Αφηρημένο

KIF14

(κινεσίνη μέλος της οικογένειας 14) είναι μια μιτωτική κινεσίνη και ένα σημαντικό ογκογονιδίου σε διάφορες μορφές καρκίνου. Όγκου

KIF14

επίπεδα έκφρασης είναι ανεξάρτητα πρόβλεψης της κακής έκβασης, καθώς και στα καρκινικά κύτταρα KIF14 μπορούν να διαμορφώσουν μεταστατική συμπεριφορά διατηρώντας κατάλληλα επίπεδα πρόσφυσης κυττάρων και πρωτεϊνών μετανάστευση στην κυτταρική μεμβράνη. Έτσι KIF14 είναι ένα συναρπαστικό πιθανό θεραπευτικό στόχο. Κατανόηση ρύθμιση KIF14 σε καρκινικά κύτταρα είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη αποτελεσματικών και επιλεκτική θεραπείες να εμποδίσει ογκογόνα λειτουργία (ες) της. Έχουμε προηγουμένως διαπιστώσει ότι κοντά στο 30% των καρκίνων των ωοθηκών ορώδες (OVCA όγκοι) εμφανίζουν χαμηλού επιπέδου γονιδιωματική κέρδος, υποδεικνύοντας έναν μηχανισμό από

KIF14

υπερέκφραση σε όγκους. Τώρα έκθεση σχετικά με μεταγραφικά και επιγενετική ρύθμιση της

KIF14

. Μέσα από τις αναλύσεις διαγραφή υποκινητή, εντοπίσαμε ένα

cis-ρυθμιστικών

περιοχή που περιέχει θέσεις σύνδεσης για Sp1, HSF1 και ΥΥ1. siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν από αυτούς τους παράγοντες μεταγραφής αποδειχθεί ενδογενή ρύθμιση της

KIF14

υπερέκφραση του

Sp1

και

ΥΥ1

, αλλά όχι

HSF1

. πειράματα ChIP επιβεβαίωσε εμπλουτισμό τόσο Sp1 και ΥΥ1 σύνδεση με τον ενδογενή υποκινητή KIF14 σε κυτταρικές σειρές OVCA με υψηλή

KIF14

έκφρασης. Μια ισχυρή συσχέτιση παρατηρήθηκε στην πρωτοβάθμια ορώδες OVCA όγκους μεταξύ

Sp1

,

ΥΥ1

και

KIF14

έκφρασης, περαιτέρω απόδειξη ότι αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής είναι σημαντικοί παίκτες στην

KIF14

υπερέκφραση. μοτίβα υπομεθυλίωση παρατηρήθηκαν σε πρωτογενείς όγκους ορώδες OVCA, προτείνοντας ένα μικρό ρόλο για μεθυλίωση προαγωγού στον έλεγχο του

KIF14

γονιδιακής έκφρασης. ανάλυση της έκφρασης των miRNAs στο συμπέρασμα ότι το miR-93, miR-144 και miR-382 είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης στην πρωτοβάθμια ορώδες OVCA όγκους από φυσιολογικούς ιστούς? θεραπεία μιας κυτταρικής γραμμής OVCA με μιμείται και αναστολείς miRNA διαμορφωμένο ειδικά

KIF14

επίπεδα του mRNA, δείχνοντας το δυναμικό νέους μηχανισμούς του

KIF14

υπερέκφραση σε πρωτογενείς όγκους. Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν πολλαπλούς μηχανισμούς KIF14 ρύθμιση προς τα πάνω σε καρκινικά κύτταρα, προσφέροντας νέους στόχους για θεραπευτικές παρεμβάσεις για τη μείωση των KIF14 σε όγκους, με στόχο τη βελτίωση της πρόγνωσης

Παράθεση:. Theriault BL, Basavarajappa HD, Lim Η Pajovic S, Gallie BL, Corson TW (2014) Μεταγραφική και Επιγενετική κανονισμού του

KIF14

υπερέκφραση στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (3): e91540. doi: 10.1371 /journal.pone.0091540

Επιμέλεια: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Γαλλία

Ελήφθη: 21 του Ιουνίου 2013? Αποδεκτές: 13 του Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 13 Μαρτίου 2014

Copyright: © 2014 Theriault et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Άμυνας Βραβείο σταδιοδρομίας Ανάπτυξης των ΗΠΑ? χορηγούν # OC080083, και η επιστημονική Βραβείο Scholar Marsha Rivkin ωοθηκών Κέντρο Καρκίνου. Η εργασία αυτή υποστηρίζεται επίσης εν μέρει από την Ιντιάνα Κλινική και Μεταγραφική Επιστημών Ινστιτούτο χρηματοδοτείται εν μέρει από τις Ηνωμένες Πολιτείες Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, το Εθνικό Κέντρο για την Προώθηση της Μεταγραφική Επιστημών, Κλινική και Μεταγραφική Επιστημών Βραβείο (TR000163? TWC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

KIF14

εντοπίστηκε για πρώτη φορά ως ογκογονίδιο και συμβάλλει στην κακοήθη μετασχηματισμό στο ρετινοβλάστωμα καρκίνο της παιδικής ηλικίας [1]. Που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1q32.1, γονιδιωματική κέρδος

KIF14

παρατηρείται σε ποσοστό μέχρι 50% των ρετινοβλαστώματα [1] – [3]. Η ομάδα μας και άλλοι έχουν δείξει προηγουμένως ότι η πρωτεΐνη KIF14 και mRNA υπερεκφράζονται σε πολλούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων των ωοθηκών (όγκοι OVCA) [4] – [10]. Έχουμε, επίσης, ανέφερε ότι η συνολική έκβαση της OVCA ασθενείς ορώδες μπορεί να προβλεφθεί με βάση την

KIF14

επίπεδα έκφρασης του mRNA σε πρωτογενείς όγκους τους. Περαιτέρω ανάλυση αυτών των δειγμάτων έδειξε ότι η έκφραση του KIF14

mRNA και πρωτεΐνη

υπερβαίνουν τα αναμενόμενα επίπεδα με βάση το κέρδος αριθμού αντιγράφων και μόνο, προτείνοντας μια αυξητική ρύθμιση στο μεταγραφικό έλεγχο σε καρκινικά κύτταρα έναντι αντίστοιχες κανονικές αντίστοιχά τους.

