έχουν

Abstract

υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα τυροσίνης κινάσης αναστολείς gefitinib και erlotinib έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου. Δυστυχώς, η αποτελεσματικότητα του EGFR-ΤΚΙδ είναι περιορισμένη, λόγω της φυσικής και επίκτητης αντίστασης. Ως νέο κυτταροπροστατευτική μηχανισμός για καρκινικού κυττάρου να επιβιώσει υπό δυσμενείς συνθήκες, autophagy έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην αντοχή σε φάρμακα των καρκινικών κυττάρων. Είτε autophagy μπορεί να ενεργοποιηθεί με gefitinib ή erlotinib και ως εκ τούτου μειώνουν την ευαισθησία της στοχευμένης θεραπείας για τον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα παραμένει άγνωστος. Εδώ, έχουμε την πρώτη αναφορά ότι το gefitinib ή ερλοτινίμπη μπορεί να προκαλέσει ένα υψηλό επίπεδο αυτοφαγία, η οποία συνοδεύτηκε από την αναστολή του μονοπατιού PI3K /Akt /mTOR σηματοδότησης. Επιπλέον, η κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από gefitinib ή erlotinib ενισχύθηκε σημαντικά μετά την αναστολή αυτοφαγία από την χλωροκίνη αναστολέα φαρμακολογική (CQ) και siRNAs που στοχεύουν ATG5 και ATG7, τα πιο σημαντικά συστατικά για το σχηματισμό της autophagosome. Είναι ενδιαφέρον, EGFR-TKIs μπορεί ακόμα να προκαλέσει κυττάρων αυτοφαγία, ακόμη και μετά την έκφραση του EGFR μειώθηκε κατά EGFR συγκεκριμένες siRNAs. Συμπερασματικά, βρήκαμε ότι autophagy μπορούν να ενεργοποιηθούν με EGFR-ΤΚΙδ σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και η αναστολή της autophagy επαυξημένης το ανασταλτικό αποτέλεσμα αύξησης του EGFR-TKIs. αναστολή Autophagy αντιπροσωπεύει έτσι μια υποσχόμενη προσέγγιση για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας του EGFR-TKIs στη θεραπεία των ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου

Παράθεση:. Han W, Pan Η, Chen Υ, Sun J, Wang Υ, Li J, et al. (2011) Αναστολείς EGFR κινάσης τυροσίνης Ενεργοποίηση Autophagy ως κυτταροπροστατευτική απόκρισης σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (6): e18691. doi: 10.1371 /journal.pone.0018691

Επιμέλεια: Λιν Ζανγκ, University of Pennsylvania, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Νοέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 15, Μαρτίου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 2 Ιούνη του 2011

Copyright: © 2011 Han et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθμός επιχορήγηση 30.901.740, www.nsfc.gov.cn), η Κίνα Υπουργείο Εθνικής Παιδείας Grant (αριθμός επιχορήγηση 20090101120124, www.moe.edu.cn), Zhejiang Φυσικών Επιστημών Ίδρυμα Grant ( χορηγεί αριθμό Y2090166, www.zjnsf.net:81), και Ερευνητικά Προγράμματα του Τμήματος Zhejiang Εκπαίδευσης (αριθμός επιχορήγηση Y200805751, www.zjedu.gov.cn) για να W. Χαν, και των θεμελιωδών Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια σε H. Jin. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Η χημειοθεραπεία δεν είναι ακόμη αρκετά αποτελεσματική για ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του μη-μικρού κυττάρου πνεύμονα (NSCLC) και το ποσοστό ανταπόκρισης είναι μόνο 20% έως 35% με διάμεση επιβίωση των 10 και 12 μηνών [2], [3]. Με τη στόχευση μορίων κρίσιμη για την ανάπτυξη του καρκίνου, στοχευμένη θεραπεία μόνη της ή σε συνδυασμό με άλλες θεραπείες αναγνωρίστηκε πρόσφατα ως μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την κατάκτηση καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων NSCLC [4].

