Αφηρημένο

καντερίνη-17 (CDH17), ένα μέλος της 7D-cadherin υπεροικογένεια, ήταν υπερεκφράζεται σε γαστρικό καρκίνο (GC) και συνδέθηκε με κακή επιβίωση, την υποτροπή του όγκου, μετάσταση, και προχωρημένο στάδιο του όγκου. Μέχρι στιγμής, η κυτταρική λειτουργία και η σηματοδότηση μηχανισμός CDH17 σε GC παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι πάνω από το 66% των κυτταρικών σειρών GC (20/30) ήταν θετικοί CDH17. Ιστού μικροσυστοιχίες (ΤΜΑ) δοκιμασία έδειξε ότι το 73,6% κινεζική ιστούς GC (159/216) ήταν CDH17 θετικά, ενώ το 37% των αντίστοιχων παρακείμενων φυσιολογικών ιστών ήταν CDH17 θετικά. Knockdown του CDH17 ανέστειλε το σχηματισμό κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, την προσκόλληση και αποικία, και επίσης προκάλεσε μια διακοπή του κυτταρικού κύκλου και απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου GC AGS. Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση του CDH17 διευκόλυνε την ανάπτυξη του όγκου MGC GC-803 σε γυμνά ποντίκια. συστοιχία αντισωμάτων και δοκιμασία Western blotting απέδειξε ότι knockdown του CDH17 σε κύτταρα AGS κάτω ρυθμισμένα ιντεγκρίνης β πρωτεΐνες σειρά, περαιτέρω αδρανοποιείται το /Raf /MEK μονοπάτι Ras /ERK και οδήγησε σε ρ53 και συσσώρευση ρ21, η οποία οδήγησε σε αναστολή του πολλαπλασιασμού, του κυτταρικού κύκλου σύλληψη και την επαγωγή της απόπτωσης. Συλλογικά, τα στοιχεία μας αποδεικνύουν κατ ‘αρχάς την ικανότητα της CDH17 να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα των Ras /Raf /MEK /ERK μονοπάτι για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε GC, και δείχνουν ότι CDH17 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο για μελλοντική έρευνα.

Παράθεση: Lin Ζ, Zhang C, Zhang M, Xu D, Fang Υ, Zhou Z, et al. (2014) Στόχευση καντερίνη-17 αδρανοποιεί Ras /Raf /MEK /ERK Σηματοδοσίας και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε γαστρικό καρκίνο. PLoS ONE 9 (1): e85296. doi: 10.1371 /journal.pone.0085296

Επιμέλεια: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Γαλλία

Ελήφθη: 10, Ιουνίου, 2013? Αποδεκτές: 26 Νοεμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Όλοι οι συγγραφείς είναι υπάλληλοι ή πρώην εργαζομένων της Roche R & amp? D Center (Κίνα), εκτός YanFen Fang, ο οποίος είναι υπάλληλος της Ανατολικής Κίνας Normal University, Shanghai, Κίνα.. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος στομάχου (GC) κατατάσσεται ως η δεύτερη κύρια αιτία της παγκόσμιας θνησιμότητας από καρκίνο και η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο [1], [2]. Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης των ασθενών είναι GC 7~10 μήνες. Οι περισσότεροι ασθενείς με GC παρόν με τελικού σταδίου ασθένεια με συνολική 5-ετή επιβίωση περίπου 20% και τα ποσοστά αντικειμενική ανταπόκριση στη συμβατική χημειοθεραπευτική φάσμα αγωγές μπορεί να βελτιωθεί από 20% έως 40% [1], [3]. Επί του παρόντος, η θεραπεία που βασίζεται σισπλατίνη εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ευρέως σε κλινικές ρυθμίσεις για προηγμένη και μεταστατικών GC. Επιπλέον, για HER2-neu υπερεκφράζουν γαστρική αδενοκαρκινώματα, trastuzumab (Herceptin) σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία παρατείνει Η διάμεση συνολική επιβίωση από 11,1 μήνες (μόνο χημειοθεραπεία) για να 13,8 μήνες [4]. Λαμβάνοντας υπόψη το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας των GC, υπάρχει ακόμα τεράστια ιατρική ανάγκη για να βρει το ευαίσθητο και αξιόπιστο βιολογικό δείκτη για την έγκαιρη διάγνωση του GC και ισχυρό θεραπευτικό στόχο για τη θεραπεία του GC.