υπάρχουν επί του παρόντος 45 ανθρώπινη κινεσίνες ταξινομούνται σε 14 ξεχωριστές οικογένειες. Στους ανθρώπους,

KIF14

είναι ένα μιτωτικής κινεσίνης που ανήκει στην οικογένεια Ν-3. Αν και κυτταρική λειτουργία της δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί πλήρως,

KIF14

διαδραματίζει ζωτικό ρόλο στην ολοκλήρωση της κυτοκίνησης, και μπορεί επίσης να λειτουργεί στον πρωτογενή cilium [11]. Αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη-ρυθμιστής της κυτοκίνησης 1 (PRC1) και κινάση κίτρου μέσω συγκεκριμένων τομέων για να υποστηρίξει τη σωστή κυτταρική διαίρεση [12], [13]. Φίμωση

KIF14

χρήση siRNA προκαλεί βλάβη κυτοκίνηση με αποτέλεσμα πολυπύρηνα κύτταρα, ανευπλοειδία, και την απόπτωση [12]. Μια προσωρινή συσσώρευση KIF14 πρωτεΐνης παρατηρείται στα μιτωτικά κύτταρα, σύμφωνα με τη λειτουργία του [12]. Δείξαμε πρόσφατα σε καρκινικά κύτταρα του μαστού γραμμές, άμεση αλληλεπίδραση του KIF14 με Radil, ένα κρίσιμο μεσολαβητή των Rap1a μεσολάβηση ιντεγκρίνης μέσα-έξω σηματοδότησης, έτσι τον έλεγχο της δραστηριότητάς Radil-Rap1a στην κυτταρική μεμβράνη και την προώθηση της κυτταρικής προσκόλλησης και της μετανάστευσης [14].

ότι η δομή και η λειτουργία των άλλων κινεσίνες είναι αρκετά καλά κατανοητοί, πολύ λιγότερα είναι γνωστά για ρύθμισή τους σε επίπεδο DNA. Μια μελέτη που περιγράφεται ρόλους των παραγόντων μεταγραφής Sp1 και E2F1 σε αντίστοιχα ενεργοποίηση και την καταστολή της μεταγραφής του ανθρώπινου μιτωτικής κεντρομερίδιο σχετιζόμενη κινεσίνης (MCAK) υποκινητή [15]. Δεν έχουν διεξαχθεί μελέτες έχουν ακόμα αναφερθεί στο

KIF14

. Η κατανόηση του μηχανισμού της ρύθμισης του γονιδίου της είναι ζωτικής σημασίας, καθώς

KIF14

αναδύεται ως ένα σημαντικό στόχο στη θεραπεία του καρκίνου.

Τώρα αναφέρουν ταυτοποίηση ενός υποθετικού

cis-ρυθμιστικών

περιοχή η

KIF14

υποστηρικτής υπόθαλψη θέσεις δέσμευσης για τους παράγοντες μεταγραφής

Sp1

,

ΥΥ1

και

HSF1

. Μέσω νοκ ντάουν και το chip δοκιμασίες siRNA, δείχνουμε ότι Sp1 και ΥΥ1, αλλά δεν HSF1 δεσμεύουν άμεσα με το

KIF14

υποκινητή και τον έλεγχο της ενδογενούς

KIF14

επίπεδα σε κυτταρικές σειρές OVCA. Επιπλέον, και τα δύο

Sp1

και

ΥΥ1

επίπεδα έκφρασης συσχετίζονται με

KIF14

έκφραση του mRNA στην πρωτοβάθμια ορώδες OVCA όγκους, αποδεικνύοντας πιθανός ρόλος τους στη διατήρηση υψηλών επιπέδων KIF14 στα καρκινικά κύτταρα OVCA . ανάλυση μεθυλίωσης αποκάλυψε ότι η ανθρώπινη

KIF14

υποκινητής είναι σε μεγάλο βαθμό μεθυλιωμένος εις OVCA πρωτογενείς όγκους, φυσιολογικούς ιστούς ωοθηκών, και κυτταρικές γραμμές, δεικνύοντας ότι η μεθυλίωση είναι απίθανο να ρυθμίσει

KIF14

υπερέκφραση εντός όγκων OVCA. Ωστόσο, ένα μοτίβο διαφορική μεθυλίωση μπορεί να υπάρχουν σε OVCA όγκους που εκφράζουν πολύ υψηλά KIF14.

ανάλυση της έκφρασης των miRNAs των πρωτογενών OVCA όγκους και κυτταρικές σειρές αποκάλυψε τρεις υποθετικές ρυθμιστικές αρχές (miR-93, miR-144 και miR-382) του

KIF14

έκφρασης που έχουν τεκμηριώσει ρόλους στην ογκογένεση σε καρκινικά κύτταρα. Έχουμε διαπιστώσει ότι οι εν λόγω υποψήφιος miRNAs θα μπορούσε άμεσα διαμορφώνουν

KIF14

έκφραση του mRNA, δείχνοντας τη σημασία τους στη διατήρηση αυξημένων επιπέδων KIF14 όγκου. Τα αποτελέσματά μας παρουσιάσει μια πολυπλοκότητα των ρυθμιστικών μηχανισμών οδήγησης

KIF14

υπερέκφραση σε OVCA όγκους, και υπογραμμίζουν τη σημασία της κατανόησης

KIF14

ρύθμιση με στόχο τελικά αυτό το γονίδιο για θεραπευτικό όφελος.

