Αφηρημένο

Στόχος

Η ικανότητα να προβλέπουν απαντήσεις σε χημειοθεραπεία για ορώδες επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) θα είναι πολύτιμη, δεδομένου ΕΓΚ ασθενείς εγγενώς χημειοθεραπεία (επίμονη ή υποτροπιάζουσα νόσο μέσα σε 6 μήνες) κέρδος μικρό όφελος από την κλασική χημειοθεραπεία. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να ελέγξουν και να εντοπίσει διακριτικό βιοδεικτών σε ασκίτη του ορώδες ΕΓΚ που συνδέονται με την εγγενή χημειοαντίσταση.

Μέθοδοι

Τα δείγματα πρωτεΐνης από ασκίτη των 12 χημειοευαίσθητων και 7 εγγενώς χημειοθεραπεία ΕΓΚ ασθενείς ορώδες ήταν αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δύο διαστάσεων διαφορά φθορισμού σε ηλεκτροφόρηση πηκτής (2-D ΨΗΦΟ) συζευγμένο με υποβοηθούμενης από μήτρα εκρόφησης λέιζερ /ιονισμού χρόνου-πτήσης φασματομετρίας μάζας (MALDI-TOF /TOF MS). Επιπλέον, οι προσδιορίζονται πρωτεΐνες επικυρώθηκαν με ELISA σε δείγματα ασκίτη από 19 χημειοευαίσθητων και 9 ΕΓΚ ασθενείς εγγενώς στη χημειοθεραπεία.

Αποτελέσματα

Ο αριθμός των κηλίδων ανιχνεύονται σε όλα τα τζελ 2-D ΨΗΦΟ κυμαίνονταν από 1523 -1711 χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης DeCyder. Τριάντα τέσσερα σημεία εκφράστηκαν διαφορικά με βάση τα κριτήρια του μέσου δείκτη πάνω από 1,5 και ένα t-test σπουδαστών

P

αξία & lt? 0,05. Μετά την ανάλυση MALDI-TOF /TOF MS, 11 διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων 3 επάνω ρυθμισμένη και 8 κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες, σε ασκίτες από χημειοθεραπεία όγκων ταυτοποιήθηκαν επιτυχώς. Από τις τέσσερις επιλεγμένες πρωτεΐνες (σερουλοπλασμίνη, απολιποπρωτεΐνη Α-IV, τρανσθυρετίνης και απτοσφαιρίνης) σε ασκίτη δοκιμάστηκαν με ELISA, μόνο σερουλοπλασμίνη ήταν παρούσα σε σημαντικά διαφορετικά επίπεδα μεταξύ του χημειοθεραπεία και νόσο ευαίσθητη δείγματα ασκίτη με μέσες συγκεντρώσεις 192,2 μg /ml και 157.5 μg /ml, αντίστοιχα (

P

= 0,001).

Συμπέρασμα

Η σημαντική up-ρυθμιζόμενη επίπεδο σερουλοπλασμίνης στο ρευστό ασκίτη των εγγενών στη χημειοθεραπεία ΕΓΚ ασθενείς ορώδες δείχνει τις δυνατότητές της ως ένας προγνωστικός βιοδείκτη για αποκρίσεις σε χημειοθεραπεία. Το εύρημα αυτό ζητά περαιτέρω έρευνα με μια μεγαλύτερη μελέτη προκειμένου να επικυρώσει την κλινική χρησιμότητα της σερουλοπλασμίνης

Παράθεση:. Huang Η, Li Υ, Liu J, Zheng Μ, Feng Υ, Χου K, et al. (2012) και την ταυτοποίηση βιοδεικτών σε ασκίτη σχετίζονται με την πραγματική χημειοαντίσταση της υδαρής Τα επιθηλιακά ωοθηκών. PLoS ONE 7 (12): e51256. doi: 10.1371 /journal.pone.0051256

Επιμέλεια: Αλέξανδρος James Roy Επίσκοπος, το Πανεπιστήμιο του Τέξας Επιστήμη Κέντρο Υγείας στο San Antonio, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Ιούν, 2012? Αποδεκτές: 30 Οκτώβρη 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 του Δεκέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Guangdong, Κίνα (Νο 7001535). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

με βάση την πλατίνα συνδυασμό χημειοθεραπείας είναι η τυπική θεραπεία πρώτης γραμμής για το προχωρημένο στάδιο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC). Οι όγκοι θεωρούνται «πλατίνα ευαίσθητα» αν το διάστημα κλινική χωρίς εξέλιξη είναι περισσότερο από 6 μήνες, αλλά περίπου 20% έως 30% των ασθενών προόδου ή όγκων τους ταχέως καθίστανται ανθεκτικά σε αυτή τη θεραπεία [1]. Αυτοί οι ασθενείς με ενδογενή χημειοαντίσταση που βιώνουν μια υποτροπή εντός έξι μηνών να αποκτήσουν μικρό όφελος από τη συνήθη θεραπεία. Υπάρχει επίσης στοιχεία που δείχνουν ότι το μεγαλύτερο το διάστημα έως την υποτροπή, τόσο καλύτερη είναι η ταχύτητα απάντησης σε μεταγενέστερη χημειοθεραπεία [2]. Ως εκ τούτου, χημειοαντίσταση για καρκίνους των ωοθηκών μπορεί να είναι παρόντες κατά την έναρξη της θεραπείας (εγγενής αντίσταση) ή μπορεί να αναπτυχθεί κατά τη διάρκεια της θεραπείας (επίκτητη αντοχή).

Σήμερα, χημειοαντίσταση του ΕΓΚ μπορεί να καθοριστεί μόνο εκ των υστέρων, μετά ασθενείς έχουν παρουσιάσει το βάρος και η τοξικότητα του αναποτελεσματική θεραπεία. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός των χαρακτηριστικών μοριακών δεικτών που σχετίζονται με την εγγενή χημειοαντίσταση στην EOC μπορεί να οδηγήσει σε ατομικά προσαρμοσμένη θεραπευτική και τη βελτίωση των αποτελεσμάτων από την κλασική χημειοθεραπεία τους παρέχει πολύ λίγο όφελος.

