Αφηρημένο

Ιστορικό

Διπλά ειδικά Τ κυττάρων εμπλοκέα (BiTE

®) είναι κατασκευάσματα διπλής ειδικότητας αντίσωμα μονής αλυσίδας με διπλή εξειδίκευση για CD3 επί Τ κυττάρων και ένα επιφανειακό αντιγόνο επί των κυττάρων-στόχων. Μπορούν να προκαλέσουν ένα πολυκλωνικό κυτταροτοξική Τ κυτταρική απόκριση που δεν περιορίζεται από τον υποδοχέα Τ κυττάρων (TCR) ειδικότητα, και επιφανειακή έκφραση του MHC τάξης Ι /συμπλέγματα αντιγόνου πεπτιδίου. Χρησιμοποιώντας ανθρώπινο EpCAM /CD3-δι-ειδικά BiTE

® αντίσωμα κατασκευάσει AMG 110, εμείς εδώ αξιολογείται με ό, τι επιφανειακή έκφραση έκταση της PD-L1, κυτταροπλασματική έκφραση του ινδολοαμίνης-2,3-deoxygenase τύπου 1, Bcl-2 και σερπίνης ΡΙ- 9, και η παρουσία του αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης βήτα (ΤΟΡ-β), την ιντερλευκίνη-10 (IL-10) και αδενοσίνη σε μέσο καλλιέργειας μπορεί να επηρεάσει ανακατευθυνόμενους λύση από AMG 110-ασχολούνται Τ κύτταρα.

Μέθοδοι

Οι επτά παράγοντες, οι οποίοι όλοι συμμετέχουν στην αναστολή λειτουργιών των κυττάρων Τ από τα καρκινικά κύτταρα, ελέγχθηκαν με ανθρώπινο EpCAM εκφράζουν ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (CHO) κύτταρα στόχους σε επίπεδα που στις περισσότερες περιπτώσεις υπερέβησαν εκείνα που παρατηρήθηκαν σε έναν αριθμό ανθρώπινων καρκινικές κυτταρικές σειρές. πειράματα συν-καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η επίδραση των μηχανισμών της φοροδιαφυγής στην ΕΚ

50 τιμές και το εύρος των ανακατεύθυνση λύσης με AMG 110, και για BiTE

®-επαγόμενο πολλαπλασιασμό των προηγουμένως αναπαύεται ανθρώπινα περιφερικά Τ-λεμφοκύτταρα.

Εκτίμηση

Μία ανασταλτική επίδραση επί κατευθυνθούν λύση από AMG 110-ασχολούνται Τ κυττάρων παρατηρήθηκε κατά την υπερέκφραση του σερπίνης ΡΙ-9, Bcl-2, ΤΟΡ-βand PD-L1. Μία ανασταλτική επίδραση στην επαγωγή του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων παρατηρήθηκε μόνο με κύτταρα CHO που υπερεκφράζουν IDO. Σε καμία περίπτωση, ένα ενιαίο μηχανισμό που παρέχονται κύτταρα-στόχους φοροδιαφυγής απολύτως ανθεκτικά να δαγκώσει

® που προκαλείται από τη λύση, ακόμα και διάφοροι συνδυασμοί δεν θα μπορούσε.

Συμπεράσματα

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η διαφοροποιημένη μηχανισμοί που χρησιμοποιήθηκαν από τα καρκινικά κύτταρα για να αποκρούσει τα Τ κύτταρα δεν μπορούν να αδρανοποιήσουν AMG 110, που ασχολούνται Τ κύτταρα, και ότι οι ανασταλτικές επιδράσεις που παρατηρήθηκαν

in vitro

μπορεί να ξεπεραστεί με αυξημένες συγκεντρώσεις του τσιμπήματος

® κατασκεύασμα αντισώματος.

Παράθεση: Deisting W, Raum Τ, Kufer P, Baeuerle PA, Münz Μ (2015) Επίδραση της Διαφορετικές ανοσοποιητικού Evasion Μηχανισμοί των καρκινικών κυττάρων σε κύτταρα Τ ασχολούνται με EpCAM /CD3-αντίσωμα διπλής ειδικότητας Κατασκευάστε AMG 110. PLoS ONE 10 (10 ): e0141669. doi: 10.1371 /journal.pone.0141669

Επιμέλεια: Lucienne Chatenoud, Université Paris Descartes, Γαλλία

Ελήφθη: 26, Ιανουαρίου 2015? Αποδεκτές: 12 Οκτωβρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 28 Οκτ 2015

Copyright: © 2015 Deisting et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η χρηματοδότηση της μελέτης αυτής έχει προμηθευτεί από την Amgen Inc., μια δημόσια εισηγμένη εταιρεία που παρείχε στήριξη με τη μορφή των μισθών για τους συγγραφείς WD, TR, PK και MM, αλλά δεν έχουν κανένα πρόσθετο ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. AMGEN υποστήριξε αυτή την μελέτη, ωστόσο, λόγω του έχουν συμφέρον από τα αποτελέσματα της έρευνας αυτής. MPM Capital παρέχεται υποστήριξη με τη μορφή ενός μισθού για συγγραφέα PAB, ο οποίος ήταν πρώην απασχολούνται από την Amgen Ερευνών του Μονάχου, αλλά δεν είχε καμία πρόσθετη ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Οι συγκεκριμένοι ρόλοι του συγγραφέα αρθρώνεται στο τμήμα «συγγραφέας εισφορές»