υλικά και Μέθοδοι

Κατασκευή λουσιφεράσης πλασμίδια

Δεκαέξι διαφορετικά μήκη του

KIF14

υποκινητή (548 bp, 966 bp, 1514 bp, 1666 bp, 1787 bp, 1898 bp, 2.032 bp, 2.150 bp, 2.245 bp, 2.327 bp, 2.366 bp, 2.401 bp, 2.466 bp, 2.536 bp, 2.898 bp, 4.555 bp) όλα έχουν κοινές ακολουθίες στο εγγύς άκρο τους ενισχύθηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) από γονιδιωματικό DNA των υγιών αμφιβληστροειδούς χρησιμοποιώντας ΚΩΔ Hot Start DNA πολυμεράση (Novagen) (Πίνακας S1). θραύσματα υποστηρικτής υποκλωνοποιήθηκαν σε StrataClone ™ Blunt PCR Cloning Vector pSC-Β (Stratagene) και επαληθεύονται για σωστή εισαγωγή και ο προσανατολισμός με πέψη περιορισμού. προϊόν PCR αποκόπηκε με την χρησιμοποίηση θέσεων περιορισμού Κρη1 /Sma1 και εισάγεται εντός pGL3-βασικό φορέα (Promega) σε συμπληρωματικές θέσεις ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης παράγει το ρεπόρτερ κατασκευάσματα pGL3-548, pGL3-966, pGL3-1514, pGL3-1666, pGL3 -1787, pGL3-1898, pGL3-2032, pGL3-2150, pGL3-2245, pGL3-2327, pGL3-2366, pGL3-2401, pGL3-2466, pGL3-2536, pGL3-2898 και pGL3-4555. Ακολουθίες των 16 κατασκευασμάτων ευθυγραμμισμένες με τις αλληλουχίες αναφοράς από την ιστοσελίδα NCBI. Το πλασμίδιο ρεπόρτερ pRSV-λουσιφεράση παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. A. Schimmer, Οντάριο Ινστιτούτο Καρκίνου.

Cell Culture

SKOV3 (ένα είδος δώρο από τον Δρ Μαρκ Nachtigal, Πανεπιστήμιο της Μανιτόμπα) [ ,,,0],16] και τα κύτταρα HeLa (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη /Ε-γλουταμίνη (P /S /G) (Invitrogen). OVCA 429 κύτταρα (Dr. Mark Nachtigal) [16] καλλιεργήθηκαν σε άλφα-ΜΕΜ που περιέχει 10% FBS και P /S /G. Weri-Rb1 κύτταρα ρετινοβλάστωμα (θετικός έλεγχος για σύνδεση Sp1) καλλιεργήθηκαν σε μέσον του Iscove τροποποιημένο κατά Dulbecco (ΙΜϋΜ) που περιέχει 10% FBS (εργαστήρια ΡΑΑ), P /S /G, 10 μg /mL ινσουλίνη, και 55 μΜ β-μερκαπτοαιθανόλη. Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 με υγρασία σε ένα επωαστή 37 ° C. ταυτότητα γραμμή κυττάρων επιβεβαιώθηκε από μικρή διαδοχική επανάληψη προφίλ.

Η επιμόλυνση των κατασκευών αναφοράς και siRNA

θρυψίνη κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 × 10

4 κύτταρα /mL. 24 ώρες μετά την σπορά, ίσες ποσότητες (0,5 μg) και των δύο ρεπόρτερ και του κυτταρομεγαλοϊού-β-γαλακτοσιδάσης (ρΟΜν-β-gal, Promega) κατασκευάσματα συνδιαμολύνθηκαν σε τριπλούν 12-φρεατίων χρησιμοποιώντας Juice Gene (Novagen). Για την αξιολόγηση της ενδογενούς επίδραση του παράγοντα μεταγραφής νοκ ντάουν στο

KIF14

επίπεδα, ένα σύνολο από 3 siRNAs (Sigma Aldrich) για

HSF1

,

Sp1

, και

ΥΥ1

διαμολύνθηκαν σε ποσότητα 0,5 nmol σε τρυβλία 60 mm. Οι αλληλουχίες στόχοι για κάθε siRNA που παρατίθενται στον Πίνακα S2. Οι επιμολύνσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

λουσιφεράση και β-γαλακτοσιδάση Δοκιμασία

Τα κύτταρα που συνεπιμολύνθηκαν με ανταποκριτή και ρΟΜν-β-gal κατασκευάσματα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και προσδιορίστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο της. Η δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε για δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης (που μετράται με υδρόλυση του χρωματομετρικού υποστρώματος ONPG [

O

-νιτροφαινυλ β-D-γαλακτοπυρανοσίδη], Sigma) και εκφράζεται ως σχετικό ποσοστό του ελέγχου pRSV-Luc.

Κλινικά δείγματα

Είκοσι έξι κατεψυγμένα δείγματα όγκου φρέσκο ​​OVCA, δέκα κατεψυγμένα κανονική μη νεοπλασματικά ωοθήκες από ασθενείς που υποβάλλονται σε ωοθηκεκτομή για μη ογκολογικές συνθήκες και τέσσερις κανονικές σαλπιγγικών ιστών επιθήλιο ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο Δίκτυο υγείας (UHN) Βιοτράπεζας. Το UHN Διοικητικό Συμβούλιο Δεοντολογίας Έρευνας ενέκρινε τη μελέτη των δειγμάτων ιστού και των σχετικών κλινικών δεδομένων (# 08-0884-ΤΕ), και όλοι οι ιστοί κλίση με τη γραπτή συγκατάθεση. Κλινικά δεδομένα που σχετίζονται με τα δείγματα UHN Βιοτράπεζα εξετάστηκαν από μια γυναικολογική ογκολόγου και γυναικολογικές παθολόγος για να εξασφαλίσει την ακεραιότητα και την ποιότητα των δεδομένων, καθώς και όλους τους ιστούς UHN Βιοτράπεζας (δίπλα H & amp? Ε χρώση διαφάνειες) εξετάστηκαν από γυναικολογικό παθολόγο για να εξασφαλίσει δείγματα περιείχαν & gt? 80 κύτταρα% του όγκου.