Αρκετές πρόσφατες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει γονίδιο microarrays να προσδιορίσει διακριτά γονιδιακής έκφρασης σε ασθενείς με εγγενή στη χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών σε διαφορετικές πλατφόρμες, όπως συστοιχίες cDNA νάιλον, Affymetrix μάρκες και Agilent ολιγονουκλεοτιδίων μικροσυστοιχίες [3], [4]. Αυτές οι μελέτες έχουν εντοπίσει διαφορετικές προγνωστικές και προγνωστικός γονίδια τα οποία μπορούν να διακρίνουν νωρίς από αργά υποτροπή ή εξέλιξη της νόσου. Ωστόσο, η μεταγραφή ενός γονιδίου στόχου στον όγκο δεν μπορεί να είναι μια καλή ένδειξη της ανθεκτικότητας στα φάρμακα και την πρόγνωση για τον καρκίνο των ωοθηκών. Για παράδειγμα, το mRNA αφθονία μπορεί να μην συσχετίζονται με την αντίστοιχη έκφραση της πρωτεΐνης και λειτουργία. Επιπλέον, για ορισμένους ασθενείς με πρωτοπαθή ή υποτροπιάζουσα καρκίνο των ωοθηκών, δείγματα ιστού δεν είναι πάντα διαθέσιμα για γονιδιακή προφίλ.

Σε αντίθεση με άλλες πυέλου /κοιλιακό κακοήθη μετάσταση, μαζική ασκίτης είναι μια ξεχωριστή κλινική εκδήλωση σε προχωρημένο ΕΓΚ, με περισσότερους από 80% αυτών των ασθενών που έχουν ευρεία μετάσταση στους λιπώδεις επιφάνειες και συνδέονται περιτοναϊκή ή /και πλευρικές εκχύσεις [5]. Οι Σωματικά υγρά δειχθεί ότι είναι εξαιρετική πολυμέσων για βιοδείκτη ανακάλυψη στον καρκίνο, και ασκιτικό υγρό περιέχει κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα και ενεργοποιημένα μεσοθηλιακών κυττάρων, τα οποία μπορούν να παράγουν κυτοκίνες, αυξητικούς παράγοντες και συστατικά εισβολή προαγωγής που συνδέονται με εισβολή και τη μετάσταση [6]. Επομένως, η παρούσα υγρό περιέχει το secretome των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και αντανακλά άλλους παράγοντες μικροπεριβάλλον της κακοήθειας.

Έτσι, εφαρμόζοντας την τεχνική ποτέ προώθηση της πρωτεομικής με την ανάλυση του ασκίτη μπορεί να διευκολύνει την ανακάλυψη νέων βιολογικών δεικτών που είναι πιο ευαίσθητες και ειδικά από εκείνους που είναι διαθέσιμα σήμερα. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να ελέγξουν και να εντοπίσει διακριτικό βιοδεικτών σε ασκίτη του καρκίνου των ωοθηκών που σχετίζονται με τις εγγενείς χημειοαντίσταση από δύο-διαστάσεων διαφορά φθορισμού σε ηλεκτροφόρηση γέλης τεχνολογία (2D-ΨΗΦΟ), η οποία θα βοηθήσει στον εντοπισμό αυτών των ασθενών με κακή πρόγνωση και τη βελτίωση της κλινικής τους αποτέλεσμα με τις εναλλακτικές θεραπείες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Αντικαρκινικού Κέντρου Διοικητικού κριτική Θεσμικών Sun Yat-sen University. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή.

Ασθενείς και Προετοιμασία δείγματος

Συνολικά, 19 δείγματα ασκίτη για 2D-ΨΗΦΟ και 28 περιπτώσεις ασκίτη για την επικύρωση ELISA συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της περιόδου Φεβρουάριος . 1 2009 μέχρι 31 του Δεκεμβρίου του 2010 από το ανέπαφο ΕΓΚ ασθενείς ορώδες που υποβλήθηκαν σε ικανοποιητική κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση. Οι γυναίκες με προηγούμενο ιστορικό καρκίνου και των δικαιούχων εισαγωγική χημειοθεραπεία αποκλείστηκαν. Βαθμός του όγκου διεξήχθη μέσω μιας κοιλιακής τομής μέσης γραμμής. ελήφθησαν και τα αποθηκευμένα δείγματα των 5 ml ασκίτη στους 80 ° C σε υγρό άζωτο πριν από την ολική υστερεκτομή, διμερείς σαλπιγγοωοθηκεκτομή omentectomy και εκτομή όλων των ορατών και χειροπιαστή ογκώδη όγκου και λεμφαδενεκτομή, σύμφωνα με τις (NCCN) κατευθυντήριες γραμμές National Comprehensive Δίκτυο Καρκίνου . Πληροφορίες για την επεξεργασία και την ανταπόκριση ελήφθη με ανασκόπηση διαγραμμάτων ασθενή.

Μετά debulking, οι ασθενείς έλαβαν έξι κύκλους με βάση την πλατίνα συνδυασμό χημειοθεραπείας. Τα φάρμακα χημειοθεραπείας που περιλαμβάνονται πακλιταξέλη (135-175 mg /m

2), καρβοπλατίνη (περιοχή κάτω από την καμπύλη [AUC] 5-6), doxepaclitaxel (70 mg /m

2) και σισπλατίνη (65-75 mg /m

2). Με βάση τις κατευθυντήριες οδηγίες του NCCN, εγγενώς στη χημειοθεραπεία όγκοι που ορίζονται ως εκείνοι με επίμονη ή υποτροπιάζουσα νόσο εντός 6 μηνών από την έναρξη της πρώτης γραμμής με βάση την πλατίνα συνδυασμό χημειοθεραπείας. Χημειοευαίσθητους όγκοι ταξινομούνται ως εκείνα με πλήρη απόκριση σε χημειοθεραπεία και πλατίνα διάστημα χωρίς & gt?. 6 μήνες

ασκίτη φυγοκεντρήθηκαν στις 2000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C για το διαχωρισμό του υγρού από τα κυτταρικά συστατικά . Το εναιώρημα εν συντομία σε υπερήχους, και τα συντρίμμια φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο επαναιωρήθηκε και πλύθηκε τρεις φορές σε διάλυμα σακχαρόζης παγωμένο ρυθμισμένο με Tris (10 mM Tris, 250 mM σακχαρόζη, ρΗ 7,0) και στη συνέχεια αποξέστηκαν και λύθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (30 mM Tris-HCl, 7 Μ ουρία , 2 Μ θειουρία, 4% β /ο CHAPS, ρΗ 8,5).