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η χρηματοδότηση της μελέτης αυτής έχει προμηθευτεί από την Amgen Inc., τον εργοδότη της Wibke Deisting, Tobias Raum, Peter Kufer και Markus Münz και ο πρώην εργοδότης του Patrick A. Baeuerle ο οποίος σήμερα εργάζεται από MPM Capital. Όλοι οι συγγραφείς έχουν θέσεις της καθαρής θέσης της εταιρείας. AMGEN εστιάζεται στην ανάπτυξη αντισωμάτων BiTE για τη θεραπεία των κακοήθων νόσων. AMGEN είναι ο δημιουργός του AMG 110. Εκτός από την AMG 110, που χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη αυτή η πλατφόρμα BiTE κατέχει άλλα μόρια BiTE σε εξέλιξη και έχει ένα προϊόν που διατίθεται στο εμπόριο ονομάζεται BLINCYTO. Οι συγγραφείς Tobias Raum, Peter Kufer, Markus Münz και Patrick A. Baeuerle κατέχουν διάφορες ευρεσιτεχνίες που αφορούν την πλατφόρμα δάγκωμα, συμπεριλαμβανομένου ενός διπλώματος ευρεσιτεχνίας για AMG 110. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών , όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Θεραπείες εμπλοκή κυτταροτοξικών Τ κυτταρική απόκριση του ασθενούς έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικά τη θεραπεία και τελικά να θεραπεύσει τον καρκίνο. Για παράδειγμα, η θετή μεταφορά των ex-vivo επεκταθεί όγκο κάτοικος Τ κυττάρων [1], η αναστολή της ανοσολογικής διαφυγής από το PD-1 /PD-L1 άξονα με μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) [2], ενδοτραυματική έγχυση ενός ογκολυτικού ιός [3], ή την ενίσχυση της διαφοροποίησης των Τ κυττάρων και καταστρέφουν ρυθμιστικά Τ κύτταρα από CTLA-4-ανταγωνιστική mAbs [4] έχουν όλες δείξει μερική και πλήρη ανταπόκριση στα τέλη του σταδίου μελάνωμα, μια θετική επίδραση στην εξέλιξη της δωρεάν ή συνολική επιβίωση, και μακροπρόθεσμη ύφεση αν δεν θεραπεύει σε ένα μικρό ποσοστό ασθενών. Επί του παρόντος, τα ποσοστά ανταπόκρισης από αυτές τις προσεγγίσεις περιορίζονται, η οποία είναι ο λόγος για εκτεταμένα προγράμματα βιοδείκτη στοχεύουν στην κατανόηση της αντίστασης και πολλαπλές κλινικές προγράμματα ψάξετε συνδυασμούς δυνητικά αύξηση των ποσοστών ανταπόκρισης και μακροπρόθεσμο όφελος. Όλες οι παραπάνω προσεγγίσεις επιτρέπουν την παραγωγή, την επέκταση και συστημική εξάπλωση του Τ κυττάρου κλώνων όγκου-ειδικά που αναγνωρίζουν τα καρκινικά κύτταρα με την ειδική MHC κατηγορίας τους Ι /πεπτιδίου.

BiTE

® κατασκευάσματα αντισώματος εμπλέκονται κυτταροτοξικά Τ κύτταρα από ένα ριζικά διαφορετικό μηχανισμό [5]. Χρησιμοποιούν ένα διαλυτό προσαρμογέα για τη σύνδεση ενός αντιγόνου στόχου επιφάνεια σε καρκινικά κύτταρα-ως συνήθως αναγνωρίζεται από το μονοκλωνικό θεραπείες-με αντίσωμα της αμετάβλητης Οϋ3ε υπομονάδα οποιουδήποτε υποδοχέα Τ κυττάρου (TCR) επί Τ κυττάρων. Δυνητικά όλες οι προϋπάρχουσες κυτταροτοξικά Τ κύτταρα σε έναν ασθενή μπορεί να εμπλακεί με αυτή την προσέγγιση, εκ των οποίων κυττάρων Τ μνήμης τελεστών φαίνεται να κάνουν το κυρίαρχο συμβολή στην δραστικότητα κατά του όγκου [6]. Με το δάγκωμα

® τεχνολογία, η αναγνώριση Τ κυττάρων και την ενεργοποίηση δεν εξαρτάται πλέον από κλώνους Τ κυττάρων που φέρουν ένα ειδικό TCR, όχι για τη μεταφορά και την έκφραση των μορίων MHC Ι στην επιφάνεια του καρκινικού κυττάρου, ή στην πρωτεολυτική παραγωγή, μεταφορά και απεικόνιση επιφάνεια του πεπτιδίου αντιγόνων [5]. Το CD19 /CD3-δι-ειδικά blinatumomab έχει παράσχει κλινική απόδειξη της ιδέας ότι αυτό το μη-φυσικό εμπλοκή των Τ κυττάρων είναι άκρως αποτελεσματική και μπορεί να προκαλέσει σε ένα μεγάλο ποσοστό των ουσιαστικών κλινικές αποκρίσεις ALL και NHL ασθενείς [7-9]. Blinatumomab (Blincyto

™) εγκρίθηκε πρόσφατα από το FDA για τη θεραπεία ασθενών με χρωμόσωμα Φιλαδέλφειας-αρνητικών υποτροπιάζουσα /πρόδρομο πυρίμαχων Β κυττάρων ALL.

Εδώ, χρησιμοποιήσαμε AMG 110, ένα καλά χαρακτηρίζεται EpCAM /CD3 -bispecific BiTE

® κατασκεύασμα αντισώματος που είναι κλινικά δοκιμάζεται σε ασθενείς με καρκίνο τελικού σταδίου με διαφορετικά καρκινώματα [10, 11].

Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να επιλεγούν κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου για πολλούς ανοσολογικούς μηχανισμούς φοροδιαφυγής, η οποία για παράδειγμα, μπορούν να επηρεάσουν MHC τάξης Ι /παρουσίαση πεπτίδιο [12, 13], ή την παραγωγή, τη διαφοροποίηση, την επιβίωση, τη μετανάστευση και την επέκταση των ειδικών κλώνων Τ κυττάρου κυτταροτοξικά. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε σε ποιο βαθμό επτά συχνές μηχανισμούς φοροδιαφυγής επηρεάσει το δάγκωμα

ο τρόπος δράσης ®, το οποίο μπορεί δυνητικά να συμμετάσχουν οποιαδήποτε προϋπάρχουσα κυτταροτοξικών Τ κυττάρων σε ασθενείς. Ως εκ τούτου, επικεντρώθηκε σε αυτούς τους μηχανισμούς που μπορούν δυνητικά να επηρεάσουν την απόδοση κυτταροτοξικών Τ κυττάρων και αριστερά έξω εκείνοι που, για παράδειγμα, να επηρεάσει ειδική αναγνώριση των κυττάρων Τ από τα σύμπλοκα ΜΗΟ /πεπτιδίου Ι. Για το σκοπό αυτό, δημιουργήσαμε CHO κυτταρικές σειρές τρωκτικών που εκφράζουν ανθρώπινο EpCAM ως αντιγόνο στόχο επιφάνεια που είτε υπερεκφράζουν πρωτεΐνες είναι γνωστό ότι έχουν ανοσολογική δυναμικό απάτης ή όταν ο συντελεστής ανοσοκατασταλτική προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας. Ισχύς και πλάτος του ανακατευθύνονται ΟΗΟ-ΕρΟΑΜ λύση των κυττάρων-στόχων και την επαγωγή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων Τ σε απόκριση προς AMG 110 χρησιμοποιήθηκαν ως αναγνώσεις για την απόδοση των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων.

