Αφηρημένο

οσφρητικούς υποδοχείς (ΕΑΠ) εκφράζονται στο οσφρητικό επιθήλιο, όπου ανιχνεύουν ουσίες για, αλλά και σε άλλους ιστούς με πρόσθετες λειτουργίες. Μερικοί ΙΑΠ ακόμη υπερεκφράζονται σε κύτταρα όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, αναγνωρίσαμε ΙΑΠ εκφράζεται σε εντεροχρωμιόφιλα κύτταρα όγκου με RT-PCR, που δείχνουν ότι μεμονωμένα κύτταρα μπορούν να συν-εκφράζουν διάφορες ΕΑΠ. Μερικά από τα υποδοχέων προσδιορίζονται ήδη αναφέρθηκαν σε άλλους όγκους, αλλά είναι ορφανό (χωρίς γνωστό συνδετήρα), όπως είναι η περίπτωση για τα περισσότερα από τα εκατοντάδες ανθρώπινες ΕΑΠ. Έτσι, τα γονίδια που κωδικοποιούν για την ανθρώπινη ΙΑΠ με ​​γνωστές συνδετήρες διαμολύνθηκαν σε αυτά τα κύτταρα, που εκφράζουν λειτουργική ετερόλογο ΕΑΠ. Η

in vitro

διέγερση αυτών των κυττάρων από την αντίστοιχη ή οσφρητικών αγωνιστές προωθείται κυτταρική εισβολή τζελ κολλαγόνου. Χρησιμοποιώντας LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη, η διέγερση της PSGR (ειδικό προστατικό πρωτεΐνη G-συζευγμένο υποδοχέα), ένα ενδογενώς υπερεκφράζεται είτε με β-ιονόνη, παράγοντα οσμής αγωνιστή της, είχε ως αποτέλεσμα την ίδια φαινοτυπική μεταβολή. Δείξαμε επίσης τη συμμετοχή της κινάσης ΡΙ3 γ οδού εξαρτάται σηματοδότησης σε αυτήν την προώθηση των καρκινικών κυττάρων εισβολής προκλήθηκε από ή διέγερση. Τέλος, μετά από υποδόρια εμβολιασμό των κυττάρων LNCaP σε NSG ποντίκια με ανοσοανεπάρκεια, η

in vivo

διέγερση αυτών των κυττάρων από τον αγωνιστή PSGR β-ιονόνη ενισχυθεί σημαντικά μετάσταση εμφάνιση και την εξάπλωση

Παράθεση:. Sanz G , Leray Ι, Dewaele Α, Sobilo J, Lerondel S, Bouet S, et al. (2014) Προώθηση Cancer Cell της διεισδυτικότητας και μετάσταση Ανάδειξη Προκαλείται από οσφρητικά Receptor διέγερση. PLoS ONE 9 (1): e85110. doi: 10.1371 /journal.pone.0085110

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24, Απριλίου, 2013? Δεκτές: 1 Δεκεμβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 8 Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Sanz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το INRA και CNRS (Εθνικό Κέντρο Επιστημονικής έρευνας (Γαλλία). Η έρευνα διεξήχθη στα πλαίσια της EBAM LEA (Η Ευρωπαϊκή Associated Εργαστήριο (ΛΕΑ) με τίτλο «Παλμικά ηλεκτρικά πεδία Εφαρμογές στη Βιολογία και Ιατρική»). Η χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

οσφρητικούς υποδοχείς (ΕΑΠ) είναι συζευγμένο με G πρωτεΐνη υποδοχείς που εκφράζονται κυρίως στα οσφρητικά αισθητήριων νευρώνων (ΛΤΔ) του οσφρητικού επιθηλίου, όπου ανιχνεύουν και διακρίνουν μυριάδες παράγοντες οσμής σύμφωνα με μια συνδυαστική κώδικα με τον οποίο μπορεί να ενεργοποιηθεί ένας OR από διάφορες ουσίες για και οσφρητικών μπορεί να διεγείρει διάφορες ΕΑΠ [1], [2]. Επιπλέον, οι ΕΑΠ εκφράζονται σε μη οσφρητικό ιστούς [3] – [5] όπου μπορούν να παίξουν επιπλέον ρόλους. Μπορούν ιδίως διέπουν χημειοταξία σπέρματος, ρυθμίζει τη μετανάστευση και την προσκόλληση των μυϊκών κυττάρων, και να ελέγχουν την έκκριση σεροτονίνης από εντεροχρωμιόφιλα κύτταρα (ΕΚ) [6] – [10]. Αρκετές μελέτες ανέφεραν επίσης ότι ορισμένα ΙΑΠ μπορεί να είναι καρκινικός δείκτης, ένας από αυτούς τροποποίησης

in vitro

ο πολλαπλασιασμός των LNCaP κυττάρων καρκίνου του προστάτη [11], [12], [13], [14].

ειδικότερα, τα κύτταρα ΕΚ μπορεί να αποκτήσει ένα καρκινικό φαινότυπο και διαφορικά ρητή ΕΑΠ, ανάλογα με την εξέλιξη του καρκινώματος νευροενδοκρινείς [15]. Τα κύτταρα ΒΟΝ, μία ανθρώπινη κυτταρική γραμμή ΕΚ που προέρχεται από ένα μετάσταση ενός παγκρεατικό καρκίνωμα [16], [17], έχουν περιγραφεί να εκφράζουν ενδογενώς ΙΑΠ [8], η οποία θα μπορούσε να είναι δείκτες όγκου όταν υπερεκφράζεται [15]. Επειδή τα κύτταρα ΒΟΝ προήλθαν από μια μετάσταση, ερευνήσαμε εάν η ενεργοποίηση του ΕΑΠ με ​​ουσίες για αγωνιστή θα μπορούσε να έχει ένα ρόλο στην πρόοδο του όγκου. Για το σκοπό αυτό, αποφασίσαμε να προσδιορίσει τις εξόχως απόκεντρες περιοχές που εκφράζεται σε κύτταρα BON. Ωστόσο, οι ουσίες για αγωνιστή ή ανταγωνιστή ειδικά των BON κύτταρα ΕΑΠ είναι άγνωστες, όπως και για τις περισσότερες από τις εκατοντάδες εντοπίστηκαν ανθρώπινα ΕΑΠ. Έτσι, προσπάθησε να αναπτύξει ένα μοντέλο από την επιμόλυνση αυτών των κυττάρων με deorphanized ΕΑΠ. Η ετερόλογη έκφραση επιτυγχάνεται μας επέτρεψε να εκτιμηθεί η