δείγματα ασκίτη υπέστησαν επεξεργασία χρησιμοποιώντας το ProteoPrep Μπλε αλβουμίνη εξάντληση Kit (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) που αφαιρεί επιλεκτικά λευκωματίνη και IgG σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να καθαρίσει την εκχύλιση των πρωτεϊνών και καθορίζουν την τελική συγκέντρωση πρωτεΐνης, η 2-D Clean-up Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο) και 2-D Kit Quant (GE Healthcare) χρησιμοποιήθηκαν διαδοχικά.

Μελέτη και δείγμα πρωτεΐνης Σήμανση με CyDye

Δώδεκα chemosensitve δείγματα κατανέμονται ισομερώς σε δύο υποομάδες με έξι δείγματα η κάθε μία, και επτά δείγματα χημειοαντίσταση ομοίως διατεθεί σε δύο υποομάδες με τέσσερις ή τρία δείγματα το καθένα. Ίσες ποσότητες των δειγμάτων πρωτεΐνης κατά τον ίδιο υποομάδα αναμίχθηκαν και διαχωρίστηκαν σε τέσσερα ίσα κλάσματα (50 μg έκαστο). Δύο από τα δείγματα χημειοευαίσθητων δείγματος πρωτεΐνης επισημάνθηκαν με Cy3, και δύο από τα δείγματα στη χημειοθεραπεία δείγμα σημάνθηκαν με Cy5. Τα υπόλοιπα δύο χημειοευαίσθητων δείγματα στη συνέχεια επισημάνθηκαν με Cy5 και τα άλλα δύο στη χημειοθεραπεία δείγματα με Cy3. Ένα δείγμα που αποτελείται από ίσες ποσότητες όλων των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε ως το εσωτερικό πρότυπο ομαδοποιήθηκαν (50 μg) και επισημάνθηκαν με 200 pmol του Cy2. Ως εκ τούτου, ένας χημειοευαίσθητων πισίνα ασθενή (Cy3 ή Cy5), ένα στη χημειοθεραπεία πισίνα ασθενή (Cy5 ή Cy3) και ένα εσωτερικό πρότυπο (Cy2) έτρεξαν σε κάθε γέλη, με τέσσερις γέλες συνολικά με βάση το σχεδιασμό μας. Αυτή η στρατηγική εναλλαγή χρωστική εκδόθηκε προκειμένου να αποφευχθεί η προκατάληψη βαφής και αφήνονται για την ίση κατανομή των βαφών Cy και στις δύο ομάδες ασθενών.

επισήμανση πρωτεΐνης διεξήχθη με CyDye ΨΗΦΟ φθορίτες (GE Healthcare), όπως περιγράφεται στο εγχειρίδιο χρήσης Ettan ΨΗΦΟ. Εν συντομία, μετά από επώαση σε πάγο για 30 λεπτά στο σκοτάδι, 1 mL 10 mM λυσίνη προστέθηκαν για να σταματήσει η αντίδραση. Για κάθε γέλη, Cy2-, Cy3- και Cy5-σημασμένων πρωτεϊνών (50 μ§ το καθένα) αναμίχθηκαν και ρυθμίστηκε σε 450 μL με ρυθμιστικό επανυδάτωση [7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4% (w /v) CHAPS, 40 mM DTT , 1% ρυθμιστικό IPG (pH 4-7), 0,002% (w /v) βρωμοφαινόλης μπλε].

2D-ΨΗΦΟ

. Μετά την επανυδάτωση, το επισημασμένο μίγμα πρωτεΐνης για κάθε γέλη εφαρμόστηκε σε μια Immobiline DryStrip (24 cm, ρΗ 4-7? GE Healthcare). Η ισοηλεκτρική εστίαση (IEF) διεξήχθη με μία συσκευή Ettan IPGphor II (GE Healthcare) ως εξής: 30 V για 12 ώρες, 500 V για 1 ώρα, 1000 V για 1 ώρα και 10 000 V έως ένα σύνολο 85.000 Volt-ωρών . Μετά IEF, οι πρωτεΐνες μειώθηκαν και αλκυλιωμένη με διαδοχικές επεξεργασίες 15 λεπτών με ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης που περιείχε 2% (w /v) DTT, ακολουθούμενο από 2,5% (w /v) ιωδοακεταμίδιο. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια επιλύονται σε 12.5% ​​γέλες SDS-PAGE χρησιμοποιώντας ένα όργανο Ettan DALTsix (GE Healthcare). Προκειμένου να διευκολυνθεί η ανάλυση MS, ένα δείγμα μη επισημασμένη πρωτεΐνη πισίνα (500 μα) λειτουργούν παράλληλα σε ένα προπαρασκευαστικό πήκτωμα και χρώση με Deep Purple Συνολική Πρωτεΐνη Stain (GE Healthcare) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Gel Εικόνα απόκτηση και ανάλυση

εικόνες Gel αποκτήθηκαν σε Typhoon 9400 σαρωτή (Amersham Biosciences) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας DeCyder λογισμικού (V6.0, GE Healthcare) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Τα σήματα Cy2, Cy3 και Cy5 ατομικά απεικονίστηκαν με μήκη κύματος διέγερσης /εκπομπής 488/520, 532/580 και 633/670 nm, αντίστοιχα. Παρασκευαστική τζελ (Deep Purple Σύνολο Protein Stain) σαρώθηκαν με μήκη κύματος διέγερσης /εκπομπής 532/560 nm σύμφωνα με το εγχειρίδιο του χρήστη. Πρωτεΐνες σε νόσο ευαίσθητη δείγματα ασκίτη συγκρίθηκαν με εκείνα χημειοθεραπεία αυτά. Αυξήσεις ή μειώσεις της πρωτεΐνης αφθονία περισσότερο από 1,5 φορές (t-test και ANOVA,

P

& lt? 0,01) θεωρήθηκαν σημαντικές αλλαγές. Οι αντίστοιχες κηλίδες πρωτεΐνης επιλέχθηκαν στο χρωματισμένο παρασκευαστική gel για spot μάζεμα.