Με PD-L1, αδενοσίνη, IL-10 και ΤΟΡ -β διερευνήσαμε παράγοντες που παράγονται συχνά από τα καρκινικά κύτταρα τα οποία δεσμεύουν αρνητικά υποδοχείς ρυθμιστική επιφάνεια εκφράζεται σε κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. PD-L1 εκφράζεται στην επιφάνεια των κυττάρων του όγκου και την πρόληψη της δέσμευσης ανασταλτικό υποδοχέα PD-1 του επί Τ κυττάρων με mAb μονοθεραπείες δείχθηκε ότι έχουν έντονη αντικαρκινική δραστικότητα σε κλινικές δοκιμές [14, 15]. Η αδενοσίνη μπορεί να συντεθεί από τα καρκινικά κύτταρα και δεσμεύει τους υποδοχείς A2a αδενοσίνης και Α3 επί Τ κυττάρων, τα οποία μπορεί να αναστέλλουν λειτουργίες τελεστή [16, 17]. IL-10 θεωρείται ένα αντι-φλεγμονώδη κυτοκίνη με ευρεία λειτουργία. Επειδή τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να εκκρίνουν IL-10, ένα ρόλο στη διαφυγή του ανοσοεπιτήρηση έχει αποδοθεί στην IL-10 σε όγκους [18]. Με μεταγραφική καταστολή, ΤΟΡ-β εκκρίνεται από τα καρκινικά κύτταρα μπορούν γενικά ρυθμίζει προς τα κάτω τις λειτουργίες τελεστή των κυττάρων Τ, για παράδειγμα, με τη μείωση της έκφρασης granzymes Α και Β, περφορίνης και ιντερφερόνη-γ (ΙΡΝγ) μετά από δέσμευση υποδοχέα [19]. Η κυτταροπλασματική αναστολέας πρωτεάσης σερπίνης ΡΙ-9 μπορεί να παρεμποδίσει άμεσα την ενζυματική δραστηριότητα του γρανζύμου Β που τελικά παραδίδεται στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων μέσω ενός κυτταρολυτικού σύναψης όπως σχηματίζεται από τα Τ κύτταρα [20]. Με Bcl-2, μελετήσαμε ένα αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη κυτοσολίου που μπορούν να μειώσουν την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε επαγωγή απόπτωσης με το γράνζυμο Β [21]. Με IDO, ερευνήσαμε μια καταβολική ένζυμο ότι όταν υπερεκφράζεται από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να λιμοκτονούν το μικροπεριβάλλον του αιθέριου τρυπτοφάνης αμινοξέων και απελευθερώνουν ανοσοκατασταλτική μεταβολίτες, όπως L-κυνουρενίνης ή 3-υδροξυκυνουρενίνη, η οποία μπορεί να αύξηση της ανοχής Τ κυττάρων [22, 23].

με την εξαίρεση της ΙΡΝγ-επαγόμενης IDO, όλοι οι άλλοι παράγοντες διαφυγή μελετήθηκαν σε επίπεδα σε επιμολυσμένα κύτταρα CHO που υπερέβαινε κατά πολύ αυτά που βρέθηκαν σε έξι ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Παρά τις σπουδές προφανώς υψηλά επίπεδα παραγόντων φοροδιαφυγής, έχουμε παρατηρήσει μόνο μέτρια αποτελέσματα κάποιων για ανακατευθυνόμενους λύση και επαγωγή του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων. Στις περισσότερες περιπτώσεις, ανασταλτικά αποτελέσματα θα μπορούσε να αντισταθμιστεί από την αύξηση των δόσεων του δαγκώματος

® αντισώματος κατασκευάσει AMG 110, ή να αντιστραφεί με φαρμακολογικά μέσα. Το δάγκωμα

®-ασχολούνται Τ κύτταρα μπορεί να έχουν τη δυνατότητα να είναι δραστικά έναντι καρκινικών κυττάρων που εκφράζουν μια ποικιλία των συχνών ανοσολογικούς μηχανισμούς φοροδιαφυγής.

Υλικό και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

AMG 110 παρασχέθηκαν από την Amgen Ερευνών (Μόναχο) GmbH. Παρήχθη με τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA και καθαρίζεται μέσω μιας Ο-τερματική ετικέτα εξα-ιστιδίνης, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

Αντισώματα

εφαρμόστηκαν τα ακόλουθα αντισώματα. Για κυτταρομετρία ροής: ποντικού αντι-ανθρώπινο PD-L1-APC (M1H1, eBiosciences), ποντικού αντι-ανθρώπινου CD3-FITC (UCHT1? BD Biosciences), ποντικού αντι-ανθρώπινο CD25-APC (Μ-A251? BD Biosciences), ποντίκι αντι-ανθρώπινο EpCAM (B302 /323 /A3? Abcam), γίδινη αντι-ποντικού IgG (H + L) -APC (Jackson Immuno Research), ποντικού αντι-ανθρώπινου ΤΟΡ-β-ΡΕ (9016? R &? D Systems)? για ενδοκυτταρική FACS ή ανάλυση στυπώματος Western: ποντικού αντι-ανθρώπινο ΡΙ-9 (7D8? Abcam), ποντικού αντι-ανθρώπου GrB-APC (GB11? BD Biosciences), ποντικού αντι-ανθρώπινο Bcl-2 (100 /D5? Thermo Scientific) , ποντικού αντι-ανθρώπινο β-ακτίνης (AC-15? Thermo Scientific), αντι-ανθρώπινο IDO κουνελιού (Abcam), κατσίκα αντι-ποντικός και αντισώματα ανίχνευσης αντι-κουνελιού HRP-συζευγμένο (Thermo Scientific)? τόνωση και εξουδετερωτικά αντισώματα: αντι-ανθρώπινο CD3 (ΟΚΤ-3? Janssen-Cilag), ποντικού αντι-ανθρώπινο CD28 (L293? BD Biosciences), ποντικού αντι-ανθρώπινου ΤΟΡ-β (1D11? R &? D Systems) και αντι-ποντικού -ανθρώπινη PD-L1 (M1H1? eBiosciences)

Κατασκευή, την καλλιέργεια και τη δοκιμή των πρωτεϊνών διαφυγής και σταθερά ανθρώπινο EpCAM-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν CHO