Real-time PCR

Εβδομήντα δύο ώρες μετά την επιμόλυνση με siRNA, κυτταρικές γραμμές συλλέχθηκαν και το ολικό RNA απομονώθηκε με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. OVCA όγκου και φυσιολογικών ωοθηκών και των σαλπίγγων επιθηλιακά RNAs απομονώθηκαν επίσης με αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Πρώτου κλώνου cDNA παρασκευάστηκε από 1 μg του συνολικού κυτταρικού RNA με 100 μΜ τυχαίων εξαμερών εκκινητών, 20 U RNase Αναστολέας RiboLock (Fermentas), και 200 ​​U Superscript II αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen) σε τελικό όγκο 20 μL. 1 μί συντίθεται cDNA προστέθηκε στο 1Χ TaqMan PCR κύριο μείγμα (ABI), και Έκφραση Δοκιμασία 1Χ TaqMan Gene μίγμα εκκινητή-ανιχνευτή για

KIF14

(Hs00978216_m1),

Sp1

(Hs00916521_m1),

ΥΥ1

(Hs00231533_m1), και

HSF1

(Hs01027608_g1). Η μέση έκφραση των τριών γονιδίων καθαριότητας χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος:

TBP

(δεσμευτική Tata-box πρωτεΐνης, Hs_99999910_m1),

HPRT

(υποξανθίνη φωσφοροριβοσυλ-τρανσφεράσης, Hs99999909_m1) και

GAPDH

(αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης, Hs99999905_m1). Εις τριπλούν αντιδράσεις διεξήχθησαν για κάθε γονίδιο και κάθε δείγμα, και PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα 7900HT SDS (ΑΒΙ) όπως περιγράφεται [8]. SDS 2.1 λογισμικό (ΑΒΙ) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των τιμών σχετική έκφραση ΔΔCt, κανονικοποιημένη προς ενδογενή γονίδια ελέγχου και σε σχέση με είτε φορέα ελέγχου (για κυτταρική γραμμή siRNA επιμολύνσεις) ή έκφραση κανονικών δειγμάτων ωοθήκης και των σαλπίγγων επιθηλιακού ιστού (για μετρήσεις ιστού).

Ανάλυση Western Blot

Εβδομήντα δύο ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 20 mM Tris HCl ρΗ 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ (EDTA), 1% Triton Χ-100, και η πρωτεάση αναστολείς απροτινίνη, λευπεπτίνη, και phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF). Ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε με δοκιμασία Bradford (BioRad). 30 μg φορτώθηκε σε μια 4-12% κλίση SDS-PAGE προκατασκευασμένα γέλη (Lonza) και μεταφέρθηκε σε ένα διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) και αποκλείστηκαν με 5% BLOTTO (BioRad) σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris-0,05% Tween-20 ( TBST). Πρωτογενή αντισώματα έναντι KIF14 (Bethyl), Sp1, ΥΥ1 και HSF1 (Abcam) και β-τουμπουλίνης (Sigma) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση έκφρασης ενδογενούς πρωτεΐνης. Σημασμένη με υπεροξειδάση αρμορακίας δευτερογενή αντισώματα (Chemicon) ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας (Denville) και επωάστηκαν με φωτογραφικό φιλμ (Denville). μετρήσεις της έντασης του σήματος υπολογίστηκαν με τη χρήση του Photoshop CS3.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Δοκιμασία

δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν με την Imprint® χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση Kit (Sigma) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 × 10

5 κύτταρα καλλιεργήθηκαν, και τα σύμπλοκα πρωτεΐνης-ΟΝΑ με σταυροειδείς δεσμούς με 1% φορμαλδεΰδη (τελική συγκέντρωση), ακολουθούμενη από την πυρηνική κλασματοποίηση και DNA διάτμηση μέσω υπερήχων. Ανοσοκαθιζήσεις εκτελέστηκαν για 90 λεπτά σε RT με αντισώματα έναντι Sp1, ΥΥ1, HSF1 (Abcam), RNA πολυμεράση II (θετικός έλεγχος) και IgG (αρνητικός έλεγχος). Οι διασυνδέσεις αντιστράφηκαν, DNA εκχυλίστηκε και χρησιμοποιήθηκε τόσο για τελικό σημείο και σε πραγματικό χρόνο PCR. Endpoint PCR πραγματοποιήθηκε σε 25 αντιδράσεις μι με ΚΩΔ Hot Start DNA πολυμεράσης (Novagen) και το κατάλληλα σχεδιασμένο ζεύγος εκκινητών (αλληλουχία υποκινητή στόχος: Προώθηση: ΤΤΑ ΥΠΑ TGT GAA GTC TTC gat GTA? Αντίστροφη: CTC TAC TCC, CAC CCC GC? RNA Pol II αλληλουχίας στόχου: hGAPDH-Forward: CAA TTC CCC ATC TCA GTC gt? hGAPDH-Reverse: ετικέτα CCG tag GGC ΚΔ πράξη tt, 246 bp). Οι συνθήκες PCR είχαν ως εξής: 95 ° C για 2 λεπτά ακολουθούμενο από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, αναδιάταξη στους 58 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και στη συνέχεια μια τελική παράτασης 72 ° C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. μετρήσεις της έντασης του σήματος υπολογίστηκαν με τη χρήση του Photoshop CS3. Real time PCR πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν με τη χρήση 1 μι ϋΝΑ τσιπ ανά αντίδραση, μαζί με 1Χ TaqMan Master Mix (ΑΒΙ), 500 ηΜ από κάθε εκκινητή και 250 ανιχνευτή ηΜ. Αστάρια ήταν Forward: TGA CAC CCA CTT CAA CGA gg και αντίστροφη: TCT CTG ΑΑΤ GCT GGA CTC GC, και ο ανιχνευτής ήταν CAC GCT TTA GCA GAA CCC gag gag, επισημαίνονται με FAM και ZEN σβέσης (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, ΗΠΑ). Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας πρότυπες παραμέτρους σε ένα όργανο ViiA7 (Life Technologies). τιμές Ct κανονικοποιήθηκαν με δείγματα IgG και η σχετική ποσότητα (RQ) που υπολογίζεται σύμφωνα με το RQ = 2

-ΔCt.