Πρωτεΐνη Spot Χειρισμός

Τα επιλεγμένα σημεία πρωτεΐνη στα παρασκευαστική πήγματα αυτόματα συλλέγονται και διακινούνται σε ένα Workstation Χειρισμός Ettan Spot ( GE Healthcare). Τα επιλεγμένα σημεία πρωτεΐνη πλύθηκαν με 15 mM διττανθρακικού αμμωνίου και 50% μεθανόλη και στη συνέχεια υπέστη πέψη εντός /mL διάλυμα θρυψίνης βαθμού αλληλούχιση 0,02 μg (Promega, Madison, WI, USA) στους 37 ° C για 2 ώρες. Τα τρυπτικά πεπτίδια εκχυλίστηκαν με 50% (ν /ν) ακετονιτρίλιο (ACN) και 0,5% (ν /ν) τριφθοροοξικό οξύ (TFA), διαλύθηκε σε 5 mg /mL R-κυανο-4-υδροξυκινναμωμικού οξέως (Amersham Bioscience) σε 50% (ν /ν) ACN και 0.1% (ν /ν) TFA και έπειτα εναποτεθεί στην πλάκα δείγμα MS.

Matrix υποβοηθούμενης λέιζερ εκρόφηση /ιονισμός χρόνος πτήσης Φασματομετρίας μάζας (MALDI-TOF /TOF MS) Ανάλυση

αναγνώριση των πρωτεϊνών έγινε με την ABI 4800 Πρωτεομική MALDI-TOF /TOF Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σε κατάσταση θετικής ανακλαστήρα ιόντων. Μονοισοτοπικές μάζες κορυφή αποκτήθηκαν σε μια σειρά από 900-4,000 Da, με λόγο σήματος προς θόρυβο (S /N) & gt? 200. Θρυψίνη αυτολυτική πεπτίδια των μαζών 842.5 και 2211.1 χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικά πρότυπα. Πέντε από τα σήματα πιο έντονη ιόντων επιλέγεται αυτόματα ως πρόδρομοι για απόκτηση MS /MS, με εξαίρεση τις κορυφές θρυψίνη αυτόλυσης και τα σήματα ιόντων μήτρας. Το αποτύπωμα μάζας πεπτιδίου (PMF), σε συνδυασμό MS /MS φάσματα αναζήτηση στη βάση δεδομένων NCBInr χρησιμοποιώντας το λογισμικό GPS Explorer ™ (Έκδοση 3.6, Applied Biosystems) και MASCOT έκδοση 2.1 (Matrix Science). Οι παράμετροι αναζήτησης ορίστηκαν ως εξής:

Homo sapiens

, διάσπαση θρυψίνη (μία αποτυχημένη επιτρέπεται διάσπαση), carbamidomethylation ως πάγια τροποποίηση, η οξείδωση της μεθειονίνης ως μεταβλητή τροποποίηση, πεπτίδιο ανοχής μάζα ορίζεται σε 75 ppm και το θραύσμα ανοχής ορίζεται σε 0,2 da. Μια πολύ υψηλή βαθμολογία ΜΑΣΚΩΤ που οδήγησε σε μια σίγουρη διάστημα (CI) μεγαλύτερη από 95% για το PMF ή δεδομένων MS /MS για ένα σημείο θεωρήθηκε ως ένα αξιόπιστο προσδιορίζονται πρωτεΐνη. Τα άλλα κριτήρια που περιλαμβάνονται τουλάχιστον τέσσερα πεπτίδια χτυπά στην ταυτοποίηση στοιχείων με βάση PMF και τουλάχιστον δύο πεπτίδια με διακριτές ακολουθίες που προσδιορίζονται στην ανάλυση MS /MS.

ELISA Επικύρωση

δείγματα ασκίτη (5 mL ) φυγοκεντρήθηκαν στις 2000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C για το διαχωρισμό του υγρού από τα κυτταρικά συστατικά. Το εναιώρημα εν συντομία σε υπερήχους, και τα συντρίμμια φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο επαναιωρήθηκε και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C.

κιτ προσδιορισμού ELISA για καθεμία από τις αναλυόμενες ουσίες που επιλέγονται για περαιτέρω ανάλυση αγοράστηκαν από Abcam. Αυτές οι αναλύτες ήταν ως ακολούθως: απολιποπρωτεΐνη Α-IV (Αρο AIV-), σερουλοπλασμίνη, τρανσθυρετίνη και απτοσφαιρίνη. Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ. Εν συντομία, η αλλαγή χρώματος οφείλεται στην αντίδραση ενζύμου-υποστρώματος του κάθε φρεάτιο στην πλάκα μικροτιτλοδότησης μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά σε μήκος κύματος 450 nm. Η συγκέντρωση του κάθε δοκιμάστηκε πρωτεΐνης στο δείγμα προσδιορίστηκε στη συνέχεια με σύγκριση της οπτικής πυκνότητας (OD) με εκείνη της πρότυπης καμπύλης.

έλεγχος τ διεξήχθη για να συγκρίνει τις διαφορές μεταξύ των τιμών πρωτεΐνη ορού. Το πακέτο λογισμικού SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή των στατιστικών αναλύσεων, και ένα δύο-ουρά

P

τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

αποτελέσματα

Κλινική Πληροφορίες ασθενούς

Δεκαεννέα δείγματα ασκίτη του ΕΓΚ ασθενείς ορώδες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας 2D-ΨΗΦΟ να ελέγξουν πιθανούς βιοδείκτες που σχετίζονται με διαφορικό απαντήσεις σε χημειοθεραπεία. Δείγματα από μια ξεχωριστή ομάδα από 28 ασθενείς με ορώδες EOC χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση των αποτελεσμάτων 2D-ΨΗΦΟ με ELISA. Όλοι οι ασθενείς είχαν λάβει ικανοποιητικές κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην ηλικία κατά τη διάγνωση, τη διαφοροποίηση του όγκου και της Διεθνούς Ομοσπονδίας Γυναικολογίας και Μαιευτικής (FIGO) στάσης μεταξύ των ασθενών στις νόσο ευαίσθητη και χημειοθεραπεία ομάδες. Τα δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά των περιπτώσεων παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