CDH17, ένα μέλος της 7D-cadherin υπεροικογένεια, παρουσιάζει σε εμβρυϊκό ήπαρ και γαστρεντερικό σωλήνα κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, έτσι ονομάζεται επίσης ως συκώτι-εντερικής καντερίνη (LI καντερίνη). CDH17 υπερεκφράζεται σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [5], [6], γαστρικού καρκίνου [7], πορογενές καρκίνο του παγκρέατος [8] και του παχέος εντέρου [9] – [11]. Όπως αναφέρθηκε, CDH17 ήταν παρούσα κυρίως στην κυτταρική μεμβράνη και απούσα σε φυσιολογικό γαστρικό ιστούς και ο θετικός ρυθμός ήταν σχεδόν 78,4% [12]. Το επίπεδο έκφρασης του CDH17 ήταν χαρακτηριστικό της προηγμένης γαστρικού καρκινώματος που σχετίζεται με κακή πρόγνωση [13]? και ήταν επίσης σημαντικά που σχετίζονται με την μετάσταση λεμφαδένα σε καρκίνο του στομάχου [14]. Knockdown CDH17 με φακοϊό μεσολάβηση miRNA ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, προσκόλληση, ανάπτυξη όγκου, μετάσταση και BGC823 ανθρώπινου γαστρικού καρκινικά κύτταρα, τόσο in vitro όσο και in vivo [15] – [17]. CDH17 έχει προταθεί ως ένα ογκογονίδιο και ένας χρήσιμος δείκτης για τη διάγνωση των γαστρικών καρκίνων [18]. Έχει αποδεικνύεται ότι CDH17 μεσολάβηση ογκογόνος σηματοδότηση σε HCC σχετίζεται με Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι [5]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ότι CDH17 προκαλούμενη ογκογένεση και τη μετάσταση του λεμφικού σε GC μέσω της ενεργοποίησης του ΝΡκΒ μονοπάτι [19] σηματοδότησης. CDH17 ρυθμιζόμενο α2β1 ιντεγκρίνης σηματοδότηση για την επαγωγή ειδικών κινάσης εστιακής προσκόλλησης και ενεργοποίηση Ras, η οποία οδήγησε στην αύξηση κυτταρική προσκόλληση και πολλαπλασιασμό σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου [11]. Ωστόσο, ο κύριος ρόλος και σηματοδότηση μηχανισμό CDH17 σε GC παραμένει ασαφής. Σε αυτή τη μελέτη, να επικυρώσει CDH17 ως πιθανό θεραπευτικό στόχο για τη GC και για τη διερεύνηση του μηχανισμού σηματοδότησης των CDH17 σε GC, χαρακτηρίσαμε την έκφραση των CDH17 σε ανθρώπινες κυτταρικές GC γραμμές και Κινέζοι ιστούς GC, ελέγχεται η επίδραση της CDH17 νοκ ντάουν ή υπερ- έκφραση στο ογκογόνο και μεταστατικό επίδραση των κυτταρικών GC γραμμές, και να διερευνηθούν οι πιθανές καταρράκτες του σήματος που σχετίζονται με CDH17. Παρατηρήσαμε μια υψηλή έκφραση CDH17 σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές και GC κινέζικα ιστούς GC, και μια σαφή αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, η μετανάστευση, προσκόλληση, το σχηματισμό αποικιών, επαγωγή απόπτωσης, και διακοπή του κυτταρικού κύκλου μετά την φίμωση του CDH17 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας αποδεικνύουν κατ ‘αρχάς την ικανότητα των CDH17 να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα της ιντεγρίνης-Ras /Raf /MEK /ERK μονοπάτι για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε GC, και υποδηλώνουν ότι CDH17 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο για μελλοντική έρευνα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η χρήση και τη φροντίδα των πειραματόζωων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά φροντίδα και χρήση (IACUC), Roche R & amp? D Center (Κίνα). Τα ανθρώπινα μπλοκ ιστού GC με το αντίστοιχο γειτονικό μπλοκ ιστού ελήφθησαν από τη Σαγκάη Biochip Company, μια εταιρεία παροχής υπηρεσιών CRO. Όλες οι ανθρώπινοι ιστοί συλλέχθηκαν με γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς πηγή. Όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC, ΗΠΑ, της Ιαπωνίας συλλογή της έρευνας Bioresources, και τη Σαγκάη Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών.