in vitro

διηθητικότητας των κυττάρων αυτών κατά τη διέγερση με το παράγοντα οσμής προσδέματος του επιμολυσμένα υποδοχέα. Επιπλέον, προσδιορίσαμε ΡΙ3 κινάσης γPI3Kγ ως συστατικό του μονοπατιού σηματοδότησης που επάγεται από ή διέγερση και την προαγωγή της κυτταρικής διεισδυτικότητα. Μια πιο φυσιολογικό μοντέλο επίσης χρησιμοποιήθηκε

in vitro

, τα LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη που υπερεκφράζουν το PSGR (ειδικό προστατικό συζευγμένου με πρωτεΐνη υποδοχέα), ένας ενδογενής και deorphanized ή θεωρούνται σαν δείκτη όγκου, και διασκορπισμένες περιγράφηκε να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων

in vitro

[12]. Το μοντέλο αυτό χρησιμοποιείται στη συνέχεια για

in vivo

να αναλύσει το ρόλο του ΕΑΠ διέγερσης στην εξέλιξη του όγκου, δηλαδή σε μετάσταση εμφάνιση και την εξάπλωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

τα ζώα αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές της γαλλικής κυβέρνησης σχετικά με χειρουργικές επεμβάσεις και τη φροντίδα των ζώων. Πρωτόκολλο εγκρίθηκε από το αβροφροσύνης ηθικής για τα πειράματα με ζώα που ονομάζεται «Comité d’en Ethique πειραματισμό Animale de l’IRCIV« ΣΕΚΑΠ-26 (αριθμός πρωτοκόλλου 2012-043).

Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) -PCR, κλωνοποίηση και αλληλούχιση

Ολικά RNAs εκχυλίσθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση Ι RT πραγματοποιήθηκε με το «SuperScript Πρώτη Strand®, Synthesis System για RT-PCR» kit (Invitrogen).

Για μονό κύτταρο RT-PCR, και μόνο τα κύτταρα συλλέχθηκαν με αναρρόφηση σε ένα γυάλινο σωλήνα και RT πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των «ενιαία κελί κύτταρα Εκθέτης ™ III Άμεση cDNA Σύνθεση συστήματος» kit (Invitrogen) μετά την διάσπαση των κυττάρων, μετουσίωση της πρωτεΐνης και την επεξεργασία DNAse.

ένθετη PCR διεξήχθη ξεκινώντας από 1 μι του RT προϊόντων και χρησιμοποιώντας εκφυλισμένα εναύσματα στόχευσης ή διατηρημένες περιοχές, ή εκκινητές που στοχεύουν ειδικά ή ταυτιστεί με τα εκφυλισμένους εκκινητές. Εκφυλισμένοι εκκινητές ακολουθίες ευγενώς από τον Stephan Bieri (Givaudan, Ελβετίας). Απουσία του γονιδιακού DNA ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ανθρώπινο GAPDH ή β-ακτίνης εναρκτήρες επί ϋΝάση Ι επεξεργασμένα RNAs χωρίς αντίστροφη μεταγραφάση.

Τα προϊόντα PCR ενισχύθηκαν με εκφυλισμένους εκκινητές κλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα ρΟΕΜ-Τ (Promega) και αλληλουχήθηκαν με Beckman Coulter Genomics. Τα προϊόντα PCR ενισχύθηκαν με ειδικούς εκκινητές είχαν άμεση αλληλουχία (Beckman Coulter Genomics).

Χημεία

Αρωματικές ουσίες, DMSO και ορυκτέλαιο (M3516) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, Fluka ή Acros Organics κατά τη υψηλότερη δυνατή καθαρότητα. AS605240 αγοράστηκε από Euromedex (Σέλεκ, S1410) και gallein από TOCRIS βιοεπιστημών. Παραφίνη (CellWax) ελήφθη από την ΧΜΛ, και hemalun, ηωσίνη και σαφράν από RAL.

φορείς έκφρασης θηλαστικών

OR1G1 ή OR17-40 κωδικές αλληλουχίες εισήχθησαν στο έκφρασης θηλαστικών pCMV-Tag3B (Stratagene) με τρόπο ως αποτέλεσμα την σύντηξη ενός επιτόπου cmyc στον υποδοχέα Ν-άκρο. Οι φορείς που προέκυψαν ονομάστηκε pCMV-TagOR1G1 και pCMV-TagOR17-40.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

BON κύτταρα (υποκλώνος # 7) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr Courtney M. Townsend (Τμήμα Χειρουργική UTMB, Galveston, TX 77551, USA) [16], [17]. Αυτά αναπτύχθηκαν εντός DMEM /F-12 (Ham) χωρίς ερυθρό της φαινόλης (GIBCO, Invitrogen Corporation) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (Hyclone, Perbio) και αντιβιοτικά (100 U πενικιλλίνη /ml και 100 μg στρεπτομυκίνη /ml, Invitrogen) , στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με pCMV-TagOR1G1 ή pCMV-TagOR17-40 χρησιμοποιώντας jetPEI ™ (Polyplus-επιμόλυνση) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ή έκφραση στην κυτταρική επιφάνεια ελέγχθηκε με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού με χρήση του μονοκλωνικού αντι-cmyc-Cy3 αντίσωμα (C6594, Sigma-Aldrich) σε μη διαπερατά κύτταρα.

κύτταρα LNCaP αγοράσθηκαν από την ATCC (Κλώνος FGC, αριθ . CRL-1740 ™) σε δίοδο 19, και αναπτύχθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (ATCC, Νο 30 έως 2001) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (ATCC, Νο 30 – 2021), στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2.