Ως ένας από κινάσες τυροσίνης (RTK) σημαντικό να ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και μετάσταση, του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) ήταν συχνά απορυθμισμένη σε NSCLCs [5]. EGFR υπερ-έκφραση παρατηρήθηκε σε περίπου 62% των πλακωδών κυττάρων και αδενοκαρκίνωμα υποτύπους [6]. ΕΤΠ μπορεί να προκαλέσει την ενεργοποίηση των τριών οδών σηματοδότησης σημαντικό για την έναρξη και την εξέλιξη των καρκίνων, Ras /MAPK, PI3K /Akt, και JAK /stats [7]. Ως αποτέλεσμα, EGFR έγινε ένα από τα μόρια για την ανάπτυξη των στοχευμένων θεραπειών για NSCLC. Με την αναστολή της δραστηριότητας κινάσης τυροσίνης του EGFR, δύο αναστολείς κινάσης τυροσίνης (ΤΚΙδ) ονομάζεται gefitinib (Iressa, η AstraZeneca) και erlotinib (Tarceva, Genentech) έχουν αναπτυχθεί για τη θεραπεία του NSCLC. Το gefitinib και erlotinib μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη του όγκου τόσο in vitro όσο και in vivo. Κλινικά, οι δύο EGFR-TKIs έδειξε καλή ανεκτικότητα και αντικαρκινική δράση σε ασθενείς με νόσο του NSCLC εξελίσσεται μετά από την πρώτη γραμμή με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία [5], [8], [9]. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα του EGFR-TKIs μειώνεται σημαντικά από φυσικά και επίκτητη αντίσταση. Ο μηχανισμός είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστη παρόλο που EGFR μεταλλάξεις έχουν προταθεί ότι είναι ένας από τους μηχανισμούς για να επηρεάσει την ευαισθησία του EGFR σε αυτούς τους αναστολείς [10], [11].

μακροαυτοφαγία (εφεξής αυτοφαγία) είναι ένα διαδικασία αυτο-πρωτεόλυση σε ευκαρυωτικά κύτταρα που οδηγεί στη διάσπαση του ενδοκυτταρικού υλικού εντός macroautophagosome ή λυσοσώματα [12], [13]. Κάτω από συνθήκες στρες κυτταρικό όπως ελλιπή σε θρεπτικά συστατικά περιβάλλον, autophagy ταχέως ενεργοποιείται για να παράσχει μια εναλλακτική πηγή ενέργειας και συνεπώς επιτρέπει στα κύτταρα να επιβιώνουν [14]. Autophagy ρυθμίζεται αυξητικά κατά τη διάρκεια της μετέπειτα στάδιο της ανάπτυξης του όγκου, λόγω επαγωγής autophagy επιτρέπει στα κύτταρα του όγκου να επιβιώσουν σε μικροπεριβάλλοντα έλλειψη θρεπτικών συστατικών και οξυγόνου [15]. Μέσω της προώθησης της επιβίωσης των καρκινικών κυττάρων κάτω από αντίξοες συνθήκες, αυτοφαγία προτάθηκε ως εναλλακτική λύση μηχανισμό της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Για παράδειγμα, αυτοφαγία συμβάλλει στην αντίσταση των καρκινικών κυττάρων του μαστού με τη θεραπεία bortezomib [16]. Αναστολή της autophagy μπορούσε να ευαισθητοποιήσει κύτταρα όγκου σε πολλές κυτταροτοξικά φάρμακα ή την αναστροφή της αντίστασης σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα, που αντιπροσωπεύουν μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας του καρκίνου [17].

σηματοδότησης οδών κατάντη του EGFR και άλλων RTKs όπως PI3K /Akt μονοπατιού εμπλέκονται στη ρύθμιση της αυτοφαγία, υποδεικνύοντας μια πιθανή σύνδεση μεταξύ της αναστολής RTK και αυτοφαγία. Μια άλλη ΤΚΙ όπως ονομάζεται imatinib πράγματι μπορεί να ενεργοποιήσει αυτοφαγία στους αντίστοιχους τύπους κυττάρων [18], [19]. Επιπλέον, ο αποκλεισμός του σχηματισμού macroautophagosome ενισχύει την αποτελεσματικότητα των αντι-ΗΕΚ2 trastuzumab μονοκλωνικό αντίσωμα (Tzb) [20]. Ωστόσο, αν η αυτοφαγία συνδέεται με gefitinib και θεραπεία erlotinib σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα παραμένει άγνωστη. Στην παρούσα μελέτη, πρέπει πρώτα να αποδείξει ότι το gefitinib ή ερλοτινίμπη ενεργοποιηθεί αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και απόφραξη της αυτοφαγία ενίσχυσε την επίδραση της gefitinib ή erlotinib.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Τα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν gefitinib (J & amp? Κ χημικών Ltd., G304000), erlotinib (J & amp? Κ χημικών Ltd., E625000) και χλωροκίνη (CQ) (J & amp? Κ χημικών Ltd., 147236). Τα πρώτα αντισώματα ήταν αντισώματα έναντι των μικροσωληνίσκων που σχετίζεται με ελαφρά αλυσίδα πρωτεΐνης 1 3 (LC3) (Cell Signaling Technology, # 2775), ATG5 (Cell Signaling Technology, # 2630), ATG7 (Cell Signaling Technology, # 2631), φωσφο-mTOR ( S2448) (Cell Signaling Technology, # 2971), η συνολική mTOR (Cell Signaling Technology, # 2983), φωσφο-p70S6K (T389) (Cell Signaling Technology, # 9234), φωσφο-ΑΚΤ (S473) (Cell Signaling Technology, # 4051 ), η συνολική ΑΚΤ (Cell Signaling Technology, # 9272), GAPDH (Cell Signaling Technology, # 3683). Τα δευτερεύοντα αντισώματα ήταν συζευγμένο με HRP αντι-κουνελιού (Santa Cruz Biotechnology, sc-2357) και αντι-IgG ποντικού (Santa Cruz Biotechnology, sc-2371).