σύνθεση miRNA cDNA και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Σύνολο εκχύλισης RNA ήταν πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται παραπάνω. Ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ σύνθεσης cDNA miRNA (TaqMan® microRNA Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκε για την αντίστροφη μεταγραφή των υποψήφιων miRNAs με ειδικούς εκκινητές RT (TaqMan® miRNA Δοκιμασίες, Applied Biosystems). δοκιμασίες Sequence-ειδική (TaqMan® πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασίες, Applied Biosystems, Πίνακας S3) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ώριμη υποψήφιος miRNAs από εκχυλίσματα ιστού πρωτογενούς όγκου.

RNU44

, ένα μικρό μη κωδικοποιητικού RNA με ευρεία και σταθερή κατανομή ιστού (Applied Biosystems), χρησιμοποιήθηκε ως το ενδογενές ελέγχου. Εις τριπλούν αντιδράσεις διεξήχθησαν για κάθε γονίδιο και κάθε δείγμα, και PCR εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα 7900HT SDS (ΑΒΙ) όπως περιγράφεται [8]. SDS 2.1 λογισμικό (ΑΒΙ) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των τιμών σχετική έκφραση ΔΔCt, κανονικοποιημένη σε ενδογενείς ελέγχου (

RNU44

) και σε σχέση με την έκφραση των φυσιολογικών ωοθηκών και των σαλπίγγων δείγματα επιθηλιακού ιστού (για μετρήσεις ιστό όγκου) ή κύτταρα IOSE (για κυτταρικές γραμμές OVCA).

miRNA μιμείται και αναστολείς

κύτταρα SKOV3 σε τρυβλία 12 φρεατίων επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ miR93, miR144 και miR382 μιμείται ή αναστολείς ή αντίστοιχα μη-κωδικοποίησης ελέγχου μιμούνται ή αναστολέα (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας 3 μΙ Lipofectamine 2000 (Invitrogen) αντιδραστήριο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 72 ώρες επιμόλυνσης, ολικό RNA απομονώθηκε και cDNA συντίθεται όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα επίπεδα έκφρασης του KIF14 και miRNAs ενδιαφέροντος αναλύθηκαν όπως παραπάνω, με qPCR πραγματοποιείται με τη χρήση ™ 7 πραγματικού χρόνου σύστημα PCR Applied Biosystems VIIa. Οι σχετικές τιμές έκφρασης (RQ) του KIF14 ή miRNAs κανονικοποιημένη σε ενδογενή γονίδια ελέγχου και σε σχέση με τον έλεγχο της θεραπείας υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας VIIa ™ 7 έκδοση 1.2 του λογισμικού.

Η μεθυλίωση ανάλυση

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από πρωτεύοντες ιστούς όγκου OVCA και φυσιολογικούς ελέγχους ωοθήκη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Γονιδιωματικό DNA (200 ng) τροποποιήθηκε και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο kit όξινου θειώδους τροποποίηση (Imprint® DNA Τροποποίηση Kit, Sigma) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ένα νησί CpG εντοπίστηκε (https://cpgislands.usc.edu/) εντός του 4500 bp

KIF14

περιοχής του υποκινητή (-2371 έως -1.129) (Σχήμα S1 Α), και μεθυλίωσης-ειδικούς εκκινητές (-120 bp) κατά το μεγαλύτερο νησί CpG εντός του

KIF14

υποκινητή με τη χρήση του λογισμικού online Methprimer σχεδιάστηκαν (https://www.urogene.org/methprimer/) (Σχήμα S1B). Primer αλληλουχίες ήταν ως εξής: Methylated ειδικά: Εμπρός: ΑΤΤ ΤΑΑ ΑΓΓ GGG ΤΤΑ AGT ΤΤΤ ACGT? Αντίστροφη: GAT ΑΑΤ ΤΑΑ πράξη CCG ΑΤΑ ACC GTC? Μη μεθυλιωμένα-ειδικά: Εμπρός: ΑΤΤ ΤΑΑ ΑΓΓ GGG Γ.Ο.Σ. AGT ΤΤΤ atgt? Αντίστροφη: CAA ΤΑΑ ΤΤΑ AAC τουρκοκυπριακή κοινότητα ΑΑΤ AAC catc. Ένα τέταρτο του καθαρισμένου όξινου θειώδους επεξεργασμένο DNA (5 μι ενός εκλούσματος 20 μί) χρησιμοποιήθηκε στην αντίδραση μεθυλίωσης PCR. Τελικό σημείο αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν σε 25 μL τελικό όγκο με Maxima Hot Start Taq πολυμεράσης (Fermentas). Οι συνθήκες PCR είχαν ως εξής: 94 ° C για 3 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, αναδιάταξη στους 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και στη συνέχεια μια τελική παράτασης 72 ° C για 10 λεπτά. Προϊόντα (-120 bp) έγιναν ορατά με χρήση ηλεκτροφόρησης πηκτής αγαρόζης. Πυκνομετρία διεξήχθη σε κλίμακα του γκρι εικόνες χρησιμοποιώντας Image J. Επαλήθευση της όξινου θειώδους μετατροπή του DNA διεξήχθη με μη τροποποιημένο calponin-ειδικούς εκκινητές (Σχήμα S2) όπως περιγράφεται [17].

