμεντίνη έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη μετά την κατεργασία του ΤΟΡ-β και ότι αυτή η αύξηση ήταν μεγαλύτερη όταν ηπατοκύτταρα εξέφρασαν την πρωτεΐνη πυρήνα NT και ακόμη μεγαλύτερη όταν το Τ πυρήνας εκφράστηκε (Σχ. 4Α ). Παρομοίως, πρωτεΐνες πυρήνα επαγόμενη έκφραση βιμεντίνη και πολυμερισμός απουσία εξωγενώς προστιθέμενης ΤΟΡ-β. Αυτή η έκφραση αντιστράφηκε πλήρως από την TGFbRI αναστολέα υποδηλώνοντας πάλι ότι ενδογενώς παραγόμενη ΤΟΡ-β θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για το σκοπό αυτό.

(Α) Εκφραση αSMA ή βιμεντίνης εκτιμήθηκε με ανάλυση ανοσοφθορισμού μετά την αγωγή με ΤΟΡ-β ( 5 ng /ml) ή SB431542 (1 μΜ). (Β) Έκφραση της ινονεκτίνης ή Ε-καδερίνης εκτιμήθηκε με ανάλυση στυπώματος Western στις ίδιες πειραματικές συνθήκες. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι αναλύσεις

Η

κηλίδες Western αποδεικνύεται χαμηλότερη έκφραση της Ε-καδερίνης μετά ΤΟΡ-β θεραπεία η οποία ήταν εντελώς ανακτάται υπό την παρουσία του αναστολέα TbRI. Αντιθέτως, η έκφραση του ινονηκτίνης μεσεγχυματικών δείκτη αυξήθηκε σημαντικά από ΤΟΡ-β (Σχ. 4Β).

Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν έντονα ότι πυρήνας HCV παρεμβαίνουν ΤΟΡ-β αποκρίσεις σε όρους αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης και απόπτωση σε ηπατοκύτταρα που απομονώνονται από διαγονιδιακά ποντίκια, καθώς και ανθρώπινα πρωτογενή ηπατοκύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι αποκρίσεις TGF-β, από την άποψη της ΕΜΤ αυξήθηκε κατά έκφραση παραλλαγών πρωτεΐνης πυρήνα Τ ή NT τόσο ποντικού και ανθρώπινα ηπατοκύτταρα. Αυτό μπορεί να αντανακλά τόσο τις άμεσες επιδράσεις της πυρήνα στον TGF-β επαγόμενη EMT και τη μείωση του ΤΟΡ-β επαγόμενη απόπτωση από την πρωτεΐνη πυρήνα, επιτρέποντας περισσότερα κύτταρα να υποστούν EMT σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

πυρήνα HCV ρυθμίζει ΤΟΡ -β αποκρίσεις σε κύτταρα Huh7

προκειμένου να αναλύσουμε των μοριακών μηχανισμών που ενεργοποιούνται από τον πυρήνα HCV πρωτεΐνη, έχουμε καθιερωμένες κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν σταθερά Huh7 την πρωτεΐνη πυρήνα Τ (Εικ. 5Α). Πυρήνας πρωτεΐνη ανέστειλε ΤΟΡ-β-διαμεσολαβούμενη Smad3 μεταγραφική δραστικότητα μετράται με έκφραση σε αυτά τα κύτταρα ενός πλασμιδίου ανταποκριτού, το οποίο περιέχει στοιχεία CAGA δειχθεί προηγουμένως να μετενεργοποίησε με ΤΟΡ-β μέσω πρωτεϊνών Smad (δεν φαίνεται). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε πρωτογενή ηπατοκύτταρα, βρήκαμε ότι πυρήνα του HCV πρωτεΐνη ήταν σε θέση να μειώσει την ανασταλτική επίδραση της ΤΟΡ-β επί της κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχ. 5Β). Παρομοίως, ο ΤΟΡ-β μεσολάβηση απόπτωση μειώθηκε σε κύτταρα που εκφράζουν πυρήνα του HCV όπως φαίνεται από την ενεργοποίηση caspase3 (Εικ. 5C) ή απώλεια του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης, η οποία αποτελεί ένα ακόμη πρώιμο δείκτη απόπτωσης (Σχ. 5D).