κύτταρα

Γονική ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (CHO) που εκφράζουν πλήρη -Μήκος ανθρώπινο EpCAM υπό τον έλεγχο του υποκινητή EF1α (που παρέχεται από την Amgen Research (Μόναχο) GmbH) διαμολύνθηκαν σταθερά με ένα δεύτερο πλασμίδιο έκφρασης που κωδικοποιεί για είτε την ανθρώπινη ΡΙ-9, IDO, Bcl-2, PD-L 1, TGF-β1 , IL-10 ή το αντίστοιχο ψευδο φορέα. Εκτός από Bcl-2 (που παράγεται από γονιδιακή σύνθεση? Geneart)., Όλες οι πρωτεΐνες διαφυγή κλωνοποιήθηκαν από ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου

Μεταγενέστερες επιλογή και ενίσχυση της έκφρασης πρωτεϊνών επιτεύχθηκαν με την προσθήκη μεθοτρεξάτης (Sigma-Aldrich), L-αλανοσίνης (TRC, Τορόντο) και DCF (Hospira). CHO EpCAM: ξεφύγουν πρωτεΐνη διπλής επιμολυσμένα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε εναιώρημα σε μέσο HyQ (HyClone) συμπληρωμένο με 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Biochrom AG), 500 ηΜ μεθοτρεξάτης, 10 mM HEPES (Biochrom AG), 1,1 mM αδενοσίνης (Sigma-Aldrich) , 50 μΜ L-αλανοσίνη, 1 mM ουριδίνη (Sigma-Aldrich) και 0.1-1 μΜ DCF στους 37 ° C σε 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστήρα.

Η έκφραση του συνδεδεμένου με μεμβράνη πρωτεΐνες EpCAM και PD-L1 και δεσμευμένο σε μεμβράνη ΤΟΡ-β αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής, η έκφραση της ΡΙ-9 με ενδοκυτταρική FACS ή ανάλυση στυπώματος Western. Για τη σύγκριση των επιπέδων έκφρασης, υπολογίστηκαν η σχετική διάμεσος (= διάμεσος δείγμα /διάμεσος ελέγχου) των δειγμάτων. Έκφραση των ενδοκυτταρικών IDO και Bcl-2 προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western και ποσοτικοποιούνται με Image J λογισμικό. Τα επίπεδα έκφρασης των εκκρινόμενων IL-10 και ΤΟΡ-β πρωτεΐνες εκτιμήθηκαν σε υπερκείμενο κυτταρικής του 2.5x 10

5 /ml μετά από 48 ώρες καλλιέργειας με ELISA χρησιμοποιώντας quanti Glo IL-10 Elisa Kit (R &? D Systems) και ένα Tecan SpectraFluor Plus (ΜΤΧ Lab Systems) για την ανίχνευση ή TGF βήτα Elisa Kit (Abcam) και ένα ELISA αναγνώστης κυματικής ενέργειας X (Biotec Instruments) για ανίχνευση.

για τη λειτουργική ανάλυση του ΤΟΡ-β που εκκρίνεται από CHO μορφομετατροπείς, υπερκείμενο καλλιέργειας κυττάρων από το 2.5x 10

5 /ml συλλέχθηκαν μετά από 48 ώρες. Ένα x10

6 CD3

+ Τ κύτταρα διεγέρθηκαν για 96 ώρες με δεσμευμένο στην πλάκα CD3 /CD28 /IL-2 στο υπερκείμενο αναμιγνύεται με φρέσκο ​​μέσο (μέσο 25%: 75% υπερκείμενο). Επιδράσεις του ΤΟΡ-β αναλύθηκε με προσδιορισμό της έκφρασης GrB με ενδοκυτταρική ανάλυση FACS. Η ίδια δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για τη λειτουργική ανάλυση του ανασυνδυασμένου ΤΟΡ-β και το αντίσωμα εξουδετέρωσης του ΤΟΡ-β. Για τη λειτουργική ανάλυση των επιδράσεων αδενοσίνης, τα Τ κύτταρα διεγέρθηκαν με δεσμευμένο στην πλάκα CD3 /CD28 /IL-2 με και χωρίς 1 mM αδενοσίνη. Επιδράσεις της αδενοσίνης προσδιορίστηκαν με μέτρηση της έκφρασης CD25 με ανάλυση FACS μετά από 24 ή 96 ώρες.

ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών και κυτταρικών καλλιεργειών

Α549 [25], BxPC3 [26], KATOIII [27 ], SKBR3 [28] κύτταρα όλα αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI1640 (Biochrom AG) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Biochrom AG), 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Biochrom AG), 50 μΜ 2-μερκαπτοαιθανόλη (Gibco), 1% μη βασικά αμινοξέα (Biochrom AG), 1 mM πυροσταφυλικό νάτριο (Biochrom AG) και 1 mM HEPES (Biochrom AG). SW480 [29] κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Α431 [25] κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ (Biochrom AG) με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τυποποιημένες διαδικασίες καλλιέργειας κυττάρων. Για την επαγωγή του IDO και πρωτεϊνών PD-L 1, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 48 ώρες με 1000 U /ml ΙΡΝγ (Sigma-Aldrich).

απομόνωση των Τ-κυττάρων, διέγερση και in vitro δοκιμασίες

ανθρώπινο αίμα δωρήθηκε από υγιείς εθελοντές, οι οποίοι ήταν ιατρική φωτίζονται και είναι νηολογημένα σε μια εσωτερική τράπεζα αίματος της Amgen Ερευνών (Μόναχο) GmbH. Κάθε δωρητής είχε εκχωρηθεί ένας αριθμός που χρησιμοποιήθηκε για την ονομασία των δειγμάτων αίματος. Το αίμα που λαμβάνεται απευθείας πριν από τη χρήση από μια εκπαιδευμένη ομάδα δεν συμπεριλαμβάνονται οι συντάκτες του παρόντος εγγράφου. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το αίμα που διαχωρίστηκε μεταξύ διαφορετικών μελετών. Πριν από κάθε δωρεά, εθελοντές παρέχεται γραπτή συγκατάθεση για τη συμμετοχή τους στην ιατρική έρευνα. Για την προστασία της υγείας των δοτών, η πίεση του αίματος μετρήθηκε και χορηγούς ζητήθηκε για την τρέχουσα κατάσταση της υγείας τους πριν από τη λήψη του αίματος. Επιπλέον, οι τιμές στο αίμα του κάθε εθελοντή ελέγχθηκαν ανά τρίμηνο από εξωτερικό εργαστήριο και κρατήθηκαν αυστηρά χρονικά διαστήματα μεταξύ δύο αιμοδοσιών. Κάθε δωρητής παρέχεται μόνο ένα μικρό όγκο του αίματος που δεν υπερβαίνει το εύρος των δειγμάτων αίματος που για ήσσονος σημασίας έρευνες κατά τη διάρκεια προληπτικές ιατρικές εξετάσεις. Ως εκ τούτου, ζητήθηκε καμία άδεια μιας ηθική επιτροπή. PBMCs απομονώθηκαν από ηπαρινωμένο αίμα με Ficoll φυγοκέντριση κλίσης πυκνότητας (Biochrom) με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Για την εξάλειψη των υπολειμματικών ερυθροκυττάρων, τα κύτταρα επωάστηκαν με ρυθμιστικό λύσης ερυθροκυττάρων (155 mM ΝΗ