Επιπλέον, τα ποσοστά επιβίωσης από τους 28 ασθενείς εξετάστηκαν με ELISA συγκρίθηκαν σύμφωνα με τις διαφορετικές απαντήσεις τους στη χημειοθεραπεία. Μέχρι τον Μάρτιο του 2012, τέσσερις από τους εννέα ασθενείς (44,4%) στην χημειοθεραπεία ομάδα και τρεις από δεκαεννέα ασθενείς (15,8%) είχαν πεθάνει στην ομάδα χημειοευαισθησίας. Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης των ασθενών στη χημειοθεραπεία εννέα καρκίνου των ωοθηκών στη μελέτη μας ήταν 18,9 μήνες. Ωστόσο, χρειαζόταν ένα μεγαλύτερο χρονικό διάστημα παρακολούθησης για να καθοριστεί η ακριβής διάμεση επιβίωση των ασθενών χημειοευαίσθητων, το οποίο ήταν πάνω από 18,9 μήνες. Με βάση την περίοδο παρατήρησης σε αυτή τη μελέτη, η διαφορά στην επιβίωση μεταξύ των δύο ομάδων, όπως παρατηρείται με τη χρήση εκτιμήσεις Kaplan-Meier ήταν σημαντική (

P

= 0,007), ευνοώντας εκείνους με καλύτερη ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία (Εικ. 1) .

Μια σημαντική διαφορά (

P

= 0,007) παρατηρήθηκε στην επιβίωση, το οποίο ευνοούσε τους ασθενείς με νόσο ευαίσθητη όγκους.

Η

2D-ΨΗΦΟ Ανάλυση και MS /MS Αναγνώριση

Σύμφωνα με το σχεδιασμό του πειράματος μας περιγράφεται στα Υλικά και μέθοδοι, τέσσερις τζελ 2D-ΨΗΦΟ συνολικά στήθηκαν για την πρωτεομική ανάλυση των χημειοθεραπεία έναντι χημειοθεραπεία ασκίτη ασθενή. Για κάθε τζελ μια συγχωνευμένη εικόνα δημιουργήθηκε από τρεις εικόνες του χημειοευαίσθητων, χημειοθεραπεία και του εσωτερικού προτύπου δείγματα. Ένας εκπρόσωπος ΨΗΦΟ τζελ που δείχνει την επικάλυψη της Cy2, Cy3 και Cy5 επισημασμένα εικόνες φαίνεται στο Σχήμα 2.

Ένας εκπρόσωπος 2D-ΨΗΦΟ εικόνας (συγχωνευμένη εικόνα) δείχνει το προφίλ πρωτεΐνης του ασκίτη της χημειοευαίσθητων και στη χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών ασθενείς σημανθεί με Cy5 (κόκκινες κηλίδες) και Cy3 (πράσινα σημεία), αντίστοιχα, με ένα εσωτερικό πρότυπο επισημαίνονται με Cy2. IPG λωρίδες (24 cm, ρΗ 4-7) χρησιμοποιήθηκαν για IEF πριν τυπική SDS-PAGE (12,5% πολυακρυλαμίδιο) για τη δεύτερη διάσταση. Το εύρος μοριακού βάρους στην κατακόρυφη διάσταση είναι περίπου από 150 να 10 kD. Οι πρωτεΐνες αναγνωρίζονται ως διαφορικά εκφρασμένων υποδεικνύεται με κίτρινα βέλη με εκχωρηθεί αριθμοί από την ανάλυση DeCyder. Οι αριθμοί στο σχήμα αντιστοιχούν σε εκείνα που παρουσιάζονται στον Πίνακα 2? (Κάτω) MALDI-TOF-MS φάσμα μάζας του spot 1543 ταυτοποιήθηκε ως σερουλοπλασμίνης σύμφωνα με τις συμφωνημένα κορυφές.

Η

Ένα σύνολο 1523 έως 1711 κηλίδες ανιχνεύθηκαν σε διαφορετικές Διαφορική In-γέλη Ανάλυση (DIA) χώρους εργασίας σε όλες τις τζελ χρησιμοποιώντας το λογισμικό DeCyder. Στην ενότητα βιολογική ποικιλία Ανάλυσης (BVA), η εικόνα Cy3 από αριθμό γέλη τέσσερα επιλέχθηκε ως το κύριο γέλη, δεδομένου ότι είχε το μέγιστο αριθμό των κηλίδων. Τριάντα τέσσερα σημεία βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά με βάση τα κριτήρια του έχει ένα μέσο ποσοστό άνω του 1,5 ή μικρότερη από -1,5 και Student t-test

P

αξία & lt? 0.05. Μεταξύ αυτών, 14 κηλίδες βρέθηκαν να ρυθμίζεται προς τα κάτω στις χημειοθεραπεία ασκίτη, και 27 ήταν πάνω ρυθμισμένα σε σύγκριση με τους ασθενείς χημειοευαίσθητων.

Μερικά από τα διαφορικών κηλίδων ανιχνεύονται από το λογισμικό DeCyder δεν θα μπορούσε να γίνει ορατή στην παρασκευαστική γέλη χρωματίσθηκε με κολλοειδές coomassie πιθανόν να οφείλεται σε χαμηλή αφθονία. Μετά την οπτική αξιολόγηση, επιλέχθηκαν 20 πρωτεΐνη σημεία που δείχνουν μεγάλη αφθονία και σημαντικά αλλοιωμένη έκφραση σε χημειοθεραπεία έναντι νόσο ευαίσθητη ασθενείς για ανάλυση MALDI-TOF /TOF MS. Συνολικά 11 διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων 3 επάνω ρυθμισμένη και 8 κάτω-ρυθμιζόμενες πρωτεΐνες, σε ασκίτες από χημειοθεραπεία όγκων σε σύγκριση με χημειοευαίσθητους όγκοι επιτυχώς εντοπίστηκαν. Η καταμέτρηση πεπτίδιο των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών κυμαινόταν από 4 έως 33. Fold μεταβολές των επιπέδων των 11 ταυτοποιημένες πρωτεΐνες στις δύο ομάδες μαζί με τα αναλυτικά αποτελέσματα της αναζήτησης Mascot δίνονται στον Πίνακα 2.