Στατιστική Ανάλυση

Έκφραση τιμές (δραστικότητα λουσιφεράσης, mRNA, miRNA ή έκφραση πρωτεΐνης) αξιολογήθηκαν μεταξύ φυσιολογικούς ελέγχους ιστού και ιστούς όγκων OVCA, ή ελέγχων και αγωγή ομάδες χρησιμοποιώντας ζευγαρωμένα ή unpaired t-tests. έκφραση KIF14 μετά miRNA αναστολέα /μιμητικό αγωγή αναλύθηκε με μονόδρομη ANOVA. Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, όλες οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism 4.0. Οι συσχετίσεις μεταξύ των

KIF14

κερδίσει εναντίον

KIF14

κανένα κατηγορίες κέρδος και

Sp1

,

ΥΥ1

και

HSF1

έκφραση του mRNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Συντελεστής συσχέτισης του Pearson (r).

Αποτελέσματα

Αναγνώριση ενός

KIF14

cis ρυθμιστική περιοχή σε κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών

μια περιοχή 4500 bp του γενωμικού DNA αμέσως ανοδικά του ανθρώπινου

KIF14

μεταγραφική θέση έναρξης ενισχύθηκε από κανονικό ανθρώπινο DNA, και διαγραφής ρεπόρτερ αναλύσεις διεξήχθησαν με κλωνοποίηση διαδοχικά μικρότερες περιοχές του

KIF14

προαγωγέα στον pRSV-Luc υποστηρικτής περιοχή. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σε κύτταρα OvCa429, SKOV3 και HeLa, και δραστικότητα προαγωγού υπολογίζεται σε σχέση με την έκφραση pRSV-Luc (ρυθμισμένη στο 100%). Ολόκληρη η κατασκευή περιοχή υποκινητή (pGL3-4555) έδειξε λουσιφεράσης δραστηριότητα κοντά σε εκείνη του θετικού μάρτυρα (pRSV-Luc). Ένα άκρως ενεργό περιοχή ταυτοποιήθηκε μεταξύ -2366 και -2245 bp, αποδεικνύοντας παρόμοια δραστηριότητα με το κατασκεύασμα πλήρους προαγωγέα, αλλά σημαντικά μεγαλύτερη δραστηριότητα λουσιφεράσης σε σύγκριση με όλες τις άλλες δομές διαγραφής για όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές (Ρ & lt? 0,05, Εικόνα 1). Βιοπληροφορική ανάλυση της δραστικής αυτής περιοχής μέσω της online λογισμικό ανάλυσης (Genomatix) προσδιορίζονται υποθετικό παράγοντα μεταγραφής θέσεις για δέσμευση

Sp1

,

ΥΥ1

και

HSF1

(Σχήμα 1), γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία ενός ενδεχόμενου

cis

ρυθμιστική περιοχή εντός της

KIF14

υποκινητή.

μορφώματα διαγραφής Promoter συγχωνευμένο με λουσιφεράσης δοκιμάστηκαν για δραστικότητα σε κύτταρα HeLa, SKOV3 και OvCa429. pRSV-Luc, θετικός έλεγχος, 0, κενό φορέα ελέγχου. Οι αριθμοί είναι ζεύγη βάσεων σε σχέση με τη θέση μεταγραφικής έναρξης (0). Βιοπληροφορική ανάλυση (Genomatix) της πιο ενεργή περιοχή εντός του

KIF14

υποκινητή (-2366 με -2245) εντοπίζονται πιθανές θέσεις πρόσδεσης για μεταγραφικούς παράγοντες ΥΥ1, HSF1 και Sp1. Οι θέσεις αναγνώρισης Ειδικά παράγοντα μεταγραφής υπογραμμισμένες, και το διάστημα μέσα αλληλουχία υποδηλώνει τοποθεσία κατασκευασμάτων διαγραφής. Ν = 3, * σημαντικότητας στο

P

& lt? 0,05, unpaired t-test.

P

= 0,01 (HeLa)?

P

= 0,01 (SKOV3)?

P

= 0,03 (OvCa429).

Η

Sp1 και ΥΥ1 ενδογενώς ρυθμίζουν την έκφραση KIF14 σε κυτταρικές σειρές OVCA

Δοκιμάσαμε το εάν αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής που επηρεάζονται

KIF14 έκφραση

mRNA με siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν της ενδογενούς

Sp1

,

HSF1

και

ΥΥ1

στα κύτταρα SKOV3 και OvCa429. Παροδική νοκ ντάουν οδήγησε σε σημαντική μείωση του μεταγραφικού παράγοντα (

Sp1

,

HSF1

,

ΥΥ1

) mRNA (Σχήμα 2Α, Β). Ενώ νοκ ντάουν του

HSF1

δεν είχε σημαντική επίδραση στο

KIF14

γονιδιακής έκφρασης,

Sp1

και

ΥΥ1

νοκ ντάουν οδήγησε σε σημαντικά μειωμένη

KIF14

mRNA, γεγονός που υποδηλώνει ότι τόσο Sp1 και ΥΥ1 δρουν ως ενισχυτές της

KIF14

μεταγραφή. Σε απάντηση προς

Sp1

και

ΥΥ1

knockdown, μία μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης του παράγοντα μεταγραφής και συνδέονται KIF14 πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε μέσω ανοσοκηλίδων (Σχήμα 3) σε κύτταρα SKOV3. Ενώ τα επίπεδα πρωτεΐνης HSF1 μειώθηκε σε απόκριση προς knockdown, καμία σημαντική αλλαγή στην πρωτεϊνική έκφραση KIF14 παρατηρήθηκε. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για OvCa429 κύτταρα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι

Sp1

και

ΥΥ1

μπορεί να ελέγχει την έκφραση του

KIF14

σε κυτταρικές σειρές OVCA. Η μείωση της KIF14 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε απόκριση σε Sp1 knockdown ήταν μικρότερη απ ‘ότι με ΥΥ1 knockdown, και θα μπορούσε πιθανόν να σχετίζεται με την αποτελεσματικότητα του παράγοντα μεταγραφής knockdown (Σχήμα 2Α, Β και Σχήμα 3Α, Β). Η μείωση του

KIF14

mRNA και της πρωτεΐνης ήταν πιο έντονη σε απάντηση

ΥΥ1

νοκ ντάουν, γεγονός που υποδηλώνει ότι ΥΥ1 μπορεί να είναι ένας σημαντικός παράγοντας στη ρύθμιση του

KIF14

υπερέκφραση σε αυτές κύτταρα.

siRNA νοκ ντάουν της ενδογενούς

Sp1

(πορτοκαλί),

HSF1

(πράσινο), και

ΥΥ1

(κόκκινο) παράγοντες μεταγραφής, και μέτρηση της έκφρασης mRNA τους, μαζί με τις αντίστοιχες

KIF14

επίπεδα του mRNA (μπλε) μέσω πραγματικού χρόνου PCR σε ένα SKOV3 και Β OvCa429 κύτταρα. Υ-άξονες: κανονικοποιημένη έκφραση του mRNA σε σχέση με Mock. GL2, τον έλεγχο siRNA? Ν = 3, * σημαντικότητας στο

P

& lt? 0,05, unpaired t-test. Τρία διαφορετικά μόρια siRNA (Α, Β, Γ) χρησιμοποιήθηκαν για να γκρεμίσουμε κάθε γονίδιο. τιμές P για τον πίνακα Α (κύτταρα SKOV3):

P

= 0,02 για την έκφραση Sp1 (πορτοκαλί) με SP1 siRNAs Α, Β, και Γ?

P

= 0,03 (siRNA-Α),

P

= 0,047 (siRNA-Β),

P

= 0.04 (siRNA-C) για KIF14 έκφρασης (μπλε) .

P

= 0,001 για την έκφραση HSF1 (πράσινο) με HSF1 siRNAs Α, Β, και Γ?

P

= 0,23 (siRNA-Α),

P

= 0,12 (siRNA-Β),

P

= 0,4 (siRNA-C) για την έκφραση KIF14 (μπλε) .

P

= 0,01 για την έκφραση ΥΥ1 (κόκκινο) με ΥΥ1 siRNAs Α, Β και Γ?

P

= 0,006 για την έκφραση KIF14 (μπλε) με τιμές ΥΥ1 siRNAs Α, Β, και Γ P για τον πίνακα Β (κύτταρα OvCa429):

P

= 0,03 για Sp1 έκφρασης (πορτοκαλί) με SP1 siRNAs Α, Β, και Γ?

P

= 0,05 (siRNA-Α),

P

= 0.04 (siRNA-Β),

P

= 0,045 (siRNA-C) για την έκφραση KIF14 (μπλε) .

P

= 0,003 για την έκφραση HSF1 (πράσινο) με HSF1 siRNAs Α, Β, και Γ?

P

= 0,31 (siRNA-Α),

P

= 0.45 (siRNA-Β),

P

= 0,39 (siRNA-C) για KIF14 έκφρασης (μπλε) .

P

= 0.02 (siRNA-Α),

P

= 0.01 (siRNA-Β),

P

= 0,01 για την έκφραση ΥΥ1 (κόκκινο)?

P

= 0.02 (siRNA-Α),

P

= 0.001 (siRNA-Β),

P

= 0,006 (siRNA-C) για την έκφραση KIF14 (μπλε) .

Η

Ένα siRNA νοκ ντάουν των ενδογενών Sp1 (πορτοκαλί), HSF1 (πράσινο), και ΥΥ1 (κόκκινο) παράγοντες μεταγραφής, και μέτρηση της έκφρασης πρωτεϊνών τους, μαζί με τα αντίστοιχα επίπεδα της πρωτεΐνης KIF14 (μπλε) με ανοσοαποτύπωση σε κύτταρα SKOV3. x-άξονας: κανονικοποιημένη έκφραση της πρωτεΐνης σε σχέση με Mock. Β Εκπρόσωπος ανοσοκηλίδα KIF14 και της έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν κανονικοποιημένες τιμές έκφρασης για το πείραμα που παρουσιάζεται. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με OvCa429 κύτταρα. GL2, τον έλεγχο siRNA? Ν = 3? *,

P

& lt? 0,05 για την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα? #,

P

& lt? 0,05 για έκφραση KIF14, unpaired t-test.

P

τιμές του πίνακα Α (κύτταρα SKOV3):

P

= 0,009 (siRNA-Α),

P

= 0.003 (siRNA-Β),

P

= 0.006 (siRNA-C) για την έκφραση Sp1 (πορτοκαλί)?

P

= 0,005 (siRNA-Α),

P

= 0,007 (siRNA-Β),

P

= 0,004 (siRNA-C) για την έκφραση KIF14 (μπλε) .

P

= 0,01 για την έκφραση HSF1 (πράσινο) με HSF1 siRNAs Α, Β, και Γ?

P

= 0,54 (siRNA-Α),

P

= 0,65 (siRNA-Β),

P

= 0,41 (siRNA-C) για KIF14 έκφρασης (μπλε) .

P

= 0,001 για την έκφραση ΥΥ1 (κόκκινο) με ΥΥ1 siRNAs Α, Β και Γ?

P

= 0.01 (siRNA-Α),

P

= 0.02 (siRNA-Β),

P

= 0,005 (siRNA-C) για την έκφραση KIF14 (μπλε) .