4Cl, 10 mM KHCO

3, 0,1 mM Na

2EDTA) για 5 λεπτά στους 4 ° C. PBS Dulbecco (Biochrom) με 2% FCS προστέθηκαν για να σταματήσει η αντίδραση. Μετά από μια φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 600 χ g, το υπερκείμενο με λύθηκαν ερυθροκύτταρα απορρίφθηκε. CD3

+ Τ κύτταρα ελήφθησαν από MACS μαγνητικού κυτταρικού διαχωρισμού σφαιριδίων χρησιμοποιώντας το κιτ κυττάρων Απομόνωση τηγάνι Τ ΙΙ (Miltenyi). CD8

+ Τ κύτταρα διαχωρίστηκαν από πρόσφατα απομονωμένα ή προ-διεγείρονται PBMCs είτε εξάντληση των CD4 + κυττάρων

+ και CD56 χρησιμοποιώντας αντι-ανθρώπινο CD4 ποντικού (L200? BD, Heidelberg) και ποντικού αντι- αντισώματα ανθρώπινου CD56 (Β159? BD), χάντρες προβάτου αντι-ποντικού IgG (Invitrogen) και μαγνήτες Dynal, ή χρησιμοποιώντας το MACS CD8

+ κιτ απομόνωσης (Miltenyi). Τ κύτταρα διεγέρθηκαν με συνδεδεμένο στην πλάκα αντι-CD3 (ΟΚΤ-3? Janssen-Cilag) και αντι-CD28 (BD) αντισωμάτων και 20 U /ml ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ιντερλευκίνη-2 (IL-2, Chiron Corperation Ltd) σε μέσο RPMI1640 (Biochrom AG), συμπληρωμένο με τα ίδια συστατικά όπως αναφέρονται παραπάνω. Συμπληρωμένο RPMI χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργεια των κυττάρων Τ και όλα

in vitro

δοκιμασίες. Περαιτέρω προσθήκες όπως αδενοσίνη (Sigma-Aldrich), τρυπτοφάνη (Sigma-Aldrich) ανασυνδυασμένες κυτοκίνες (Miltenyi), ή εξουδετερωτικά αντισώματα προστέθηκαν άμεσα στο μέσο καλλιέργειας κατά την έναρξη της περιόδου επώασης.

βασιζόμενη σε FACS κυτταροτοξικότητα δοκιμασίες

τα κύτταρα στόχοι σημάνθηκαν με Vybrant DIO ή DID (Life Technologies) φθορίζουσα χρωστική μεμβράνη, ρυθμίζεται σε 1,25χ 10

5 κύτταρα /ml και συν-επωάστηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων με πρόσφατα απομονωμένα CD3

+ κύτταρα-τελεστές Τ σε ένα τελεστή-προς-στόχο (Ε: Τ) αναλογία 4: 1 ή με προ-διεγερμένα CD8

+ Τ κύτταρα τελεστές σε μια αναλογία Ε: Τ του 1: 1 με την παρουσία του AMG 110 σειριακή αραίωση. Περαιτέρω προσθήκες προστέθηκαν απευθείας στο μέσο της δοκιμασίας. Η επώαση διεξήχθη στους 37 ° C, σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Μετά από 24-72 ώρες, που ζουν και τα νεκρά κύτταρα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε PBS /2% FCS με 1 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (Sigma-Aldrich), και αναλύθηκαν σε FACS Canto

™ ροής II κυτταρόμετρο ( Becton Dickinson) εξοπλισμένο με λογισμικό FACSDiva. Η κυτταροτοξικότητα προσδιορίσθηκε εις διπλούν με την ποσοτικοποίηση των επισημαίνονται και ΡΙ θετικών μη βιώσιμα κύτταρα-στόχους και τα σημασμένα κύτταρα ΡΙ αρνητικός στόχος. Ποσοστό της λύσης αναλύθηκε σε σχέση με να δαγκώσει

® συγκέντρωση χρησιμοποιώντας Prism 5 λογισμικού (GraphPad). Ανάλυση με Prism 5 περιλαμβάνεται δημιουργία σιγμοειδείς καμπύλες δόσης-απόκρισης, υπολογισμός της ΕΚ

50 τιμές, καθώς και τον προσδιορισμό των πάνω και κάτω το ποσοστό του δαγκώματος

® εξαρτώμενη λύση για τον υπολογισμό του πλάτους λύσης για ένα δεδομένο χρονικό σημείο. Για να συγκριθεί η επίδραση των πρωτεϊνών διαφυγής για BiTE

® που προκαλείται ανακατευθυνόμενους λύση σχετική μεταβολή στο ΕΚ

50 υπολογίστηκε από τον τύπο: (ΕΚ

50 τιμές των επιμολύνσεων διαφυγής) /(ΕΚ

50 τιμές των γονικών κυττάρων ελέγχου) και η σχετική αλλαγή στις τιμές πλάτους από (πλάτος επιμολυντών Escape) /(εύρος των γονικών κυττάρων ελέγχου). Κάθε δοκιμασία πραγματοποιήθηκε τουλάχιστον εις διπλούν.