κυτταροκαλλιέργειες

Ο καρκίνος του πνεύμονα κυτταρικές σειρές (Α549, ΝΟΙ-Η1299, ΝΟΙ-Η292, ΝΟΙ-H1650 και SK-MES-1) αγοράστηκαν από την κυτταρική τράπεζα (κινεζική Ακαδημία Επιστημών). Μονόφυλλο καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων διατηρήθηκε σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS και αντιβιοτικά. Στοκ διάλυμα του gefitinib ή erlotinib παρασκευάστηκε σε διμεθυλο-σουλφοξείδιο (DMSO) (Sigma, D4540), και αραιώνεται με μέσο πριν τη χρήση. Η τελική συγκέντρωση του DMSO ήταν & lt?. 0.1%

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Η κυτταροτοξικότητα των χημικών ουσιών έναντι κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα για προσκολλημένα κύτταρα) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με χημικές ουσίες με διαφορετικές συγκεντρώσεις. Μετά από 48-ώρες επώασης, 20 μΙ ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για 4-ώρες επώασης. Μετά από αυτό, το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και 150 μΐ DMSO προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο προκειμένου να διαλυτοποιηθούν τα μπλε-μωβ κρυστάλλους φορμαζάνης. Η απορρόφηση μετρήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ELX800 Micro Plate Reader (Bio-Tek Instruments, Inc.) στα 570 nm.

ανοσοφθορισμού συνεστιακή μικροσκοπία laser για LC3 και λυσόσωμα συνεγκατάστασης

λυσοσώματα ήταν Πρώτον επισημαίνονται με επώαση με Λύσο Tracker (Invitrogen, L7528), ένα λυσόσωμα χρωστική αναφοράς, για 90 λεπτά στους 37 ° C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με 1% ρυθμιστικό διάλυμα CHAPS (150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 1,0% CHAPS) σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, επωάστηκαν με αντι-LC3 για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και πλύθηκαν με PBS, επωάστηκαν για άλλα 45 λεπτά με FITC-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (Beyotime, A0562). Στη συνέχεια, οι πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (Sigma, D9564). Τα δείγματα εξετάστηκαν κάτω από ένα Zeiss LSM 710 συνεστιακό σύστημα μικροσκοπίου (Carl Zeiss, Germany). Εικόνα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το λογισμικό ZEN LE.

Ηλεκτρονική μικροσκοπία

Τα επεξεργασμένα κύτταρα πλύθηκαν και σταθεροποιήθηκαν για 30 λεπτά σε 2.5% γλουταραλδεΰδη. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1,5% τετροξείδιο του οσμίου, αφυδατώθηκαν με ακετόνη και ενσωματωμένα σε ρητίνη τύπου Durcupan. Λεπτές τομές poststained με κιτρικό μόλυβδο και εξετάστηκαν στο Tecnai 10 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Philips, Ολλανδία) σε 60 kV.

Western ανάλυση κηλίδος

κηλίδωση Western διεξήχθη όπως έχει ήδη αναφερθεί [21] . Η πρωτεΐνη εφαρμόστηκε σε μια κατάλληλη συγκέντρωση του SDS-πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF, και στη συνέχεια ανιχνεύονται με την κατάλληλη πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα πριν οπτικοποίηση με ένα κιτ χημειοφωταύγειας. Οπτικοποίηση έγινε με το Image Quant LAS-4000 (Fujifilm, Τόκιο, Ιαπωνία) με τη χρήση της εικόνας Multi-Gauge Λογισμικού (Fujifilm, Tokyo, Japan).