Οι κυτταρικές σειρές και αντιδραστήρια

Όλες οι κυτταρικές σειρές από την αμερικανική Συλλογή Τυπικό κυττάρων (ATCC), ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources, και τη Σαγκάη Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών διατηρήθηκαν σε αντίστοιχες μέσο ανάπτυξης που προτάθηκαν από τους πωλητές. PMD-18T-CDH17 πλασμίδιο ήταν από Σινο Βιολογικών Inc. τετρακυκλίνη (Tet) ήταν από την Sigma, Cell Μετρώντας Kit-8 ήταν από Dojindo Μοριακής Tech. Ανθρώπινο πλάσμα Ινονεκτίνης ήταν από την R &? Συστήματα Δ. Transwell θάλαμο ήταν από την Corning (6,5-mm διαμέτρου, 8-μm μέγεθος πόρων). CDH17 ολιγο siRNA ήταν από Genepharma Co. με την ακολουθία 5’AAGGCCAAGAACCGAGUCATT 3 ‘. Scram ελέγχου RNA (Allstar®) ήταν από την QIAGEN.

Ιστός μικρο σειρά ανοσοϊστοχημεία

Δύο εκατόν δεκαέξι τομές παραφίνης μπλοκ γαστρικού καρκίνου ιστό μαζί με τα αντίστοιχα γειτονικά τμήματα ιστού (παρακείμενο ιστό ελήφθη δείγμα τουλάχιστον 5 εκατοστά μακριά από πρωτοπαθείς όγκους) συλλέχθηκαν και κατατίθενται από τη Σαγκάη Biochip Εταιρείας. Οι ιστοί κόπηκαν και τυχαία που παρασκευάζεται σε 3 μικρές διαφάνειες πίνακα. Οι ηλικίες των ασθενών ήταν 32-84 ετών (μέση ηλικία 65 ετών), με διοργάνωση από 1Α-4 σύμφωνα με την αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (AJCC) κατευθυντήριες γραμμές Εκδ.7. Όλες οι περιπτώσεις διαγνώστηκαν με δύο ανώτεροι παθολόγους με έμπειρους ειδικότητα στο γαστρικό παθολογία του καρκίνου. Οι πλάκες επωάστηκαν σε αποκλεισμό ορό για 20 λεπτά, στη συνέχεια καλύπτονται από 100 μι αντι-ανθρώπινης καντερίνης-17 συγγένεια καθαρισμένο μονοκλωνικό Ab, IgG ποντικού (R &? D MAB1032 1:2000 εντός TBS /T) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι πλάκες που καλύπτονται από 100 μι DAKO Οραματιστείτε + /HRP, Κουνέλι /ποντίκι αφού πλυθεί καλά με TBS. Εκατό μικρολίτρα διαλύματος υποστρώματος-χρωμογόνου (DAB) εφαρμόστηκαν στις πλάκες και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Βιτρώ διαφάνειες εξετάστηκαν μικροσκοπικά από δύο εμπειρογνώμονες ανοσοϊστοχημεία. Η κανονική IgG ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Η χρώση θεωρήθηκε αρνητική όταν μπορούσε να εντοπιστεί και θετικών καθόλου χρώση θετική κυτταρική μεμβράνη όταν περισσότερο από το 10% των καρκινικών κυττάρων έδειξαν θετικής μεμβράνης ανοσοχρώση κύτταρο.

TR σταθερές κυτταρικές σειρές

Ο pLenti6 /φορέα TR (Invitrogen, Cat. Νο V48020) και pLenti3.3 /TR φορέα (Invitrogen, Cat. Νο A11114) χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργηθούν σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν ιδιοσυστατικά υψηλά επίπεδα του καταστολέα Tet. Αυτά τα πλασμίδια έκφρασης περιέχουν στοιχεία που επιτρέπουν τη συσκευασία του κατασκευάσματος σε ιοσωμάτια και το βλαστισιδίνη ή γενετικίνη δείκτη αντίστασης για επιλογή σταθερά μετασχηματισμένων γραμμών κυττάρων. Εν συντομία, κύτταρα συσκευασίας 293FT (Invitrogen, Cat Νο. R700-07) επιμολύνθηκαν με το pLenti6 /TR ή pLenti3 /TR και το ViraPower