Η

Αρκετές πρωτεΐνες εντοπίστηκαν σε πολλαπλά σημεία. Για παράδειγμα, είδε την κίνηση του 1421, 1593 και 1598 το καθένα ταυτοποιήθηκε ως η πρωτεΐνη τρανσθυρετίνη, η οποία είναι μια μεταφορά και πρωτεΐνη οξείας φάσης, ή παραλλαγές του. Ομοίως, κηλίδες 1614 και 1626 ταυτοποιήθηκαν ως απτοσφαιρίνης, ενώ κηλίδες 1536 και 1543 προσδιορίστηκαν να είναι σερουλοπλασμίνη και πρωτεολυτικό θραύσμα της. Οι ταυτοποιημένες πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε τέσσερις διαφορετικές πτυχές της λειτουργίας των κυττάρων και έχουν σχέση με την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση (μία κυτταροσκελετική πρωτεΐνη, πρωτεΐνες μεταβολισμός /λιπιδίου τρία ενέργεια, τρεις πρωτεΐνες φορείς και τέσσερις πρωτεΐνες οξείας φάσης).

ELISA επικύρωση της Αρο-Αΐν, σερουλοπλασμίνη, τρανσθυρετίνης και απτοσφαιρίνης

Για την επικύρωση των αποτελεσμάτων της πρωτεομική ανάλυση, προσδιορίσαμε τα επίπεδα των τεσσάρων πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων Αρο-Αΐν, σερουλοπλασμίνη, τρανσθυρετίνης και απτοσφαιρίνης σε δείγματα ασκίτη από 19 χημειοευαίσθητων και 9 εγγενώς χημειοθεραπεία ΕΓΚ ασθενείς με ELISA. Με βάση την προηγούμενη πρωτεομική προφίλ και λαμβάνοντας υπόψη το σκοπό μας της διαλογής μοναδικό βιοδεικτών στα ασκίτη, κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες (ACTB) εξαιρέθηκε από την ανάλυση αυτή.

Τα αποτελέσματα της ELISA επιβεβαίωσαν τα ευρήματα MALDI-TOF /TOF MS μας σε αυτό το επίπεδο σερουλοπλασμίνης ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σχέση με χημειοθεραπεία νόσο ευαίσθητη ασκίτη. Η μέση συγκέντρωση της σερουλοπλασμίνης ήταν 157,5 μg /ml στο νόσο ευαίσθητη ομάδα και 192,2 μg /ml στο χημειοθεραπεία ομάδα (

P

= 0,001), ενώ τα επίπεδα της Αρο-AIV, τρανσθυρετίνη και απτοσφαιρίνη δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές μεταξύ των δύο ομάδων. Αυτά τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 3.

Η

Συζήτηση

Η πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών είναι γνωστό ότι σχετίζονται έντονα με το μήκος του διαστήματος πλατίνα ελεύθερο από την πρωτογενή πρώτης γραμμής με βάση την πλατίνα θεραπεία συνδυασμού χημειοθεραπείας για υποτροπή. Όσο περισσότερο αυτό το διάστημα διαρκεί, τόσο το καλύτερο το ποσοστό ανταπόκρισης στις επόμενες χημειοθεραπεία [8]. Έτσι, η καθιερωμένη χημειοθεραπεία έχει σε μεγάλο βαθμό μη ευεργετικά για τους ασθενείς εγγενώς στη χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών (με επίμονη ή υποτροπιάζουσα νόσο μέσα σε 6 μήνες). Η ικανότητα να προβλέψει την απόκριση σε κλασική χημειοθεραπεία σε αυτούς τους ασθενείς θα είναι εξαιρετικά πολύτιμη επιτρέποντας την έγκαιρη χρήση των εξατομικευμένων θεραπευτικών να βοηθήσει να παρατείνει την επιβίωση και την αποφυγή περιττών παρενέργειες των αναποτελεσματικές θεραπείες.

Έχουμε παρατηρήσει ότι πολλά προχωρημένο στάδιο ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών παρουσιάζουν ταχεία ανάπτυξη των όγκων ενδοπεριτοναϊκή μαζί με κοιλιακή διάταση, ως αποτέλεσμα της συσσώρευσης του ασκιτικού υγρού στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Μηχανιστικά, σχηματισμός ασκίτη εμφανίζεται ως κακοήθη κύτταρα εκκρίνουν πρωτεΐνες, αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες που προκαλούν νεοαγγειοποίηση, αγγειογένεση, αυξημένη διήθηση ρευστό και /ή λεμφικού απόφραξη, με αποτέλεσμα την συσσώρευση υγρού ορό σαν εσωτερικό της κοιλιάς [9], [10]. Το πλούσιο μέσο παρέχει υποστήριξη για τα κακοήθη κύτταρα να πολλαπλασιάζονται και περαιτέρω μεταστάσεις παρά την έλλειψη υποστρωμάτων μήτρας, επιτρέποντας αυτά τα κύτταρα για να ξεπεραστεί η απόπτωση συνδέεται με την απώλεια της σύνδεσης. Αυτό σημαίνει ότι τα κακοήθη κύτταρα και μεσοθηλιακών κυττάρων σε ασκίτες πλειορύθμιση σήματα επιβίωσης, ώστε να εξακολουθούν να υπάρχουν στην υποξική αλλά κατά τα άλλα πλούσια υγρό περιβάλλον [11]. Έτσι, ασκίτης είναι μια εξαιρετική δεξαμενή για την αναγνώριση χρήσιμων βιοδεικτών του καρκίνου, ειδικά σε ασθενείς EOC [12].