απεικόνισης ασβέστιο

BON και LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν επί πλάκας καλλιέργειας 96 φρεατίων (μαύρη πλάκα μικροτίτλου, Greiner Bio-όνη), αντίστοιχα σε ένα πυκνότητα 10

5 και 0,5 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα φορτώθηκαν με 2,5 μΜ fluo-4 ακετοξυμεθυλ εστέρα (Molecular Probes), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. απεικόνισης ασβεστίου εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο επιφθορισμού (CK40 Όλυμπος) εξοπλισμένο με μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (ORCA-ER, Hamamatsu Photonics). Ca

2 + REPONSES παρατηρήθηκαν στα 460-490 nm διέγερσης και ≥ 515 μήκη κύματος εκπομπής nm. απόκτηση δεδομένων και ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το λογισμικό SimplePCI (Hamamatsu, Compix). Αρωματικές ουσίες και ορυκτέλαιο παρασκευάστηκαν αυτοσχέδια με μια πρώτη αραίωση σε DMSO και στη συνέχεια σειριακές αραιώσεις σε αλατούχο διάλυμα Hanks (Eurobio) συμπληρωμένο με 20 mM Hepes, ρΗ 7.2. Τα ερεθίσματα ελέγχθηκαν σε συγκεντρώσεις που δεν προκαλούν αποκρίσεις ασβεστίου σε ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα. 1 μΜ ισοπροτερενόλη (Sigma-Aldrich) εφαρμόστηκε ως ένας θετικός έλεγχος. Η 2+ σήμα Ca

μετρήθηκε ως η σχετική μεταβολή στην ένταση φθορισμού ΔF /F = (F-F

0) /F

0, όπου F

0 είναι το επίπεδο φθορισμού πριν από τη διέγερση. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως ο μέσος όρος της ΔF /F τουλάχιστον είκοσι κύτταρα.

In vitro

αξιολόγηση των γελών κυτταρικών εισβολής

κολλαγόνο τύπου Ι παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται από de Wever [19]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 48 ώρες πριν από την σπορά τους ως ένα εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων εναποτίθενται στην κορυφή των γελών κολλαγόνου τύπου Ι. Για την τόνωση της ΕΑΠ, παράγοντες οσμής και ορυκτέλαιο αραιώθηκαν πρώτα σε DMSO και στη συνέχεια στο διάλυμα κολλαγόνου Ι ή το μέσο καλλιέργειας. Οι επιδράσεις των ειδικών αναστολέων του ΡΙ3Κγ (AS605240) και βγ υπομονάδες των G πρωτεϊνών (gallein) αξιολογήθηκαν επίσης με την προσθήκη τους στη γέλη κολλαγόνου και μέσο καλλιέργειας. Για τους ελέγχους, DMSO προστέθηκε στην ίδια τελική συγκέντρωση που χρησιμοποιείται για την αραίωση αυτών των χημικών ουσιών. Η ποσότητα του προστιθέμενου DMSO να μην υπερβαίνει το 0,2% και δεν τροποποίησε τον αριθμό των μεταστατικών κυττάρων σε σύγκριση με τις δοκιμές χωρίς DMSO (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). 24 ώρες μετά την σπορά τους, επεμβατικές κύτταρα που παρουσιάζουν επεμβατική επεκτάσεις στην πηκτή κολλαγόνου και μη εισβάλλοντα κύτταρα μετρήθηκαν σε 10-15 πεδία μικροσκοπίου τυχαία επιλεγμένο. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως το ποσοστό των μεταστατικών κυττάρων (δείκτης εισβολή). Morerover, F-ακτίνη κυτταροσκελετό παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ροδαμίνη-συζευγμένα phalloidin (Invitrogen). Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν για 20 λεπτά με 3% παραφορμαλδεΰδη σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά για 15 λεπτά με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS και αποκλείστηκαν για 30 λεπτά με 2% BSA, 1% γλυκίνη σε PBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν με ροδαμίνη-φαλλοϊδίνη (1:300) σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκαν εκτεταμένα με PBS πριν παρατήρηση με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο επιφθορισμού.

Ποντίκια

Nod Scid Gamma ( NSG) αρσενικά ποντίκια είχαν εκτραφεί στις εγκαταστάσεις στέγασης των ζώων του Ινστιτούτου Gustave Roussy, με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. Πλαστικά κλουβιά συνδέθηκαν με ελεγχόμενο αερισμό ράφια. Οι κλωβοί με τα ζώα εκτίθενται στο οσφρητικών β-ιονόνη συνδέθηκαν με ένα διαχωρισμένο μονάδα εξαερισμού.

In vivo

εκτίμηση της κυτταρικής εισβολής και μεταστάσεις

LNCaP κύτταρα σε δίοδο 25 εμβολιάστηκαν σε 8 εβδομάδων ευνουχισμένα αρσενικά ποντίκια NSG (ευνουχισμού εκτελέστηκε δύο εβδομάδες πριν από τον ενοφθαλμισμό των κυττάρων). 10

6 κύτταρα αιωρήθηκαν σε 75 μι RPMI 1640 συν 75 μι Matrigel (BD Biosciences) και ένεση με μια βελόνα (26G) στον υποδόριο χώρο, σε 2 θέσεις σε κάθε πλευρά των ποντικών. Η οσφρητικών β-ιονόνη αραιώθηκε πρώτα σε DMSO σε συγκέντρωση 100 mM και στη συνέχεια στο μίγμα RPMI + Matrigel σε τελική συγκέντρωση 100 μΜ. DMSO προστέθηκε επίσης στην ίδια δόση στο μίγμα RPMI + Matrigel χωρίς οσμικού παράγοντα. Μια πρώτη ομάδα 5 ποντικών εμβολιάστηκε με κύτταρα LNCaP (παρουσία του DMSO) και δεν έλαβε περαιτέρω θεραπεία. Πέντε άλλα ποντίκια εμβολιάστηκαν με κύτταρα LNCaP (παρουσία του DMSO) και βουρτσισμένο με ορυκτέλαιο τρεις φορές την ημέρα κατά τη διάρκεια 6 εβδομάδων και, στη συνέχεια, τρεις φορές την εβδομάδα μέχρι τη θυσία. Μια τρίτη ομάδα των 5 ποντικών εμβολιάστηκε με κύτταρα LNCaP παρουσία β-ιονόνη σε DMSO. Αυτοί οι ποντικοί βουρτσίζονται με 1 mM β-ιονόνη αραιώνεται άμεσα σε ορυκτέλαιο τρεις φορές την ημέρα κατά τη διάρκεια 6 εβδομάδων και στη συνέχεια τρεις φορές την εβδομάδα μέχρι τη θυσία. Πριν από τη θυσία, μερικά ζώα εξετάστηκαν για πρώτη φορά από tomoscintigraphy (SPECT, NanoSPECT /CT Bioscan) χρησιμοποιώντας