Mix TM συσκευασίας (Invitrogen, Cat. Νο K4975-00) για να παραχθεί φακοϊικό σωματίδια. Η lentivirus χρησιμοποιήθηκαν για την μεταγωγή κυττάρων AGS ή MGC-803 και το βλαστισιδίνη (8 μg /ml, Invitrogen, Cat. Νο R210-01) ή γενετικίνη (200 μg /ml, Νο Invitrogen, Cat. 10131-027) ήταν χρησιμοποιείται για την επιλογή για μια σταθερή AGS κύτταρα TR-εκφράζουν ονομάζεται TR-AGS σταθερή κυτταρική γραμμή ή TR-εκφράζουν MGC-803 κύτταρα που ονομάζεται TR-MGC-803 σταθερή κυτταρική γραμμή. Αυτές TR που εκφράζουν κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν ως ξενιστές για μορφώματα έκφρασης που διευκολύνουν Tet-ρυθμιζόμενη έκφραση του CDH17 shRNA (σύντομη φουρκέτα RNA) ή γονίδιο CDH17, αντίστοιχα.

Σταθερό AGS κυττάρων με Tet-ρυθμιζόμενη έκφραση shRNA του γονιδίου CDH17

Τέσσερις miRNA ολιγονουκλεοτίδια που στοχεύουν CDH17 γονίδιο ([Homo sapiens] Gene ID: 1015) σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα εφαρμογής internet (Invitrogen). Αυτά δίκλωνο DNA συνδέθηκαν εντός του pcDNA6.2 ™ σύστημα έκφρασης -GW /EmGFP-miR (Invitrogen, Cat. Νο K4936-00) τα οποία στη συνέχεια πρόσκαιρα διαμολύνθηκαν σε κύτταρα AGS με τις πρότυπες διαδικασίες Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat Νο. 11668-027). Σύμφωνα με ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR, η αλληλουχία 90-2 (Forward εκκινητής: 5′-TGCTGTGTACTTCACACCAAACACTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAGTGTTTTGTGAAGTACA-3 ‘? Αντίστροφο εκκινητή: 5′-CCTGTGTACTTCACAAAACACTAGTCAGTCAGTGGCCAAAACTAGTGTTTGGTGTGAAGTACAC-3’) του miRNAs έδειξε την υψηλότερη απόδοση και επελέγη για να ανά μορφή BP ανασυνδυασμού να αποκτήσουν pENTR-miRNA. Αυτός ο φορέας καταχώρηση στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε σε ανασυνδυασμό με LR pLenti4 /ΤΟ /V5 (Invitrogen, Cat. Νο K4920-00) για να ληφθεί pLenti4 /ΤΟ /V5-miRNA lentivirus χρησιμοποιώντας τεχνολογία Gateway® (Invitrogen, Cat.No.12535-019 ). Η lentivirus χρησιμοποιήθηκαν για την μεταγωγή TR-AGS σταθερών κυττάρων και 200 ​​μg /ml Zeocin (Invitrogen, Cat Νο. R250-05) χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή για μια σταθερή Tet-ρυθμιζόμενη έκφραση κυττάρων CDH17 shRNA ονομάζεται TR-AGS-CDH17_KD σταθερή κυτταρική γραμμή.

Σταθερή MGC-803 κύτταρα με Tet-ρυθμίζεται η υπερέκφραση του γονιδίου CDH17

Εν συντομία, CDH17 ακολουθία ενισχύθηκε από PMD-18T-CDH17 πλασμίδιο (σινο Βιολογικών Inc.) και υποκλωνοποιείται IRES -EGFP φορέα για τη λήψη CDH17-IRES-EGFP χρησιμοποιώντας εκκινητές: Προώθηση εκκινητής: 5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGCCACCATGATACTTCAGGCCCATCTTCAC-3 ‘? Αντίστροφο εκκινητή: 5’-TAGGGGGGGGGGAGGGAGAGGGGCGGATCCTCACCTTCTCAGAGGTTTGACTTCA-3 ‘). Αυτό το κατασκεύασμα χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει BP ανασυνδυασμός για να ληφθεί pENTR-CDH17-IRES-EGFP. Στη συνέχεια, ο φορέας εισόδου και pLenti6.3 /ΤΟ /V5 (Αρ V370-06 Invitrogen, Cat.) Φορέα χρησιμοποιήθηκαν σε LR ανασυνδυασμό για να ληφθεί pLenti6.3 /ΤΟ /V5-CDH17-IRES-EGFP. Στη συνέχεια, η lentivirus παρήχθησαν για την μεταγωγή TR-MGC-803 σταθερά κύτταρα και 4 μg /ml βλαστισιδίνη χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή για μια σταθερή Tet-ρυθμιζόμενη κύτταρα γονιδιακή έκφραση CDH17 ονομάζεται TR-MGC-803-CDH17_Over σταθερή κυτταρική γραμμή.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Για siRNA προσδιορισμούς παροδικής επιμόλυνσης, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε εκατοστά πιάτο 10 με πυκνότητα 5 × 10