Σε μια μελέτη από την ομάδα Kislinger, η ασκίτης χωρίστηκαν σε κυτταρικά και υγρού κλάσματα, ακολουθούμενη από ανάλυση φασματομετρίας μάζας εκάστου κλάσματος [13]. Ενώ εντοπίστηκαν πάνω από 2.500 πρωτεΐνες μέσα ασκίτη, μόνο 229 πρωτεΐνες που βρέθηκαν στο υγρό κλάσμα. Μετά ολοκληρωμένη υπολογιστική ανάλυση του ασκίτη proteome σε συνδυασμό με πρωτεομικά δεδομένα από ανθρώπινο πλάσμα και σύνολα δεδομένων μικροσυστοιχιών ούρα και πρωτεϊνών Αλληλεπίδραση Database Ι2Δ, επιλέχθηκαν 80 υποψήφιες ορολογική βιοδείκτες του καρκίνου των ωοθηκών για περαιτέρω επικύρωση. Kuk και οι συνεργάτες διεξάγεται επίσης πρωτεομική ανάλυση του ασκιτικού υγρού βασίζεται σε πολλαπλά τεχνικές διαχωρισμού και κλασματοποίησης [14]. Ένα σύνολο 52 πρωτεϊνών επιλέχθηκαν από 445 μοναδικές πρωτεΐνες στον ασκίτη ρευστού όπως καλοί υποψήφιοι για ωοθηκών βιοδείκτες του καρκίνου σε μελλοντικές έρευνες. Οι συγγραφείς αυτοί όλοι βρέθηκαν πρωτεομική ανάλυση να είναι μια σημαντική πηγή για την έρευνα του καρκίνου των ωοθηκών και ένα πλαίσιο για την ανακάλυψη βιοδεικτών.

Για τις γνώσεις μας, πρωτεομική μελέτες ασκίτη καρκίνου των ωοθηκών είναι περιορισμένες, και μια συγκριτική μελέτη μεταξύ εγγενή στη χημειοθεραπεία και χημειοευαίσθητων καρκίνο ωοθηκών ασκίτη με τεχνολογία ΨΗΦΟ δεν έχει προηγουμένως αναφερθεί. Τα ευρήματα της μελέτης μας μπορεί να βοηθήσει στην πρόβλεψη της θεραπευτικής απαντήσεων και πρόγνωση ασθένειας, για ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Πρώτος στόχος μας ήταν να βρούμε μοναδικά βιοδείκτες ακριβώς στο ρευστό ασκίτη και όχι στο κλάσμα των κυττάρων, όπως στη μελέτη Kislinger [13]. Έτσι, διαχωρίζεται το κλάσμα υγρού από κυτταρικά συστατικά για 2D-ΨΗΦΟ με φυγοκέντρηση. Όπως βιοδεικτών μπορεί να είναι παρόν σε χαμηλές συγκεντρώσεις στα σωματικά υγρά όπως ο ορός και ο ασκίτης, μία μεγάλη πρόκληση για την εκτέλεση σε βάθος ανάλυση των των πρωτεϊνών με φασματομετρία μάζας είναι η παρουσία της εξαιρετικά άφθονες πρωτεΐνες όπως η λευκωματίνη και οι ανοσοσφαιρίνες, οι οποίες αποτελούν 65-97% των πρωτεϊνών του ορού [15]. Αυτές οι άφθονες πρωτεΐνες να περιορίσει την αποτελεσματικότητα ιοντισμού κατά την ανάλυση MS, αποτρέποντας την ταυτοποίηση των χαμηλών πρωτεϊνών αφθονία. Ως εκ τούτου, καταστρέφουν τα εξαιρετικά άφθονες πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας ένα 2D-καθαρίσει σετ ήταν απαραίτητη πριν από την ανάλυση μας, προκειμένου να εντοπίσει ταπεινούς άφθονη βιοδείκτες.

Στη μελέτη μας, εντοπίστηκαν συνολικά 11 διαφορετικά πρωτεϊνών μεταξύ χημειοευαίσθητων και χημειοθεραπεία ωοθηκών ασκίτη καρκίνο. Δεν ήταν απροσδόκητο ότι ορισμένες πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν σε πολλαπλά σημεία, αφού πολλές πρωτεΐνες σε ασκίτη που είναι γνωστό ότι υπάρχουν σαν ισομορφές. Για παράδειγμα, απτοσφαιρίνης και τρανσθυρετίνης εκπροσωπήθηκαν από δύο και τρία σημεία, αντίστοιχα, και στις δύο περιπτώσεις, τα επί μέρους σημεία παρομοίως ρυθμισμένα προς τα κάτω. Επιπλέον, η ίδια πρωτεΐνη που είναι παρούσα σε πολλές διαφορετικές θέσεις θα μπορούσε να αντιπροσωπεύεται βιολογικώς σχετικό τροποποιήσεις ή πρωτεολυτικά θραύσματα (π.χ., σερουλοπλασμίνη).

Η μεταβολή στη συγκέντρωση του σερουλοπλασμίνη ορού, μαζί με πολλές άλλες πρωτεΐνες οξείας φάσης που προσδιορίζονται μεταξύ των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών, εμπλέκεται η παρουσία των ανοσολογικών και φλεγμονωδών αποκρίσεων που προκαλούνται από τον όγκο. Τα αποτελέσματα δεν ήταν απρόσμενη δεδομένου ότι οι διαφορετικές φλεγμονώδεις μεσολαβητές, οι οποίες παίζουν διαφορετικούς ρόλους όπως επάγουν αγγειογένεση, εισβολή, αυτοκρινείς βρόχους ανάπτυξη και την αντοχή σε απόπτωση, αυξημένα σε καρκίνωμα των ωοθηκών [16]. Πολλές πρωτεΐνες οξείας φάσης, όπως απτοσφαιρίνης και τρανσθυρετίνης έχουν επίσης πρόσφατα χαρακτηριστεί ως ωοθηκών βιοδείκτες του καρκίνου για την έγκαιρη ανίχνευση [17]. Επιπλέον, σε ένα προηγούμενο γονίδιο προφίλ μελέτη, Μπατσβάροφ και οι συνεργάτες του βρήκαν ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω γονιδίων σε νόσο ευαίσθητη ορώδες όγκους EOC περιλαμβάνονται πολλά γονίδια που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των λιπιδίων και των μεταφορών, της φλεγμονής, καθώς και γονίδια που είναι γνωστό για την ενίσχυση της εξέλιξης του όγκου και εισβολή [18]. Αυτά τα ευρήματα ενοχοποιηθεί πρωτεϊνών οξείας φάσης ως υποψήφιος βιοδείκτες ενδιαφέροντος για περαιτέρω έρευνα.