η

Για να επαληθευθεί αν Sp1 και ΥΥ1 θα μπορούσε να συνδέσει άμεσα με το

KIF14

υποκινητή, immunoprecipiation χρωματίνης (chip) θα δοκιμασίες διεξήχθησαν σε κύτταρα SKOV3, OvCa429 και HeLa. Βρήκαμε ότι τόσο Sp1 και ΥΥ1, αλλά όχι HSF1 εμφάνισαν μια πολύ υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης με τον

KIF14

περιοχή υποκινητή από τον έλεγχο IgG (υψηλότερες τιμές σχετικής έκφρασης? Σχήμα 4). OvCa429 κύτταρα έδειξαν τη μεγαλύτερη εμπλουτισμό των δεσμευτικών για τόσο Sp1 και ΥΥ1 (πάνω από 10 φορές? Εικόνα 4Α, Β), ενώ SKOV3 και HeLa κύτταρα έδειξαν πιο μέτρια εμπλουτισμού (κατά μέσο όρο 4 φορές? Εικόνα 4Α, Β). Η δέσμευση του HSF1 με τον υποκινητή KIF14 ήταν πολύ μικρότερη (κατά μέσο όρο 2 φορές για όλες τις κυτταρικές σειρές? Σχήμα 4C). Εμπλουτισμός στο SP1 και ΥΥ1 δέσμευση αποδείχθηκε επίσης μέσω καταληκτικό σημείο της PCR (Σχήμα S3). Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματα του mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης μας, δείχνοντας ότι τόσο Sp1 και ΥΥ1 μπορεί να συνδεθεί άμεσα με το

KIF14

υποκινητή. Σε συνδυασμό, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι Sp1 και ΥΥ1 μπορεί ενδογενώς ρύθμιση

KIF14

έκφραση σε κυτταρικές σειρές OVCA.

δοκιμασίες τσιπ ενδογενούς ΥΥ1, Sp1 και HSF1 ακολουθείται από PCR σε πραγματικό χρόνο με το

KIF14

περιοχή υποκινητή (-2 300 έως -2,133) σε κυτταρικές γραμμές SKOV3, OvCa429, και HeLa σε σύγκριση με IgG (αρνητικός έλεγχος). Τιμές αντιπροσωπεύουν μέση ποσότητα περιοχής του υποκινητή του προϊόντος σε σχέση με τον έλεγχο IgG. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση των προσδιορισμών εις τριπλούν.

Η

Sp1 και ΥΥ1 υπερέκφραση συσχετίζεται με KIF14 υπερέκφραση

Έχουμε τεκμηριωθεί προηγουμένως γονιδιωματικής κέρδος του

KIF14

σε έως και 30 % της πρωτογενούς OVCA όγκων που συσχετίζεται με πολύ υψηλή υπερέκφραση του

KIF14

mRNA (

KIF14

HIGH) [8]. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η γονιδιωματική κέρδος είναι ένας μηχανισμός μέσω του οποίου

KIF14

υπερεκφράζεται σε αυτούς τους όγκους. Για να καθοριστεί εάν

KIF14

υπερέκφραση στους όγκους OVCA θα μπορούσε επίσης να συνδέεται με τη μεταγραφική ρύθμιση, μετρήσαμε την έκφραση του mRNA της

Sp1

,

ΥΥ1

και

HSF1

σε ένα υποσύνολο των καρκινικών ιστών OVCA με (15 δείγματα) και χωρίς (50 δείγματα)

KIF14

γονιδιωματική κέρδος. Σε OVCA όγκους χωρίς γονιδιωματικής κέρδος (50), που διχοτομήθηκε τα δείγματα σε δύο ομάδες με βάση τη μέση τιμή της έκφρασης, είτε σε

KIF14

HIGH ή

KIF14

ΧΑΜΗΛΗ ομάδες, όπως έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν [8]. Πολλά από τα 19

KIF14

HIGH OVCA όγκων εκφράζεται σημαντικά υψηλότερα επίπεδα

Sp1

και

ΥΥ1

mRNA (Σχήμα 5) από εκείνες με

KIF14

ΧΑΜΗΛΗ υπερέκφραση (31), υποδηλώνοντας δυνητικό ρόλους για Sp1 και ΥΥ1 να διατηρήσει υψηλό

KIF14

επίπεδα στους όγκους.

HSF1

mRNA επίπεδα ήταν παρόμοια σε όλες τις OVCA όγκους, έτσι είναι λιγότερο πιθανό να είναι σημαντική στη ρύθμιση

KIF14

mRNA. Η μέση

ΥΥ1

επίπεδο έκφρασης στην πρωτοβάθμια OVCA όγκους είναι πολύ υψηλότερο από το μέσο όρο

Sp1

επίπεδο έκφρασης? μαζί με το

ΥΥ1

knockdown δεδομένα σε κυτταρικές γραμμές (Σχήματα 2 και 3), αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ΥΥ1 είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής του KIF14 υπερέκφραση σε OVCA όγκους. Προς υποστήριξη αυτού, μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της

KIF14

και

Sp1

ή

ΥΥ1

έκφρασης, υπήρχαν ενώ κανένας για

HSF1

(Πίνακας 1 και το Σχήμα S4D-F). Όγκοι με KIF14 γονιδιωματική κέρδος δεν έδειξαν συσχέτιση του παράγοντα μεταγραφής (Πίνακας 1 και Σχήμα S4A-C), επιβεβαιώνοντας ότι γονιδιωματική κέρδος είναι ο μηχανισμός που ελέγχει

KIF14

υπερέκφραση σε αυτούς τους όγκους. Είναι ενδιαφέρον ότι, ένα ποσοστό (περίπου 40%) του

KIF14

HIGH όγκων έδειξε

Sp1

και

ΥΥ1

έκφραση κοντά στα φυσιολογικά επίπεδα ιστού (Σχήμα 5), περαιτέρω εμπλέκοντας άλλους βιολογικούς μηχανισμούς που μπορούν να επιφέρουν τον έλεγχο

KIF14

υπερέκφραση σε όγκους OVCA.

Η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του mRNA των πρωτογενών OVCA όγκων με

KIF14

HIGH (κόκκινο) και <