RNA παρεμβολής

Τα κύτταρα επιμολυσμένα είτε με μη ειδικά siRNA (Qiagen, 1027280), ATG5 siRNA (Qiagen, SI02655310), ATG7 siRNA (Qiagen, SI02655373) ή EGFR siRNA (Cell Signaling Technology, # 6481) (τελική συγκέντρωση siRNA, 100 nmol /L) μέσω LipofectAMINE RNAi max (Invitrogen, 13778150) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 48 ώρες πριν από την κηλίδα Western ή προσδιορισμό ΜΤΤ.

Real-time PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας την μέθοδο ΤπζοΙ και cDNA συντέθηκε από mRNA με τη PrimeScipt MMLV RT Κιτ αντιδραστηρίων (Takara, # 6110). Σε πραγματικό χρόνο αντίδρασης ποσοτική PCR διεξήχθη με τη χρήση πράσινου SYBR ως το φθορίζον ανταποκριτή (Bio-Rad, 170 – 8882). πειράματα QPCR έγιναν σε ένα ΑΒΙ-7500 και GAPDH επιδόθηκε ως ενδογενή έλεγχο. Κάθε δείγμα ομαλοποιήθηκε με βάση το περιεχόμενο GAPDH του. Ένα σύνολο 40 κύκλων (5-s μετουσίωση στους 95 ° C, 34-s annealingt /επέκτασης στους 55 ° C) έτρεξαν για κάθε εκκινητή. Primer αλληλουχίες ήταν ως εξής: για ATG5, TTC ΑΑΤ CAG GTT TGG TGG AGG C (με νόημα) και ATG GCA GTG GAG GAA AGC AGA G (αντιπληροφοριακό)? για ATG7, ATG ΚΔ GGG CAT CCA GTG AAC TTC (με νόημα) και CAT CAT TGC AGA AGT AGC AGC CA (αντιπληροφοριακό)? για GAPDH, GGA GTC AAC GGA ΤΤΤ GGT (με νόημα) και ΟΤΟ ATG GGA ΤΤΤ CCA TTG AT (αντιπληροφοριακό).

Στατιστικές αναλύσεις

Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD , και αναλύθηκαν με δοκιμή t του Student.

Αποτελέσματα

EGFR-TKIs προκαλέσουν αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα

Για να αξιολογηθεί η ενεργοποίηση αυτοφαγία με EGFR-TKIs, τη μετατροπή της LC3-Ι σε LC3-II πριν και μετά τη θεραπεία TKIs προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western ανάλυση. Σε Α549 και κύτταρα ΝΟΙ-Η1299, τόσο gefitinib και erlotinib μπορούν να επάγουν τον διακόπτη του LC3-Ι σε LC3-ΙΙ της δόσης και των εξαρτώμενων από το χρόνο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι autophagy μπορούσε να ενεργοποιηθεί τόσο από TKIs (Σχήμα 1Α και Β). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η διαμερισματοποίηση των LC3 στα κύτταρα πριν και μετά τη θεραπεία TKIs παρακολουθήθηκε με έμμεση χρώση ανοσοφθορισμού. Πράγματι, TKIs επήγαγε την συνεντόπισης του LC3-ΙΙ με λυσόσωμα, αποδεικνύοντας το σχηματισμό autolysosome (Εικόνα 1C και Εικόνα S1). Η υπερδομική ανάλυση με ηλεκτρονική μικροσκοπία επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι πολυάριθμα μεγάλα κενοτόπια αυτοφαγικά με χαρακτηριστική μεμβράνη διπλής στοιβάδας που περιέχει οργανίδιο υπολείμματα παρουσιάζονται σε gefitinib-επεξεργασμένα κύτταρα Α549 και όχι μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 2Α, Β και C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με erlotinib (Εικόνα 2D και Ε).