(Α) Εκφραση του πυρήνα του HCV πρωτεΐνης προσδιορίζεται με ανάλυση κηλίδος Western. (B, C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ΤΟΡ-β (5 ng /ml) για 48 ώρες πριν από τον προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων (Β) ή δραστηριότητα caspase3 (C). Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή +/- SD των τριπλών από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα. *** P≤0.0005 (D) το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨ) εκτιμήθηκε με ανάλυση FACS σε κύτταρα επεξεργασμένα με ΤΟΡ-β για 48 ώρες. Μετά από χρώση με DiOC

6 (3), κύτταρα με χαμηλή ένταση φθορισμού που αντιστοιχεί σε χαμηλό (ΔΨm) έχουν περίφραξη και ο αριθμός τους εκφράζεται ως ποσοστό του συνολικού πληθυσμού. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα δείχνεται. (Ε) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΤΟΡ-β για 48 ώρες και Ε-καδερίνη ή έκφραση αSMA αξιολογήθηκε με ανάλυση ανοσοφθορισμού. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (F) Συγκριτική έκφραση του πυρήνα HCV πρωτεϊνών. Εκχυλίσματα από καλλιεργημένα κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη πυρήνα (Huh7, ανθρώπου ή ποντικού πρωτογενή ηπατοκύτταρα) ή από ήπατα ασθενών HCC που σχετίζονται με HCV αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Anti-p38 κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε ως φόρτωση ελέγχου.

Η

Στη συνέχεια, αποφασιστική διαδικασία EMT σε κυτταρικές σειρές Huh7 εκφράζουν αυτήν την πρωτεΐνη πυρήνα. μελέτες ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι αSMA ήταν ιδιαίτερα πολυμερίζεται μετά την κατεργασία του ΤΟΡ-β συνδέεται με μια ισχυρή μείωση της Ε-καδερίνης από τις κυτταρικές μεμβράνες (Σχ. 5Ε). πολυμερισμού αSMA αυξήθηκε σε βασικά κύτταρα που εκφράζουν. Είναι ενδιαφέρον ότι, υπό την παρουσία πρωτεΐνης πυρήνα, αSMA ίνες εμφανίστηκε ακόμη και απουσία εξωγενώς προστιθέμενης ΤΟΡ-β. Η έκφραση του αSMA συνοδεύτηκε με αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη, η οποία παρατηρήθηκε απουσία εξωγενώς προστιθέμενης ΤΟΡ-β σε πρωτείνη πυρήνα HCV κύτταρα που εκφράζουν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι οι επιδράσεις του πυρήνα του HCV πρωτεϊνών επί ΤΟΡ-β αποκρίσεις παρατηρήθηκαν σε πρωτογενή ηπατοκύτταρα αναπαραχθεί σε μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά ηπατώματος που μπορεί να αποτελεί χρήσιμο εργαλείο για να τεμαχίσει τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην διαμόρφωση του ΤΟΡ-β αποκρίσεις.

έχουμε, επίσης, σε σύγκριση πυρήνα της πρωτεΐνης έκφρασης σε διαφορετικά κυτταρικά μοντέλα μας και σε αποσπάσματα από το συκώτι του HCV ασθενών /HCC. Η ισχυρότερη έκφραση ελήφθη σε ανθρώπινα ηπατοκύτταρα, η οποία είναι συνεπής με μια αποτελεσματική βραδέος ιού μεταγωγής. HCV πυρήνα έκφραση πρωτεΐνης θα μπορούσε επίσης να ανιχνευθεί σε διάφορα ηπατικά εκχυλίσματα αν και σε διαφορετικά επίπεδα. Είναι ενδιαφέρον ότι, ο πυρήνας της έκφρασης σε αυτά τα αποσπάσματα ήταν συγκρίσιμο με εκείνο που παρατηρείται στα ηπατοκύτταρα ποντικού (Εικ. 5F).

κατώτατα όρια Διαφορικές της Smad3 διακόπτη ενεργοποίησης TGF-β απαντήσεις από την καταστολή του όγκου σε

προώθηση όγκου

για να αναλυθεί με περισσότερες λεπτομέρειες τη συμβολή της ενεργοποίησης Smad στα αποτελέσματα του HCV πυρήνα στο ΤΟΡ-β αποκρίσεις, κάναμε χρήση ενός μεταλλάκτη του υποδοχέα ΤΟΡ-β Ι, TβRImL45Act που διατηρεί μια ουσιαστικά δραστική τομέα κινάσης αλλά δεν είναι σε θέση να επάγει Smad φωσφορυλίωση. κύτταρα Huh7 επιμολύνθηκαν με αυτό το μεταλλαγμένο ή με τον άγριο τύπο ενεργοποιημένη μορφή του TβRI, μαζί με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί για τον πυρήνα του HCV και GFP για την ανίχνευση των επιμολυσμένων κυττάρων. .