Η σερουλοπλασμίνη, μια γλυκοπρωτεΐνη του πλάσματος που μεταφέρει χαλκό σε όλο το σώμα, ήταν η μόνη πρωτεΐνη επιβεβαιώθηκε με ELISA στην παρούσα μελέτη για να εκφράζονται διαφορικά σε ο ασκίτη μεταξύ των χημειοθεραπεία και χημειοευαίσθητων ασθενείς σε αυτή τη μελέτη. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα υψηλά επίπεδα σερουλοπλασμίνης ορού έχει αποδειχθεί σε διάφορους καρκίνους όπως του θυρεοειδούς, του προστάτη και του παχέος εντέρου [19], και η ανάλυση μικροσυστοιχιών έχει συνδέσει αυτό το γονίδιο στην εισβολή και μετάσταση όγκου στον καρκίνο του μαστού [20]. μετέβαλαν επίπεδα σερουλοπλασμίνης ορού μετά τη θεραπεία (χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία) έχουν παρατηρηθεί σε πολλούς ασθενείς με κακοήθειες, όπως λαρυγγική, του τραχήλου της μήτρας και του μαστού. Προφανώς, μια πιο σημαντική μείωση του επιπέδου σερουλοπλασμίνης στον ορό μετά από θεραπεία συνδέεται με καλύτερη απόκριση στη θεραπεία, καθώς αυτές οι αλλαγές μπορούν να επηρεάσουν την πορεία της νόσου [21], [22]. Αυτές οι προηγούμενες παρατηρήσεις υποστηρίζουν το εύρημα μας ότι η συγκέντρωση της σερουλοπλασμίνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα υγρά ασκίτη των ασθενών με νόσο ευαίσθητη ωοθηκών καρκίνο.

έχουν ρόλους για σερουλοπλασμίνης προταθεί σε διεργασίες σχετίζονται με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων της αγγειογένεσης και νεοαγγείωση. Η πρωτεΐνη χρησιμεύει επίσης ως υποκατάστατος δείκτης για το σύνολο του χαλκού του σώματος. Ως εκ τούτου, το χαμηλότερο επίπεδο σερουλοπλασμίνης ορού στη μελέτη μας μπορεί να είναι δευτερεύουσα ως προς το ανεπάρκειας συνολικά χαλκού σώμα που σχετίζονται με την καταστολή του όγκου. Σε μία μελέτη από Cox et al., Τετραθειομολυβδαινική (TM), ένα χηλικοποιητή χαλκός χρησιμοποιήθηκε για να μειώσει σώμα αποθηκεύει του χαλκού σε ένα μοντέλο ποντικού της κεφαλής και του λαιμού καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC) καθορίστηκε σύμφωνα με τη εξαιρετικά επιθετική SCC VII /κυτταρική γραμμή SF [23]. Οι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι το συνολικό χαλκού σώμα μειώθηκε κατά TM, το επίπεδο σερουλοπλασμίνη ορού αναλογικά μειωμένη, με το βασικό επίπεδο μειώνεται από by28%. Όπως κατέστειλε σημαντικά τα επίπεδα τόσο της αύξησης του SCC και την αγγείωση των όγκων ταυτοποιήθηκαν, τα αποτελέσματά τους πρότεινε μια δυνητική αποτελεσματικότητα του ΤΜ στη θεραπεία των καρκίνων μέσω επιπτώσεις του στην αγγειογένεση και νεοαγγείωση. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε μία μελέτη φάσης ΙΙ με ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του νεφρού στην οποία τα αποτελέσματα αντι-όγκου των TM (μειωμένη αγγείωση και η μάζα του όγκου) συσχετίστηκαν με χαμηλότερες χαλκού στον ορό και των επιπέδων σερουλοπλασμίνης [24].

Έτσι, , η αλλαγή στην συγκέντρωση σερουλοπλασμίνης ορού μπορεί να υποδεικνύει ότι είναι μία πρωτεΐνη οξείας φάσης που εκκρίνεται σε απάντηση στο οξειδωτικό στρες σε φλεγμονή που σχετίζεται με τον όγκο ή /και ότι είναι δευτερεύουσα στην έλλειψη του ολικού χαλκού του σώματος. Η ανάλυσή μας βασίστηκε σε πρωτογενή ορώδες όγκους ΕΓΚ χωρίς μικτή histotypes των όγκων των ωοθηκών, ή υποτροπιάζοντα και μεταστατικούς όγκους. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη φορά πρωτεομική ανάλυση με 2D-ΨΗΦΟ ανάλυση του ασκίτη από ασθενείς με εγγενή στη χημειοθεραπεία και χημειοευαίσθητων καρκίνου των ωοθηκών. Επιπροσθέτως, τα αποτελέσματα μπορούν να βοηθήσουν στην πρόβλεψη θεραπευτικές αποκρίσεις και να παρέχει πρόγνωση της νόσου, καθώς και νέα στοιχεία στο μηχανισμό του χημειοαντίσταση για τον καρκίνο των ωοθηκών. Ωστόσο, υπάρχουν πιθανές προκαταλήψεις στη μελέτη μας. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η έκφραση της σερουλοπλασμίνης μπορεί να σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου. Ως εκ τούτου, το υψηλό επίπεδο σερουλοπλασμίνης σε ασκίτη στη μελέτη μας μπορεί να προκληθεί από σχετικά προχωρημένο μετάσταση όγκου που σχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση. Επιπροσθέτως, προκαταλήψεις μπορεί να προκληθεί από συστατικά ορού στα ασκιτικό υγρό ή ακόμη και από τον αποκλεισμό μας από τα δείγματα ασκίτη αναμείχθηκε με αίμα λόγω αιμορραγίας όγκου.

Στη μελέτη μας, ο αριθμός των ασθενών ήταν περιορισμένη από το μήκος της χρόνος που απαιτείται για τη συλλογή δειγμάτων.