Α και Β, ο καρκίνος του πνεύμονα κύτταρα επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις του gefitinib ή erlotinib για 24 ώρες ή επωάστηκαν με 25 μΜ gefitinib ή erlotinib για κατάλληλα χρονικά διαστήματα. Ο διακόπτης της LC3-Ι-ΙΙ LC3 ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. C, Α549 ή ΝΟΙ-Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή 25 μΜ gefitinib για 24 ώρες. Τα κύτταρα σημάνθηκαν με φθορισμό και απεικονίζεται με ομοεστιακό μικροσκόπιο. Κόκκινο, λυσο tracker-επισημασμένο λυσοσώματα? Πράσινο, FITC-επισημασμένο LC3? Μπλε, ϋΑΡΙ-επισημασμένο πυρήνα. Η επικάλυψη δείχθηκε στη δεξιά στήλη. Τα κύτταρα πορτοκαλί-βάφονται ενδεικνυόμενη LC3 συστεγάζεται με λυσοσώματα

Η

κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 25 μΜ gefitinib για 24 ώρες (Α, DMSO?. Β, Gefitinb, χαμηλής ισχύος? C, Gefitinb, υψηλής δύναμη). D (χαμηλή ανάλυση) και Ε (υψηλή ανάλυση), AGS κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 25 μΜ ερλοτινίμπη για 24 ώρες (D, erlotinib, χαμηλής ισχύος? Ε, erlotinib, υψηλής ισχύος). Πολυάριθμες autophagical κενοτόπια με χαρακτηριστική μεμβράνη διπλής στρώσης που περιέχει οργανίδιο απομεινάρια τονίστηκαν με βέλη. Bar = 1 μm.

Η

Εξετάσαμε επόμενο τις επιδράσεις της EGFR-TKIs επί της έκφρασης ATG5 και ATG7, δύο κρίσιμα συστατικά στη ρύθμιση του σχηματισμού αυτοφαγοσώματα [22]. Τόσο EGFR-TKIs αυξημένη ATG5 και ATG7 στο mRNA ή επίπεδα πρωτεΐνης (Σχήμα 3), επιβεβαιώνοντας την επαγωγή autophagy με EGFR-ΤΚΙδ.

Α, κύτταρα Α549 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μΜ gefitinib για 6 ώρες και ο επίπεδο του mRNA του ATG5 /7 μετρήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR, όπως περιγράφεται στο Μ &? Μ. RQ, η σχετική ποσότητα. μαύρο, gefitinib επεξεργασμένα κύτταρα? γκρι, κύτταρα ελέγχου. Β, Ανοσοκηλίδωση για Atg5 ή ATG7 χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από Α549 σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις του gefitinib ή erlotinib για 24 ώρες. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD, και αναλύθηκαν με δοκιμή t του Student. ** P & lt?. 0.01

Η

Αναστολή της Akt /mTOR /p70S6K οδό σηματοδότησης με EGFR-TKIs

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η PI3K /Akt άξονα /mTOR /p70S6K παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αναστολή της autophagy [23], [24], μπορούμε επομένως να διερευνήσει την επίδραση της gefitinib και erlotinib σε αυτό autophagy-κατασταλτικός μονοπάτι σηματοδότησης. Πράγματι, η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, mTOR και p70S6K τόσο Α549 και κύτταρα Η1299 ήταν σημαντικά μειωμένες με gefitinib και erlotinib σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4Α και Β). Ωστόσο, καμία αλλαγή της έκφρασης ΡΤΕΝ ανιχνεύθηκαν μετά τη θεραπεία TKIs (Σχήμα 4C και D).

Η φωσφορυλίωση της mTOR, Akt και p70S6K σε Α549 (Α) ή κύτταρα NCI-Η1299 (Β) που έλαβαν θεραπεία με gefitinib ή erlotinib προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. Η έκφραση της ΡΤΕΝ σε Α549 (C) ή κύτταρα επεξεργασμένα με διάφορες συγκεντρώσεις του gefitinib ή erlotinib NCI-Η1299 (D) ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western.