CFSE με βάση προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού

Για να εκτιμηθεί η πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυττάρων Τ με την παρουσία πρωτεϊνών του ανοσοποιητικού διαφυγής, τα Τ κύτταρα σημάνθηκαν με carboxyfluoresceine ηλεκτριμιδυλεστέρας διοξικής Esther (CFSE) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Molecular Probes). Τα επισημασμένα Τ κύτταρα συν-επωάστηκαν με CHO κυτταρικές γραμμές που εκφράζουν σταθερά EpCAM και μία από τις πρωτεΐνες απάτης ή κύτταρα ελέγχου +/- αδενοσίνης σε ένα επωαστή με 37 ° C, 5% CO

2 ατμόσφαιρα για 120 ώρες σε 48-φρεατίων επίπεδες πλάκες πυθμένα (Nunc) παρουσία ή απουσία 1 μg /ml AMG 110. Ο αριθμός των Τ κυττάρων κρατήθηκε σταθερή σε 1χ 10

4. CHO κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές για να απομακρυνθεί μέσο επιλογής και ρυθμίστηκαν σε Ε: Τ αναλογίες 1: 8, 1: 1 και 4: 1. Μετά την περίοδο επώασης, ο πολλαπλασιασμός των CD3

+ Τ κυττάρων προσδιορίστηκε με παρακολούθηση της διανομής CFSE με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα FACS Canto

™ II κυτταρόμετρο ροής FACS και DIVA

™ λογισμικό. Επακόλουθη ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας FlowJo 7.6.5 λογισμικού. Όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον εις διπλούν.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση των ΕΚ

50 αξίες και πλάτη σημαντικές ακραίες τιμές αποκλείστηκαν με δοκιμή του Grubb του. Στη συνέχεια σ τιμές υπολογίστηκαν με Prism 5 (GraphPad Software) χρησιμοποιώντας αταίριαστα t τεστ με διόρθωση του Welch.

Αποτελέσματα

κυτταρικές σειρές επιμολυσμένες CHO εκφράζουν υψηλά επίπεδα του ανθρώπινου ανοσοποιητικού παράγοντες της φοροδιαφυγής

σταθερά επιμολυσμένα, ανθρώπινο EpCAM κύτταρα που εκφράζουν CHO χαρακτηρίστηκαν για επίπεδα έκφρασης του ανθρώπινου ανοσοποιητικού πρωτεϊνών διαφυγή σε σύγκριση με τα φυσικά επίπεδα που βρέθηκαν σε έξι ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών Α549 (πνεύμονας), BxPC3 (προστάτη), KATOIII (γαστρικό), SKBR3 (στήθος), SW480 (ορθοκολικό) και Α431 (δέρμα). Για IDO και PD-L 1, τα καρκινικά κύτταρα ήταν επιπλέον διεγέρθηκαν για 48 ώρες με 1000 U /ml ΙΡΝγ, το οποίο είναι γνωστό ότι προκαλεί τις πρωτεΐνες [30, 31]. Διάφορες μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση και σύγκριση των επιπέδων έκφρασης, συμπεριλαμβανομένης FACS (για σερπίνη ΡΙ-9, PD-L1, EpCAM και ΤΟΡ-β), ELISA (για ΤΟΡ-β και IL-10) και κηλίδωση Western (για Bcl-2 και IDO? δούμε αναλύσεις στο S1 σχήμα). Οι αναλύσεις στυπώματος Western επιβεβαίωσε το σωστό μοριακό μέγεθος και η χρήση ειδικών ανίχνευση αντισωμάτων Η ταυτότητα των αντίστοιχων πρωτεϊνών σε κυτταρικές σειρές καρκίνου και επιμολυσμένα κύτταρα CHO. Μια περίληψη των δεδομένων έκφρασης δείχνει ότι-εκτός από IDO μετά τη διέγερση της Α431, Α549, BxPC3 και KATOIII κυττάρων με ΙΡΝγ-σε όλες τις περιπτώσεις πρωτεΐνες διαφυγή εκφράστηκαν σε σταθερά επιμολυσμένα CHO κύτταρα σε ένα πολύ υψηλότερο επίπεδο από ό, τι στις κυτταρικές σειρές έξι καρκίνου. Η έκφραση του EpCAM αντιγόνου στόχου σε περισσότερες κυτταρικές σειρές (Α431, BxPC3 και KATOIII, SKBR3 και SW480) ήταν στην περιοχή του CHO μορφομετατροπέων (Παράγοντας 2-9 φορές λιγότερο), ενώ Α549 έδειξε μόνο μέτρια έκφραση EpCAM (50χ λιγότερο από επιμολυσμένα CHO κύτταρα) (Πίνακας 1).

η

IDO έδειξαν έντονη ανασταλτική επίδραση επί AMG 110-επαγόμενο πολλαπλασιασμό κυττάρων Τ

AMG 110 και άλλα BiTE

® κατασκευάσματα αντισώματος έχουν την ικανότητα να ισχυρά ενεργοποιούν Τ κύτταρα, αλλά μόνο με την παρουσία των κυττάρων-στόχων [32]. Εμείς εδώ διερευνήθηκε η επίδραση των επτά ανοσολογικών παραγόντων διαφυγή κατά την έναρξη του πολλαπλασιασμού των Τ κυττάρων μέσω AMG 110 σε τρεις διαφορετικές τελεστή προς στόχο (Ε: Τ) μετά από συν-καλλιέργεια επί 120 ώρες. Σε περίπτωση απουσίας του AMG 110, κανένας από τους επιμολύνονται ή CHO κυτταρικές γραμμές ελέγχου προκάλεσε μια πολλαπλασιασμό του CD3

+ πληθυσμό κυττάρων Τ εντός προστίθενται περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα (PBMCs) όπως παρακολουθείται με FACS χρησιμοποιώντας CSFE χρώση (Σχήμα 1). Με την παρουσία του 1 μg /ml AMG 110, κύτταρα ελέγχου CHO-EpCAM (μαύρο) καθώς και κύτταρα CHO με παράγοντες διαφυγή (κόκκινο) έδειξε ισχυρά σήματα πολλαπλασιασμού Τ κυττάρου ενδεικτική πολλαπλούς γύρους κύκλου κυττάρου (Σχήμα 1). Κάπως ισχυρότερα σήματα παρατηρήθηκαν με την αύξηση αναλογίες Ε: Τ κυττάρων (: Τ αναλογία 1: συγκρίνουν E 8 με 4: 1). Μια σημαντική διαφορά μεταξύ του ελέγχου και του παράγοντα της φοροδιαφυγής σημειώθηκε μόνο για κύτταρα που εκφράζουν IDO. Σε όλα τα τρία αναλογίες Ε: Τ, AMG 110 θα μπορούσε μόλις να επάγει πολλαπλασιασμό των Τ κυττάρων σε κύτταρα CHO-ΕρΟΑΜ σταθερά επιμολυσμένα με IDO cDNA ανθρώπινης. Ένα λείπει επίδραση του ΤΟΡ-β και IL-10 επιβεβαιώθηκε με προσθήκη ανασυνδυασμένου παράγοντες στο μέσο καλλιέργειας (βλέπε Εικ S2A). Για τα πειράματα, χρησιμοποιήθηκαν τρία διαφορετικά ανθρώπινους δότες PBMC. ένας από αυτούς έδειξαν ασθενέστερη AMG 110 εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό (βλ αδενοσίνη ΕΤ = 1: 1 και 4: 1).