99mTc-MDP, ένα κλασικό παράγοντα σπινθηρογράφημα οστών για τη λειτουργική απεικόνιση του οστού. Η ανάλυση αυτή δεν έγινε σε όλα τα ζώα, επειδή εμφανίστηκε λιγότερο κατατοπιστική από ακτίνες Χ στη μελέτη μας. Έτσι, όλα τα ποντίκια είχαν διερευνηθεί

in vivo από

τομογραφίας με μικροϋπολογιστή (μCT) (CT120, General Electric Healthcare) για την ανίχνευση μετάσταση στα οστά. 360 Χ προβολές ακτίνων συλλέχθηκαν σε 1 ° βήματα (100 kVp, 50 mA, 20 msec έκθεσης) για περίπου 5 λεπτά συνολικό χρόνο σάρωσης. Εικόνες ανακατασκευάστηκαν σε 3D όγκους (ψήφισμα 50 μm) σε ένα σύμπλεγμα ανακατασκευή χρησιμοποιώντας έναν τροποποιημένο αλγόριθμο conebeam σκηνή-FDK (GE λογισμικού ανασυγκρότησης). 3D δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας MicroView (GE Healthcare). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε για πρώτη φορά σε μεμονωμένες φέτες (αξονική, στεφανιαία, οβελιαία) στη συνέχεια ανακατασκευάστηκε όγκους και τις εικόνες ΠΕΠ (Προβολή μέγιστης έντασης). Τα ζώα θυσιάστηκαν όταν το μέγεθος του όγκου ξεπέρασε 1.500 χιλιοστά

3. Κατά την αυτοψία, οι όγκοι και οι ιστοί που είναι γνωστό ότι φιλοξενούν μεταστάσεις από όγκους του προστάτη, όπως λεμφαδένες, τους πνεύμονες και αγκάθια, ελήφθησαν δείγματα. Το συκώτι και Tyson αδένες επίσης δειγματοληψία, μερικοί συκώτια εμφανίζονται ανώμαλα και μερικά Tyson αδένες εκπληκτικά μεγάλο. Οι ιστοί μονιμοποιήθηκαν για 24 ώρες σε φορμαλδεΰδη στη συνέχεια αποθηκεύονται σε 70% αιθανόλη στους 4 ° C. Για αγκάθια, απασβέστωση πραγματοποιήθηκε από μία επιπλέον επώαση σε 10% EDTA, ρΗ 7,4, στους 4 ° C κατά τη διάρκεια μιας εβδομάδας. Όλα τα δείγματα αφυδατώθηκαν σε αιθανόλη και περιλαμβάνονται σε παραφίνη. Διαδοχικές τομές πάχους 5 μm παρασκευάσθηκαν και αποκηρωμένο σε τολουόλιο και επανυδατώθηκαν σε αιθανόλη και στη συνέχεια νερό. Ορισμένα τμήματα βάφτηκαν με hemalun (RAL), ηωσίνη και σαφράν (χρώση HES). Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε σε άλλα τμήματα χρησιμοποιώντας αντι-PSGR (LS-A6332, Cliniscience), αντι-PSA (ab9537, Abcam), ή ορού κουνελιού ως ένας αρνητικός έλεγχος, το Vectastain Elite ABC-υπεροξειδάσης Kits IgG Κουνελιού (Cliniscience), και ένα DAB αποκάλυψη (SK-4100, Vector).

Αποτελέσματα

ΕΑΠ ενδογενώς εκφράζονται από κύτταρα BON

από τα κύτταρα BON εμφανίσει μια ετερογενή μορφολογία, απομονώσαμε ομοιογενές υποκλώνους. Ή έκφραση ερευνήθηκε με ένθετη PCR σε cDNA από εννέα κλώνους χρησιμοποιώντας εκφυλισμένους εκκινητές στόχευσης ή διατηρημένες περιοχές, και αλληλούχιση των προϊόντων PCR. Διαπιστώσαμε ΕΑΠ μεταγραφές σε έξι από τους κλώνους (Πίνακας S1). Μεταξύ αυτών, πέντε εμφανίζεται έκφραση του περισσότερες από μία ή γονίδιο ή ψευδογονίδιο, και το πάνελ του ΕΑΠ προσδιορίζονται κυμαινόταν από κλώνο σε κλώνο. Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε ένθετη PCR με εκκινητές που στοχεύουν ειδικά τα παλαιότερα εντοπιστεί ΕΑΠ. Στην πραγματικότητα όλοι οι εννέα κλώνοι εξέφρασαν ΙΑΠ μεταγραφές (Πίνακας 1) και ορισμένα από αυτά (OR7D2, OR1F1) βρέθηκαν στις περισσότερες των κλώνων. Πρέπει να τονιστεί ότι OR7A17, OR7D2 και OR2A1 μεταγραφές βρίσκονται επίσης σε αρκετές όγκους (EST που αναφέρονται στη βάση δεδομένων Horde).

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω ότι, σε αντίθεση με ΛΤΔ, κύτταρα BON συν-εκφράζουν διάφορες ΕΑΠ, αναλύσαμε ή έκφραση στο επίπεδο του ενός κυττάρου. Κατορθώσαμε ενίσχυση cDNAs που αντιστοιχούν σε GAPDH ή β-ακτίνης για τα περισσότερα κύτταρα που δοκιμάστηκαν, αλλά ή τα cDNA θα μπορούσαν να ενισχυθούν μόνο για λίγα κύτταρα, πιθανώς λόγω του πολύ χαμηλού επιπέδου του OR mRNAs στο επίπεδο του ενός κυττάρου. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ορισμένα μεμονωμένα κύτταρα BON να συν-εκφράζουν περισσότερο από ένα ή μεταγραφή (Σχήμα S1a).