Η

Απόφραξη autophagy ενισχύσει EGFR-TKIs επαγόμενη κυτταρικό θάνατο

η

Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι autophagy μπορεί να χρησιμεύσει ως μία προστατευτική απόκριση αποτρέποντας τα καρκινικά κύτταρα από τη θεραπεία που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο [17], [20], [25], [26], [27], [28], [29], [30]. Σε πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου του ΝΟΙ-Η292 και ΝΟΙ-H1650 που είναι σχετικά ευαίσθητα σε gefitinib και erlotinib, δεν autophagy ανιχνεύθηκε μετά gefitinib ή θεραπεία erlotinib (Σχήμα 5Α). Ωστόσο, αυτοφαγία ανιχνεύθηκε σε EGFR-TKIs αγωγή καρκινικά κύτταρα που είναι σχετικά ανθεκτικά στην EGFR-ΤΚΙδ, όπως Α549, ΝΟΙ-Η1299 και SK-MES-1 κύτταρα (Σχήμα 1 και 5Α). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι autophagy μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων να EGFR-TKIs. Για να δοκιμάσει αυτή κατανάλωσης, σε σύγκριση με την επίδραση αναστολής της ανάπτυξης του gefitinib ή erlotinib σε καρκινικά κύτταρα πριν και μετά φαρμακολογικές και γενετικές αναστολή της αυτοφαγία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, CQ η οποία μπορεί να επηρεάσει αρνητικά τη λειτουργία των λυσοσωμάτων και αναστέλλουν autophagy σε προχωρημένο στάδιο αύξησε σημαντικά την αναστολή της ανάπτυξης που επάγεται από gefitinib ή erlotinib σε Α549, ΝΟΙ-Η1299 και SK-MES-1 που είναι σχετικά ανθεκτικά στην EGFR-TKIs. Ωστόσο, δεν θα μπορούσε να αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα με τη δική του. (Σχήμα 5Β). Παρομοίως, αναστολή ανάπτυξης που προκαλείται από gefitinib ή erlotinib σε κύτταρα Α549 ενισχύθηκε μετά autophagy ανεστάλη από την knockdown του ATG5 ή ATG7 (Σχήμα 5C και D), δύο ουσιώδη συστατικά για το σχηματισμό του autophagosome, επιβεβαιώνοντας ότι προστατεύονται autophagy κυττάρων όγκου από EGFR- TKIs που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο.

Ένα, Autophagy προκλήθηκε από EGFR-TKIs σε ανθεκτικά, αλλά δεν είναι ευαίσθητα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. έκφραση LC3 στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα επωάζονται με 25 μΜ gefitinib ή erlotinib για 24 ώρες αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Β, η βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων σε επεξεργασία με 12,5 μΜ gefitinib ή erlotinib για 48 ώρες με ή χωρίς 5 μΜ CQ μετρήθηκαν με δοκιμασία ΜΤΤ. C, η έκφραση του ATG5 και ATG7 σε κύτταρα Α549 παροδικά επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο siRNA, ATG7 ή Atg5 siRNA προσδιορίστηκαν με ανοσοκηλίδωση. Α, κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο siRNA, ATG7 ή Atg5 siRNA υποβλήθηκαν σε αγωγή με 12,5 μΜ gefitinib ή 25 μΜ erlotinib για 48 ώρες. Η επίδραση του EGFR-ΤΚΙδ σε καρκινικά κύτταρα με ή χωρίς ATG5 ή ATG7 knockdown αναλύθηκαν με ανάλυση ΜΤΤ. NC, ελέγχου siRNA. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD, και αναλύθηκαν με δοκιμή t του Student. * P & lt? 0.05, ** P & lt?. 0.01

Η

EGFR-TKIs προκαλέσουν αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα με EGFR-νοκ ντάουν

Στη συνέχεια, θα θέλαμε να γνωρίζουμε το ρόλο του EGFR σε το gefitinib ή erlotinib προκαλείται από αυτοφαγία. Δύο ειδικά siRNAs χρησιμοποιήθηκαν για knockdown έκφραση EGFR. SiRNA 1 θα μπορούσε να μειώσει την έκφραση του EGFR σε μεγάλο βαθμό ενώ siRNA 2, τα οποία είχαν μέτρια επίδραση στην έκφραση EGFR (Εικόνα 6Α και Β). Είναι ενδιαφέρον, autophagy ενεργοποιείται είτε gefitinib ή erlotinib δεν ανεστάλη αλλά επαυξημένη μετά την έκφραση EGFR μειώθηκε δραματικά με siRNA 1 (Σχήμα 6C και D). Σε αντίθεση, siRNA 2 είχαν σχεδόν καμία επίδραση στην autophagy επάγεται τόσο από EGFR-ΤΚΙδ (Σχήμα 6C και D).

έκφραση EGFR σε Α549 (Α) ή κύτταρα Η1299 (Β) επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA, EGFR siRNA1 ή siRNA2 προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. έκφραση LC3 σε EGFR-TKIs αντιμετωπίζονται Α549 (C) ή Η1299 (D) κύτταρα με ή χωρίς EGFR νοκ ντάουν προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western.

Η

Συζήτηση

Autophagy ορίστηκε ως προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος τύπου II, ενώ η απόπτωση είναι γνωστό ως προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος τύπου Ι Ωστόσο, πρόσφατα αυτοφαγία βρέθηκε να προάγουν την κυτταρική επιβίωση κάτω από δυσμενείς συνθήκες, όπως στέρηση των αμινοξέων ή ATPs, αποκαλύπτοντας ένα νέο ρόλο της αυτοφαγία στην ανάπτυξη καρκίνου.