Ανθρώπινο CD3

+ Τ κύτταρα σημάνθηκαν με CFSE και συν-καλλιεργήθηκαν σε τελεστή προς στόχο (Ε: Τ) 1: 8, 1: 1 και 4: 1 σε 48-φρεατίων με τις κυτταρικές σειρές CHO που εκφράζουν ανθρώπινο EpCAM και μία από τις έξι σταθερώς επιμολυσμένα πρωτεΐνες του ανοσοποιητικού διαφυγή (ΡΙ-9, Bcl-2, IDO , IL-10, ΤΟΡ-β ή PD-L1) (κόκκινο), ή με τη γονική EpCAM

κύτταρα + CHO με την παρουσία 1 mM αδενοσίνη (ADO) στο μέσο καλλιέργειας (μαύρο: γονικά κύτταρα). CFSE σήματα σε κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Για κάθε πρωτεΐνη διαφυγή ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζεται. Συγκαλλιέργεια με την απουσία του AMG 110 δεν έδωσε CSFE σήματα, ενώ συν-καλλιέργειας με την παρουσία του 1 μg /ml AMG 110 έδειξε κύκλους κυτταρικής διαίρεσης που επηρεάζονται από αναλογία Ε: Τ. Τρεις διαφορετικές ανθρώπινες PBMC χρησιμοποιήθηκαν.

Η

Serpin PI-9, TGF-β, Bcl-2 και PD-L1 μειώσει τη δραστικότητα των ανακατεύθυνση λύσης στόχου με AMG 110

Χρησιμοποιώντας καθαρισμένο CD8

+ Τ κύτταρα από υγιείς ανθρώπινους δότες PBMC, αναλύσεις AMG 110 απόκρισης δόσης για ανακατευθυνόμενους λύση σε σύγκριση ΕΚ

50 τιμές και το ποσοστό της λύσης μεταξύ ΟΗΟ-EpCAM κύτταρα ελέγχου (μαύρο) και τα κύτταρα στόχους παρουσία του σταθερώς εκφράζεται ή να προστεθούν παράγοντες της φοροδιαφυγής (κόκκινο) (Σχήμα 2). Συν-καλλιέργεια ήταν για 24 ώρες σε μια αναλογία Ε: Τ του 1: 1. Ανάλογα με δότες κυττάρων Τ, βασικοκυτταρικό ΕΚ

50 τιμές για ανακατευθυνόμενους λύση κυμαίνονταν μεταξύ 5 και 200 ​​pg /ml AMG 110. Το ποσοστό της κυτταρικής λύσης κυμαίνονταν μεταξύ 40 και 90%. Διακριτά μετατοπίσεις των καμπυλών δόσης απόκρισης σε υψηλότερες τιμές EC50 και χαμηλότερα ποσοστά λύσεως παρατηρήθηκαν για διάφορους παράγοντες διαφυγή (Σχήμα 2Α). Ωστόσο, σε καμία περίπτωση, η παρουσία ενός παράγοντα φοροδιαφυγής δεν καταργεί ανακατεύθυνσης λύση. Μια ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων δείχνεται στο σχήμα 2Β και 2C.

AMG 110 δοσοεξαρτώμενη λύση συγκρίθηκε μεταξύ των γονικών EpCAM

+ κυττάρων CHO και EpCAM

+ CHO κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με ένα από τα έξι ανθρώπινα υπεκφυγές πρωτεΐνες ή σε παρουσία 1 mM αδενοσίνης. Ανθρώπινα CD8

+ Τ κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα τελεστές σε μια αναλογία Ε: Τ του 1: 1. Ποσοστό κυττάρου στόχου λύσης μετά από συν-καλλιέργεια για 24 ώρες και ΕΚ

50 τιμές από καμπύλες απόκρισης σιγμοειδούς απόκρισης δόσης προσδιορίστηκαν σε μια δοκιμασία κυτταροτοξικότητας που βασίζεται σε FACS. Τα (Α) καμπύλες απόκρισης Εκπρόσωπος δόση που αναγράφεται για τη γονική EpCAM

+ CHO κύτταρα (μαύρο) και EpCAM

+ κυττάρων CHO που εκφράζουν πρωτεΐνες φοροδιαφυγής ή επωάζονται παρουσία 1 mM αδενοσίνη (κόκκινο). (Β) Μέση ΕΚ

50 τιμές για ανακατευθύνονται λύση υπολογίστηκαν από τον αναφερόμενο αριθμό των ανεξάρτητων πειραμάτων. Η σχετική μεταβολή στο ΕΚ

50 τιμές για λύση προσδιορίστηκε διαιρώντας το μέσο όρο της ΕΚ

50 τιμές από τις συνθήκες της φοροδιαφυγής από τη μέση της ΕΚ

50 τιμές από συνθήκες ελέγχου. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM τιμές. (C) Σχετική αλλαγές στο ποσοστό του κυττάρου στόχου λύσης μετά από 24 ώρες σε οροπέδιο των καμπυλών απόκρισης δόσης. Το μέσο πλάτος της λύσης υπό συνθήκες διαφυγή διαιρέθηκε με την μέση τιμή του πλάτους του λύσης υπό συνθήκες ελέγχου. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM τιμές.