Η ετερόλογη λειτουργική έκφραση του ΕΑΠ στα κύτταρα BON

Από τα κύτταρα BON εκφράζουν ενδογενώς ΕΑΠ, έχουμε Συμπεραίνουμε ότι θα μπορούσαν επίσης να εκφράσουν ετερόλογα λειτουργική ΕΑΠ μετά από επιμόλυνση του OR1G1 και OR17-40 γονίδια. κύτταρα ΒΟΝ φάνηκε να εκφράζουν αυτά τα ετερόλογα υποδοχείς και να τους εκθέσει στην πλασματική μεμβράνη (Εικόνα S1b). Βρήκαμε επίσης στα κύτταρα BON τα πρακτικά της REEP1, μια πρωτεΐνη η οποία διευκολύνει ή έκφραση σε ΛΤΔ [20] (Σχήμα S1c). Στη συνέχεια αποδειχθεί ότι οι υποδοχείς εκφράζονται ετερόλογα είναι λειτουργικά, επάγοντας μια απόκριση ασβεστίου όταν διεγείρονται με τις αντίστοιχες συνδέτη τους (1-εννεανόλη για OR1G1 και HELIONAL για OR17-40 [18], [21]) (Σχήμα 1). Η απόκριση ασβεστίου που προκαλείται από διέγερση του υποδοχέα OR17-40 είναι λιγότερο έντονη από εκείνη που προκαλείται από διέγερση του υποδοχέα OR1G1, αλλά παραμένει σημαντική. Διαφορές μεταξύ Ή απάντηση των επιπέδων μπορεί να οφείλεται σε διαφορετικά επίπεδα έκφρασης των υποδοχέων, σε ένα διαφορετικό αποτελεσματικότητα σύζευξης με τα ενδογενή G-πρωτεΐνες ετερόλογα κύτταρα, ή σε ένα διαφορετικό αποτελεσματικότητα των συνδετήρων που χρησιμοποιούνται. Mock-επιμολυσμένα κύτταρα δεν ανταποκρίνονται σε ισοεννεανόλη ούτε HELIONAL, που δείχνουν ότι οι ουσίες για δοκιμή δεν είναι αγωνιστές των ΙΑΠ ενδογενώς εκφράζονται σε κύτταρα BON.

κύτταρα BON επιμολύνθηκαν παροδικά να εκφράσουν OR1G1 ή OR17-40 υποδοχείς. 72h αργότερα, τα κύτταρα φορτώθηκαν με fluo-4 και διεγέρθηκαν με τις αντίστοιχες οσφρητικών συνδετών των επιμολυσμένων ΙΑΠ (1-εννεανόλη και HELIONAL). Οι αποκρίσεις ασβεστίου λόγω της αλληλεπίδρασης μεταξύ της OR και των ειδικών οσφρητικών αγωνιστής του εκφράζεται ως η μεταβολή μέσο φθορισμό ΔF /F (%). (Ανοιχτοί κύκλοι) OR1G1 κύτταρα, 1-εννεανόλη? (Γεμάτο διαμάντια) OR17-40 κύτταρα, HELIONAL? μπάρες δείχνουν την τυπική απόκλιση (η = 3). Mock-επιμολυσμένα κύτταρα δεν ανταποκρίνονται σε 1-ισοεννεανόλη ούτε HELIONAL.

Η

OR-επαγόμενη αύξηση της κυτταρικής εισβολής

Χρησιμοποιώντας κύτταρα BON ετερόλογα εκφράζουν OR1G1 ή OR17-40 υποδοχείς, αξιολογήσαμε η διεισδυτικότητα του κολλαγόνου τύπου Ι γελών [19] από αυτά τα κύτταρα, διεγείρονται ή όχι με τις οσφρητικών αγωνιστές αυτών των ΕΑΠ. Εν τη απουσία οσφρητικών διέγερσης, η διηθητικότητα των κυττάρων ΒΟΝ δεν τροποποιήθηκε από ετερόλογη έκφραση του ΕΑΠ (ο δείκτης εισβολή παραμένει γύρω στο 3%, Σχήμα 2Α). Ισοεννεανόλη διέγερση αύξησε σημαντικά το δείκτη εισβολή του OR1G1 κυττάρων που εκφράζουν (OR1G1 κύτταρα) από έναν παράγοντα 2.7, ενώ HELIONAL διέγερση αύξησε το δείκτη εισβολή OR17-40 κυττάρων κατά ένα συντελεστή 2,5 (Σχήμα 2α). Παρατηρήσαμε ότι το 10

-6 και 10

-7 Μ ισοεννεανόλη που προκαλείται από το ίδιο επίπεδο εισβολή, ενώ 10

-6 Μ εμφανίστηκε πιο αποτελεσματική στην ενεργοποίηση OR1G1 σε πειράματα απεικόνισης ασβεστίου. Αυτό μπορεί να οφείλεται στην ανικανότητα των κυττάρων ΒΟΝ να φθάσουν μεγαλύτερα επίπεδα εισβολή (περίπου 10% επεμβατική κύτταρα). Ισοεννεανόλη και HELIONAL δεν είχε σημαντική επίδραση στις ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου. Ισοεννεανόλη δεν είχε σημαντική επίδραση στην OR17-40 κύτταρα που εκφράζουν, ούτε HELIONAL για OR1G1 κύτταρα που εκφράζουν. Επιπλέον, βανιλλίνη, ένας ανταγωνιστής του υποδοχέα OR1G1 [22], ήταν σε θέση να αντισταθμίσει συγκεκριμένα την διεισδυτικότητα που προκαλείται από ισοεννεανόλη σε OR1G1 κύτταρα. Ο δείκτης εισβολή των κυττάρων ελέγχου που διεγείρονται από μόνη εννεανόλη ή από ένα μίγμα εννεανόλη και βανιλλίνης ήταν αμετάβλητη (Σχήμα 2α). Διηθητική κυτταρική επεκτάσεις σε πηκτώματα Ι, που χαρακτηρίζουν τις μεταστατικών κυττάρων κολλαγόνο τύπου, παρατηρήθηκαν επίσης μετά από ανοσοϊστοχημικής της cystoskeleton F-ακτίνης (Σχήμα 2β). Όλα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι,

in vitro,

ΙΑΠ διέγερση με παράγοντες οσμής μπορεί να προωθήσει ειδικά διεισδυτικότητα των OR-καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν.