Autophagy είναι μορφολογικά χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση του κενοτοπίων «διπλής μεμβράνης» (αυτοφαγοσώματα) στο κυτταρόπλασμα. Επιπλέον, το ομόλογο θηλαστικού της πρωτεΐνης ζυμομύκητα Apg8p, (ονομάζεται επίσης LC3), βρίσκεται να είναι ένας ειδικός βιοχημικός δείκτης για αυτοφαγία. Νεοσυντιθέμενες LC3 ονομάζεται LC3-1 είναι ομοιόμορφα κατανεμημένη σε όλο το κυτταρόπλασμα. Μετά την επαγωγή της αυτοφαγία, μερικοί LC3-Ι μετατρέπεται σε LC3-ΙΙ, η οποία είναι στενά συνδεδεμένη με τις μεμβράνες που σχηματίζουν autophagosomal σχήματος δακτυλίου δομές στο κυτταρόπλασμα. Επιβεβαιώσαμε βιοχημικά και μορφολογικά ότι autophagy μπορεί να ενεργοποιηθεί με gefitinib ή erlotinib, δύο καλά χρησιμοποιούνται EGFR-ΤΚΙδ, σε δύο ανεξάρτητες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Είναι ενδιαφέρον ότι, ένα πολύ πρόσφατο έγγραφο ανέφερε ότι autophagy μπορεί να επαχθεί από αντισώματα αντι-ΕΟΡΚ [31]. Και οι δύο αντισώματα EGFR και EGFR-TKIs χρησιμοποιούνται ευρέως για τη θεραπεία του ασθενή με καρκίνο με αναστολή του EGFR, αποκαλύπτοντας ένα νέο σύνδεσμο μεταξύ αναστολής EGFR και ενεργοποίηση αυτοφαγία.

Autophagy μπορεί να ενεργοποιηθεί ως το κυτταρική απόκριση σε θεραπεία καρκίνου. Ένας αριθμός των θεραπευτικών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του DNA που βλάπτουν χημειοθεραπευτικά, ενδοκρινείς θεραπείες (π.χ. ταμοξιφένη) και ακτινοθεραπεία έχουν βρεθεί να επάγουν αυτοφαγία in vitro και in vivo [32], [33], [34]. Πρόσφατα, βρέθηκε ότι autophagy μπορεί να ενεργοποιηθεί και να προστατεύονται τα καρκινικά κύτταρα από στοχευμένες θεραπείες, όπως η μεσυλική ιματινίβη σε θετική στο χρωμόσωμα Φιλαδέλφειας κυττάρων [18], trastuzumab στον καρκίνο του μαστού [20], οι αναστολείς της οικογένειας κινάσης Src στον καρκίνο του προστάτη [35 ], αναστολείς πρωτεασώματος σε καρκίνο του προστάτη [16]. Σταθερά, βρήκαμε ότι autophagy μπορεί να ενεργοποιηθεί με gefitinib και erlotinib στον καρκίνο του πνεύμονα και προάγουν την κυτταρική επιβίωση στη θεραπεία στόχου χρησιμοποιώντας EGFR-TKIs. Απόφραξη της αυτοφαγία με φαρμακολογικά ή γενετικές προσεγγίσεις ενισχυθεί σε μεγάλο βαθμό το αποτέλεσμα αναστολής της ανάπτυξης του gefitinib ή erlotinib. Έτσι, η αναστολή της αυτοφαγία έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει την κλινική αποτελεσματικότητα του EGFR-TKIs για τη θεραπεία του καρκίνου.