Η

Το ισχυρότερο ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της δραστικότητας των ανακατευθύνονται παρατηρήθηκε λύση με το γράνζυμο Β αναστολέα σερπίνης ΡΙ-9 που δείχνει μια μέση 18-πλάσια αύξηση στην ΕΚ

50 τιμές (Σχήμα 2Α και 2Β), με μια τάση προς την στατιστική σημασία (ρ = 0,07? Ν = 5). Δεύτερον ισχυρότερο ήταν η επίδραση της επιφανειακής έκφρασης του PD-L 1 σε κύτταρα ΟΗΟ-EpCAM με ένα & gt? Μείωση κατά 5 φορές σε δραστικότητα φθάνοντας στατιστική σημασία (ρ = 0,04? Ν = 7). Η έκφραση του TGF-β προκάλεσε μία 3-φορές μείωση στη δραστικότητα του λύσης με μια ισχυρή τάση (ρ = 0,06? Ν = 5). Μία ανασταλτική επίδραση επιβεβαιώθηκε με προσθήκη ανασυνδυασμένου ΤΟΡ-β στο μέσο καλλιέργειας των CHO-ΕρΟΑΜ κύτταρα ελέγχου (βλέπε Σχ S2B). Η & gt? 4 φορές ανασταλτική δράση του Bcl-2 επί της ΕΚ

50 τιμή λύσης έδειξε μια αδύναμη τάση (ρ = 0,09? Ν = 3), και μια στατιστικά σημαντική αν και μικρή μείωση (βλέπε Σχήμα 2C) στην ποσοστό των λυμένων κυττάρων (ρ = 0,01? Ν = 4). Κανένα από τα άλλα αποτελέσματα σχετικά με την αποτελεσματικότητα της λύσης ή το ποσοστό των κυττάρων που έχουν υποστεί λύση που περιγράφεται στο σχήμα 2 πέτυχε στατιστική σημαντικότητα ή έδειξαν μία ισχυρή τάση (S3A και S3b Εικ). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν CD3

+ Τ κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν αντί του CD8

+ Τ κύτταρα ως πληθυσμός κυττάρου τελεστή (βλέπε Εικ S4).

Οι ανασταλτικές δραστηριότητες του IDO, PD-L1, και ΤΟΡ-β μπορεί να αντιστραφεί με φαρμακολογικά μέσα

IDO ήταν ο μόνος παράγοντας διαφυγή σε αυτή τη μελέτη που οδηγεί σε ισχυρή αναστολή της AMG 110-επαγόμενο πολλαπλασιασμό κυττάρων Τ (βλέπε Σχήμα 1). Για να αποδειχθεί ότι η αναστολή οφειλόταν στην ενζυματική δραστικότητα του IDO, προσθέσαμε 0,5 μΜ τρυπτοφάνη στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και αναλύθηκαν κυτταρική ποδηλασία με FACS CFSE με βάση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α, αναπλήρωση με τρυπτοφάνη αντιστραφεί τελείως την αναστολή της AMG 110 επαγόμενης κυτταρικής ποδηλασία σε κύτταρα CHO-ΕρΟΑΜ IDO εκφράζουν.

(Α) Ανάλυση του CD3

+ Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό μετά από 120 h από συν-καλλιέργεια με EpCAM έλεγχος

+ κυττάρων CHO και IDO εκφράζουν, EpCAM

+ CHO κύτταρα σε παρουσία ή απουσία 500 μΜ τρυπτοφάνη (Trp) με και χωρίς 1 μg /ml AMG 110. (Β ) δοσοεξαρτώμενη, ανακατευθύνονται κύτταρο στόχο τη λύση των γονικών EpCAM

+ κυττάρων CHO και EpCAM

+ CHO ΤΟΡ-β μορφομετατροπείς +/- 50 μg /ml ΤΟΡ-β εξουδετερωτικών αντι-ανθρώπινο ΤΟΡ-β αντίσωμα σε παρουσία του AMG 110 και CD3

+ Τ κύτταρα σε αναλογία Ε: Τ του 4: 1 μετά από 72 ώρες επώασης. (Γ) Η δοσοεξαρτώμενη ανακατευθύνεται κυττάρου στόχου λύση των EpCAM ελέγχου

+ κυττάρων CHO και EpCAM

+ CHO PD-L1 επιμολύνσεις με και χωρίς 5 μg /ml ενός αντι-ανθρώπινου PD-L1-εξουδετέρωσης αντισώματος στην παρουσία AMG 110 και προ-διεγερμένα CD8

+ Τ κύτταρα. Ο λόγος Ε: Τ ήταν 1: 1, η διάρκεια δοκιμασίας 24 ώρες

Η

Η ανασταλτική επίδραση παρατηρήθηκε κατά την έκφραση του ΤΟΡ-β επί ανακατευθύνονται λύση των κυττάρων στόχων που εκφράζουν και να εκκρίνουν ανθρώπινη ΤΟΡ-β θα μπορούσε να είναι. αντιστραφεί με την παρουσία 50 μg /ml ενός εξουδετερωτικού αντι-ΤΟΡ-β αντίσωμα (Εικόνα 3Β). Η μειωμένη λύση των PD-L 1 κύτταρα που εκφράζουν CHO-ΕρΟΑΜ με AMG 110 θα μπορούσε να αντιστραφεί πλήρως με την παρουσία 5 μg /ml ενός ανταγωνιστικού αντισώματος αντι-PD-L 1 (Σχήμα 3C). Αντι-ΤΟΡ-β και αντι-PD-L 1 αντισώματα ή ΡΙ-9 αναστολή από shRNA είχε καμία επίδραση στη λύση των καρκινικών κυτταρικών γραμμών που εκφράζουν τους αντίστοιχους συντελεστές διαφυγή σε χαμηλά επίπεδα (βλ S4D, S4E και S4F σχήμα).

Ανακατεύθυνση λύση των κυττάρων στόχων παρατηρείται ακόμη και αν οι επτά μηχανισμούς φοροδιαφυγής είναι παρούσες σε συγκαλλιέργεια

Διάφοροι παράγοντες της φοροδιαφυγής που εξετάζονται στην παρούσα μελέτη μπορεί να δράσει στο

trans

, όπως TGF-β, IL-10, PD-L1, IDO και αδενοσίνης. Μόνο ΡΙ-9 πρωτεΐνες Bcl-2 και σερπίνης, οι οποίες περιορίζονται στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων, δεν μπορεί. Εμείς εδώ προσπάθησε να δημιουργήσει σε συγκαλλιέργεια ένα ανοσοκατασταλτικό περιβάλλον, έχοντας τα επτά παράγοντες που είναι παρόντες την ίδια στιγμή. Σε μία κατάσταση, κάθε μία από τις έξι επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές CHO-ΕρΟΑΜ ήταν παρούσα στον ίδιο αριθμό και 1 mM αδενοσίνη προστίθεται στο μέσο καλλιέργειας. Ακόμη και υπό αυτές τις συνθήκες, ανακατευθύνονται λύσης εξακολουθεί να παρατηρείται (Σχήμα 4). Ωστόσο, μια σημαντική επίπτωση στο ποσοστό της λύσης ήταν εμφανής με έναν αυξανόμενο αριθμό παραγόντων σε συνδυασμό.