(α) κύτταρα ΒΟΝ διαμολύνθηκαν παροδικά να εκφράσουν OR1G1 ή OR17-40 υποδοχείς ή ψευδο-επιμολυσμένα. Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί πηκτών κολλαγόνου τύπου Ι και διεγείρεται από τις αντίστοιχες οσφρητικών συνδετών OR1G1 και OR17-40 υποδοχέων (ισοεννεανόλη: αγωνιστής OR1G1, βανιλλίνη: ανταγωνιστής OR1G1, HELIONAL: OR17-40 αγωνιστή). Διηθητική κύτταρα μετρήθηκαν 24 ώρες αργότερα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο δείκτης εισβολή. (Β) Τροποποίηση της F-ακτίνης του κυτταροσκελετού των κυττάρων ΒΟΝ σε μήτρες κολλαγόνου τύπου Ι. F-ακτίνη αποκαλύφθηκε με ροδαμίνη-συζευγμένα φαλλοειδίνη. Τα επεκτατικά επεκτάσεις σε πηκτώματα κολλαγόνου που χαρακτηρίζουν μεταστατικών κυττάρων υποδεικνύονται με βέλη. (Γ) κύτταρα LNCaP σπάρθηκαν σε πήγματα κολλαγόνου τύπου Ι και διεγείρεται από προσδέματα PSGR (β-ιονόνη: αγωνιστής, α-ιονόνη: ανταγωνιστής). Διηθητική κύτταρα μετρήθηκαν 24 ώρες αργότερα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο δείκτης εισβολή σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου χωρίς οσμικού παράγοντα διέγερσης. Τυπική απόκλιση του ελέγχου ήταν 13,42%. Στατιστικά πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα two-tailed test Student και μπάρες δείχνουν την τυπική απόκλιση (n = 3).

Η

Εμείς επιβεβαίωσε αυτό το αποτέλεσμα, χρησιμοποιώντας τα LNCaP κύτταρα καρκίνου προστάτη που εκφράζουν ενδογενώς μια Ή, το PSGR. Αυτός ο υποδοχέας έχει γνωστό αγωνιστή και ανταγωνιστή Αρωματικές ουσίες [12], αντίστοιχα, το β-ιονόνη και α-ιονόνη. Χρησιμοποιήσαμε μία συγκέντρωση 100 μΜ β-ιονόνη να διεγείρουν τα κύτταρα LNCaP, δεδομένου ότι αυτή η δόση είχε ήδη αναφερθεί για την τόνωση της PSGR [12] και προκάλεσε την υψηλότερη ικανότητα εισβολής των κυττάρων LNCaP στα χέρια μας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2c, η διέγερση του PSGR με 100 μΜ β-ιονόνη αυξημένη ικανότητα εισβολής των κυττάρων LNCaP με τον συντελεστή 2,75 και αυτό το αποτέλεσμα ήταν εντελώς καταργήθηκε από τον ανταγωνιστή α-ιονόνη. Μόνος, αυτός ο ανταγωνιστής δεν είχε επίδραση επί LNCaP κύτταρα επίπεδο εισβολή. Ενώ δεν υπάρχει αρνητικός μάρτυρας με LNCaP κύτταρα που δεν εκφράζουν PSGR, η δραστική φαρμακολογική δράση των α-ιονόνη συνηγορεί υπέρ ενός συγκεκριμένου αποτελέσματος της β-ιονόνη μέσω διέγερσης PSGR. Αποκλεισμός μη ειδική χημική επίδραση του β-ιονόνη σε κύτταρα LNCaP επάγει διεισδυτικότητα υποστηρίζεται επίσης από το γεγονός ότι α-ιονόνη, η οποία είναι πολύ παρόμοια με β-ιονόνη και εφαρμόστηκε σε διπλάσια δόση β-ιονόνη, δεν προκάλεσε διεισδυτικότητα των κυττάρων LNCaP. Επιπλέον, ελέγξαμε την επίδραση 100 μΜ β-ιονόνη στην ικανότητα εισβολής των κυττάρων PC3, άλλα καρκινικά κύτταρα του προστάτη που δεν εκφράζουν το PSGR [12], και δεν παρατηρήσαμε αυξημένη ικανότητα εισβολής σε αυτά τα κύτταρα. Τα πειραματικά αποτελέσματα που περιγράφονται παρακάτω, επίσης, υποστηρίζουν την ιδέα ότι LNCaP εισβολής μπορεί να ενισχυθεί μέσω της διέγερσης PSGR.

Συμμετοχή των ΡΙ3Κγ στο κελί εισβολής που προκαλείται από ΕΑΠ

ενεργοποίηση ΡΙ3Κγ μέσω GPCRs μπορούν να συμμετέχουν στο μετασχηματισμό λειτουργίες όπως ως εισβολή [23], και μια στιχομυθία μεταξύ οσφρητικών σηματοδότησης και ΡΙ3Κγ περιγράφηκε στο οσφρητικό αισθητήριους νευρώνες [24], [25]. Έτσι διερευνηθεί κατά πόσον ΡΙ3Κγ θα μπορούσε να είναι μέρος του μονοπατιού σηματοδότησης που πυροδοτείται από την οσφρητικών ενεργοποίηση της ΕΑΠ και προάγει την κυτταρική εισβολής. Πρώτα έδειξαν την έκφραση του ΡΙ3Κγ σε κύτταρα ΒΟΝ και LNCaP με ακατέργαστα προϊόντα λύσης ανοσοκηλιδώσεως με ένα αντίσωμα στόχευσης ΡΙ3Κγ (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια αξιολογείται η διεισδυτικότητα των κυττάρων ΒΟΝ hetorologously εκφράζουν OR1G1 ή του LNCaP κυττάρων κατά τη διέγερση με αγωνιστές του OR1G1 ή PSGR, υπό την παρουσία ενός ειδικού αναστολέα του ΡΙ3Κγ (AS605240). 10

-6M του AS605240 έχουν αναφερθεί ότι αναστέλλουν εντελώς ΡΙ3Κγ [26]. Όσον αφορά τα κύτταρα BON, χρησιμοποιώντας 10

-6M και 10

-7M της AS605240, βρήκαμε μια παρόμοια μεγάλη (περίπου 80%), αλλά όχι συνολική μείωση της εισβολής των κυττάρων που προωθείται από OR1G1 κατά τη διέγερση ισοεννεανόλη (Σχήμα 3), υποδεικνύοντας ότι η μέγιστη επίδραση παρατηρείται σε 10