Ως αισθητήρας αμινοξέων και ΑΤΡ, mTOR ρυθμίζει αρνητικά αυτοφαγία. Πράγματι, διαπιστώσαμε ότι και οι δύο TKIs μπορεί να αναστέλλει την ενεργοποίηση του mTOR, καθώς ανάντη ρυθμιστή της, ΡΙ3Κ /Akt. Ένα άλλο σηματοδοτικό μονοπάτι σημαντικό να αυτοφαγία είναι Raf /MAPK μονοπατιού [23]. Ωστόσο, δεν καταφέραμε να βρούμε μια σαφή συσχέτιση μεταξύ Raf /MAPK μονοπατιού και αυτοφαγία σε κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται. Αυτό οφείλεται πιθανώς σε ογκογόνους μεταλλάξεις κατά κύριο λόγο εμφανίστηκαν σε μονοπάτια /ΜΑΡΚ Ras. Για παράδειγμα, η γονιδιακή k-Ras ήταν γνωστό να μεταλλαχθεί σε κύτταρα Α549. Κλινικά, οι ασθενείς με μεταλλάξεις του K-ras απέτυχε σε ανταπόκριση στη θεραπεία TKIs. Θα ήταν ενδιαφέρον να μάθουμε εάν οι ασθενείς με μεταλλάξεις του K-RAS θα μπορούσαν να επωφεληθούν από το συνδυασμό των TKIs και αναστολείς της αυτοφαγία.

Είναι ενδιαφέρον, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το gefitinib ή έμμεσα erlotinib αυτοφαγία μπορεί να είναι EGFR ανεξάρτητη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6, και οι δύο EGFR-TKIs μπορούσε να επάγει autophagy ακόμη και EGFR έκφραση μειώνεται σημαντικά. Αν και gefitinib και erlotinib αναπτύχθηκαν ως οι ειδικοί αναστολείς απευθύνονται προς το πεδίο κινάσης του EGFR, ωστόσο, πρόσφατα αποτελέσματα κατηγορηθεί ότι αυτές οι δύο αναστολείς μπορούν να έχουν άλλους στόχους, όπως κινάσες τυροσίνης μη υποδοχέα που δρα επίσης ανοδικά ΡΙ3Κ /Akt /mTOR μονοπάτι [36]. Συνέπεια, οι κλινικές δοκιμές μεγάλης κλίμακας επιβεβαίωσε ότι η μέτρηση της έκφρασης του EGFR με ανοσοϊστοχημεία δεν ήταν χρήσιμη για να πάρει τους ασθενείς να επωφεληθεί από gefitinib θεραπεία. Βέβαια, ακόμα δεν μπορούσε να αποκλείσει εντελώς το ενδιαφέρον του EGFR στο gefitinib ή ερλοτινίμπη προκαλείται από αυτοφαγία δεδομένου ότι ορισμένο ποσό των EGFR ήταν ακόμη εντοπιστεί μετά από νοκ ντάουν από EGFR siRNAs. Πράγματι, EGFR-TKIs ενεργοποιημένου autophagy ήταν πολύ πιο ενισχυμένο με siRNA 1 η οποία εμφανίζεται καλύτερη απόδοση knockdown από siRNA 2 (Σχήμα 6Β). Ως εκ τούτου, χρειαζόμαστε περαιτέρω έρευνες για να διευκρινιστεί ο ρόλος του EGFR στο gefitinib ή ερλοτινίμπη που προκαλείται από αυτοφαγία. Παρ ‘όλα αυτά, EGFR-ΤΚΙδ και EGFR siRNA είχε συνεργικό αποτέλεσμα επί της διέγερσης αυτοφαγία, η οποία θα μπορούσε να είναι ειδικώς ανέστειλαν να αυξηθεί η κλινική αποτελεσματικότητα της στοχευμένης θεραπείας.

Εν περιλήψει, η εργασία μας ενίσχυσε την ιδέα ότι καρκινικά κύτταρα μπορούν να επιβιώσουν σε ένα αγχωτικό περιβάλλον, μετά την αναστολή της κρίσιμης ογκογόνων μονοπάτια, επάγοντας αυτοφαγία. Αυτά τα καρκινικά κύτταρα έτοιμες να επαναλάβουν τον πολλαπλασιασμό φορά συγκέντρωση του φαρμάκου πέφτει μετά τη διακοπή του φαρμάκου, λόγω της τοξικότητας ή μεταλλάξεις αναπτυχθεί για να παρέχουν ανθεκτικότητα στα φάρμακα. Έτσι, σε συνδυασμό θεραπευτικών στρατηγικών που στοχεύουν να αναστέλλουν την αυτοφαγία σε ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με συμβατική χημειοθεραπεία ή νέα στοχευμένη θεραπεία με EGFR-TKIs αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα για τους ασθενείς με καρκίνο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1 .

Ποσοτικοποίηση της αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα αντιμετωπίζεται με gefitinib. Το ποσοστό των κυττάρων με πορτοκαλί σήματα υπολογίστηκε με μέτρηση των κυττάρων σε 3-4 πεδία στο μικροσκόπιο. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD

doi:. 10.1371 /journal.pone.0018691.s001

(ΔΕΘ)