-7M της AS605240. Έτσι, ΡΙ3Κγ φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στη μεσολάβηση διεισδυτικότητα κυττάρων ΒΟΝ προωθείται από το ή διέγερση από ειδικά οσφρητικών του, έστω και αν μπορεί επίσης να εμπλέκονται άλλες οδούς σηματοδότησης. Συμμετοχή της ΡΙ3Κγ επιβεβαιώθηκε για τα κύτταρα LNCaP (Σχήμα 3). Ωστόσο, σε αντίθεση με τα κύτταρα BON, ΡΙ3Κγ αναστολέας AS605240 προκάλεσε μείωση των LNCaP εισβολής, ακόμη και κατά την απουσία της διέγερσης PSGR. Ως εκ τούτου, ΡΙ3Κγ φαίνεται να εμπλέκεται επίσης στην βασική διηθητικότητα των κυττάρων LNCaP. Επιπλέον, δεδομένου ότι ΡΙ3Κγ μπορεί να ενεργοποιηθεί από το G

βγ υπομονάδων των πρωτεϊνών G μέσω της ενεργοποίησης GPCR [27], χρησιμοποιήσαμε gallein, ένα G

βγ υπομονάδες αναστολέα που παρεμβαίνει στην αλληλεπίδραση του G

βγ υπομονάδες με ΡΙ3Κγ [28], και έδειξε ότι παρεμπόδισαν την ενίσχυση της διεισδυτικότητας LNCaP κυττάρων που προκαλείται από διέγερση PSGR (Σχήμα 3). Το αποτέλεσμα αυτό υποστηρίζει επίσης τη συμμετοχή του ΡΙ3Κγ στην διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων που προκαλείται από ή διέγερση.

κύτταρα ΒΟΝ ετερόλογα εκφράζουν τον υποδοχέα OR1G1 σπάρθηκαν σε πήγματα κολλαγόνου τύπου Ι και διεγέρθηκαν με νονανόλη (αγωνιστής OR1G1) στο παρουσία ενός ειδικού αναστολέα ΡΙ3Κγ (AS605240). LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε πήγματα κολλαγόνου τύπου Ι και διεγέρθηκαν με β-ιονόνη (αγωνιστής PSGR) παρουσία ενός ειδικού αναστολέα ΡΙ3Κγ (AS605240) ή ένας αναστολέας της υπομονάδες βγ των G πρωτεϊνών (gallein). Διηθητική κύτταρα μετρήθηκαν 24 ώρες αργότερα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο δείκτης εισβολή σε σχέση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (χωρίς οσφρητικών ούτε AS605240 ούτε gallein). Τυπική απόκλιση του ελέγχου ήταν 4,74% για τα κύτταρα ΒΟΝ ελέγχου και 13,86% για τα κύτταρα LNCaP ελέγχου. Στατιστικά πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα two-tailed test Student και μπάρες δείχνουν την τυπική απόκλιση (n = 3).

Η

Η ενεργοποίηση που προκαλείται από την ενίσχυση των καρκινικών κυττάρων εισβολής

in vivo

Η

από

in vitro

ενίσχυση της κυτταρικής εισβολής από την ενεργοποίηση ΕΑΠ προτείνει έναν πιθανό ρόλο του (τουλάχιστον μερικά) ΕΑΠ στη μετάσταση εμφάνιση

in vivo

, θα εμβολιάζονται τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη LNCaP υποδορίως σε ανοσοανεπάρκεια NSG (NOD SCID γ) ποντίκια. Τα ζώα είτε αφέθηκαν χωρίς θεραπεία, ή καθημερινά βουρτσισμένο στο δέρμα με αγωνιστή PSGR β-ιονόνη αραιωμένο σε ορυκτέλαιο (ένα ελαιώδες έκδοχο που απαιτούνται για να εφαρμόσει τις λιπόφιλες ουσίες για πάνω από το δέρμα ποντικών), ή μόνο με ως έλεγχο ορυκτέλαιο. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε και μεταστάσεις ανιχνεύθηκαν με

in vivo απεικόνιση και

με ανοσοϊστοχημεία μεταθανάτια χρησιμοποιώντας αντισώματα που στοχεύουν PSGR ή PSA (ειδικό προστατικό αντιγόνο) (παραδείγματα των σπονδυλικής στήλης και των πνευμόνων μεταστάσεις εμφανίζονται στο Σχήμα 4). έκφραση PSGR ανιχνεύθηκε σε πρωτογενείς όγκους και σε όλες τις μεταστάσεις (βλέπε άλλα παραδείγματα στην Εικόνα S2), επιβεβαιώνοντας ότι αυτός ο υποδοχέας ήταν παρούσα και πιθανόν ενεργοποιούνται κατά τη διάρκεια των πειραμάτων μας. Χωρίς θεραπεία, μεταστάσεις προέκυψε κυρίως στη βουβωνική κόμβους και occasionnally στη σπονδυλική στήλη και στο ήπαρ (Σχήμα 4α). Μεταστάσεις που βρίσκεται στη βουβωνική κόμβους είχαν αναπτυχθεί καλά, ενώ αυτές που βρίσκονται στη σπονδυλική στήλη και στο ήπαρ ήταν μικρομεταστάσεων. Ο αριθμός των μεταστάσεων αυξήθηκε κατά την κατεργασία με ορυκτέλαιο και εντοπισμός τους ήταν περισσότερο ποικιλόμορφη παρουσία β-ιονόνη. Στην πραγματικότητα, μεταστάσεις εμφανίστηκε στους πνεύμονες και Tyson αδένες μόνο για ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με β-ιονόνη (3 από τα 5 ζώα για Tyson αδένες και 2 από τα 5 ζώα για τους πνεύμονες). Επιπλέον, μεταστάσεις βρίσκεται στην Tyson αδένες ήταν ιδιαίτερα ανεπτυγμένη, με μεγέθη που πλησιάζει 1.000 χιλιοστά

3. Στους πνεύμονες, μόνο ανιχνεύθηκαν μικρομεταστάσεις, όπως στην σπονδυλική στήλη και στο ήπαρ. Δεδομένου ότι τα ποντίκια δεν θυσιάστηκαν κατά την ίδια στιγμή, αλλά ανάλογα με το μέγεθος του όγκου, δείχνουμε στα Σχήματα 5β και 5γ την εξέλιξη με τον χρόνο του αριθμού των μεταστάσεων, σύμφωνα με τον αριθμό των θυσιάστηκαν ποντίκια και ο μέσος αριθμός των μεταστάσεων ανά ποντικό κατά τη στιγμή της θυσίας για κάθε πειραματική ομάδα. Παρατηρήσαμε ότι τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ορυκτέλαιο ή β-ιονόνη έπρεπε να θυσιαστούν νωρίτερα, λόγω της ταχύτερης ανάπτυξης του όγκου, και ότι εμφανίζεται μία σημαντική αύξηση στον αριθμό μεταστάσεων σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ποντικούς. Παράλληλα παρατηρήσαμε επίσης ότι οι όγκοι που αναπτύσσονται σε 85% των εμβολιασμένων τοποθεσίες σε χωρίς θεραπεία ποντικούς, ενώ ήταν λιγότερο πολυάριθμες (50%) σε ορυκτέλαιο ή β-ιονόνη ποντικούς που υπέστησαν αγωγή.

μεταστάσεις υποδεικνύονται με βέλη. Στην σπονδυλική στήλη, μεταστάσεις παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας τομογραφίας με μικροϋπολογιστή (Προβολή μέγιστης έντασης) και επιβεβαιώθηκε μετά τη σφαγή από χρώση HES και ανοσοϊστολογία χρησιμοποιώντας αντι-PSA (ειδικό προστατικό αντιγόνο) και αντισώματα αντι-PSGR (μόνο ένα παρουσιάζεται μετάσταση). Στους πνεύμονες, μεταστάσεις χαρακτηρίζονται από HES χρώση και ανοσοϊστολογία χρησιμοποιώντας αντισώματα αντι-ΡδΑ και αντι-PSGR

Η

(α) Ο αριθμός των μεταστάσεων παρατηρείται σε διάφορους ιστούς μετά από ποντικούς θυσιάσει (λευκά:. Μη επεξεργασμένο έλεγχο ποντίκια, γκρι: ποντίκια που αντιμετωπίστηκαν με ορυκτέλαιο, μαύρο: ποντίκια που αντιμετωπίστηκαν με 1 mM β-ιονόνη σε ορυκτέλαιο). (Β) Σωρευτική αριθμός των μεταστάσεων, ανεξάρτητα από τη θέση τους, ως συνάρτηση του χρόνου που παρήλθε μεταξύ των κυττάρων LNCaP εμβολιασμό και ποντίκια θυσιάσει (λευκά: χωρίς θεραπεία ποντικών ελέγχου, γκρι: ποντίκια που αντιμετωπίστηκαν με ορυκτέλαιο, μαύρο: ποντίκια που αντιμετωπίστηκαν με 1 mM β β-ιονόνη σε ορυκτέλαιο). Τα ποντίκια θυσιάστηκαν όταν το μέγεθος του όγκου ξεπέρασε 1.500 χιλιοστά

3. Ο αριθμός των ποντικών θυσιάζονται ενδείκνυται σε παρένθεση για κάθε χρονικό σημείο και σε κάθε ομάδα ποντικών. (Γ) Καμπύλες αναφοράς τις αναλογίες του αριθμού των μεταστάσεων πάνω από τον αριθμό των θυσιάστηκαν ποντίκια ως συνάρτηση του χρόνου (μαύρο διακεκομμένες: ποντίκια ελέγχου χωρίς θεραπεία, γκρι: ποντίκια που αντιμετωπίστηκαν με ορυκτέλαιο, μαύρο: ποντίκια που αντιμετωπίστηκαν με 1 mM β-ιονόνη σε ορυκτέλαιο).

η

Τα αποτελέσματα με το ορυκτέλαιο ήταν ενδιαφέρουσα. Επειδή ΕΑΠ μπορεί να ενεργοποιηθεί από διαφορετικά μόρια [2], [12], [18], ερευνήσαμε αν ορυκτέλαιο μπορεί να τονώσει την PSGR σε

in vitro

προσδιορισμούς κυτταρικής εισβολής και πειράματα απεικόνισης ασβεστίου. Ορυκτέλαιο αυξηθεί τόσο η διεισδυτικότητα και η ασβεστούχα απόκριση των κυττάρων LNCaP, και ο ανταγωνιστής PSGR α-ιονόνη ακύρωσε αυτές τις επιδράσεις (Σχήμα 6 a, b). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι ένα συστατικό ορυκτέλαιο διεγερμένα LNCaP κύτταρα μέσω του PSGR, προωθώντας διεισδυτικότητα τους. Επιπλέον, τα κύτταρα LNCaP διεισδυτικότητα επάγεται από ορυκτέλαιο αναστάλθηκε από ΡΙ3Κγ ή G

αναστολείς βγ υπομονάδες (αντίστοιχα AS605240 και gallein), καταδεικνύοντας ότι ΡΙ3Κγ εμπλέκεται στη διαδικασία αυτή, καθώς εμπλέκεται στην κυτταρική διεισδυτικότητα που προκαλείται από β-ιονόνη. Ωστόσο, ακόμη και αν ορυκτέλαιο ενισχυμένη μετάσταση εμφάνιση, μετάσταση εμφάνιση ήταν ακόμα πιο έντονη σε παρουσία του β-ιονόνη, με αποτέλεσμα τα κύτταρα εξαπλώνονται σε πνεύμονες και Tyson αδένες που συνέβη μόνο με την παρουσία του β-ιονόνη. Όλα αυτά τα στοιχεία συγκλίνουν για να αποδειχθεί ότι η διέγερση μιας OR, το PSGR, μπορεί να συμβάλει στη διάδοση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη και στην παραγωγή μεταστάσεων.

(α) LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν σε πήγματα κολλαγόνου τύπου Ι και διεγέρθηκαν με ορυκτέλαιο ή ορυκτέλαιο αναμειγνύονται με 10

-4M β-ιονόνη, 2.10

-4M α-ιονόνη, 10

-7M AS605240 ή 10

-5M gallein. Ορυκτέλαιο αραιώθηκε πρώτα 1/4 σε DMSO (ορυκτέλαιο δεν διαλύθηκε εντελώς σε αυτήν τη δόση, αλλά αυτό μας επέτρεψε να περιμένουμε μια πολύ μεγάλη διαλυτοποίηση των συστατικών ορυκτέλαιο) και το διάλυμα στη συνέχεια αραιώνεται 1/1000 στο μέσο καλλιέργειας ή κολλαγόνο Ι τζελ. Διηθητική κύτταρα μετρήθηκαν 24 ώρες αργότερα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ο δείκτης εισβολή σε σχέση με εκείνη των κυττάρων ελέγχου (μόνο με το DMSO). Μπάρες δείχνουν την τυπική απόκλιση. Τυπική απόκλιση του ελέγχου ήταν 3,67%.