6 κύτταρα /τρυβλίο και επιμολύνθηκαν με 20 ηΜ siCDH17 ή σκαρφάλωμα siRNA. Μετά από 48 ώρες επώασης, τα κύτταρα διαχωριστεί και μεταφέρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων σε πυκνότητα 3000 κύτταρα /φρεάτιο, στη συνέχεια επωάστηκαν για άλλες 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με CCK-8 kit (Donjindo, Ιαπωνία). Για TR-διεγέρσιμο AGS-CDH17_KD σταθερά κύτταρα, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 60 mm × 15 mm δίσκου και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς Tet (0, 2,5 και 5,0 μg /ml) για διαφορετικό χρόνο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 2, 3, 4, 5 και 6 ημέρες και ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε με ScepterTM χειρός Automated κυττάρων Counter (Millipore). Για τη δοκιμασία διάσωσης πολλαπλασιασμού, TR-διεγέρσιμο σταθερά κύτταρα AGS-CDH17_KD σπάρθηκαν σε 60 mm × 15 mm δίσκου και καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες με ή χωρίς 5,0 μg /ml Tet. Για την ομάδα διάσωσης, το μέσο καλλιέργειας που περιείχε Tet αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο την ημέρα 4, και τα κύτταρα συνέχισαν να καλλιεργηθούν σε μέρα 10. Τα κύτταρα σε κάθε ομάδα συλλέχθηκαν την ημέρα 2, 4, 6, 8 και 10 για τον αριθμό των κυττάρων καταμέτρηση και ανάλυση Western blotting.

Η μετανάστευση των κυττάρων

δοκιμασία

TR-AGS-CDH17_KD σταθερά κύτταρα σπάρθηκαν σε cm τρυβλίο 10 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς Tet (5 μg /ml). Μετά από 120 ώρες καλλιέργειας, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν. 0,1 ml εναιωρήματος κυττάρων (1, 2, 3 × 10

4 κύτταρα /ml) προστέθηκε στο ανώτερο διαμέρισμα του θαλάμου. 0.6 ml 10% μέσου FBS προστέθηκε στο κατώτερο διαμέρισμα ως προσελκυστικό χημειο. Μετά από 24 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 90% EtOH στους 4 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίζονται με 0,1% κρυσταλλικό ιώδες επί 15 λεπτά. Τα κύτταρα μη διακινούμενο απομακρύνθηκαν από την άνω όψη της μεμβράνης transwell με μια μπατονέτα. Τα βαμμένα κύτταρα στη συνέχεια φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν υπό οπτικό μικροσκόπιο.

Η κυτταρική πρόσφυση

δοκιμασία

TR-AGS-CDH17_KD σταθερά κύτταρα σπάρθηκαν σε cm τρυβλίο 10 και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς Tet (5 μg /ml). Προ-επίστρωση των πλακών 96 φρεατίων πραγματοποιήθηκε με επώαση φρεάτια με 25 μg /ml ινονεκτίνης σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Για να μειωθεί η μη ειδική δέσμευση, 1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται για 60 λεπτά στους 37 ° C, BSA πλύθηκε δύο φορές με αποστειρωμένο PBS. 120 ώρες μετά knockdown CDH17 με Tet, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και σπάρθηκαν σε προ-επικαλυμμένες πλάκες 96-φρεατίων με 4 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. 2 ώρες αργότερα, τα μη-προσκολλημένα κύτταρα απομακρύνθηκαν με πλύση με στείρο PBS για δύο φορές. Τα προσκολλημένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία με το κιτ CCK-8.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

Αρχικά, τρυβλία 6 φρεατίων παρασκευάσθηκαν με κάτω στιβάδα άγαρ (0.6% gel). Στη συνέχεια, τα κύτταρα TR-AGS-CDH17_KD ή siCDH17 επιμολυσμένα κύτταρα (όπως δοκιμασία πολλαπλασιασμού) αιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο που περιέχει 0,3% -0,4% άγαρ Noble (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και σπέρνονται σε παρασκευάζονται πλάκα 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 7 ή 14 ημέρες. Τα κύτταρα βάφτηκαν με θειαζολύλιο μπλε βρωμιούχο τετραζόλιο (ΜΤΤ) για 2 ώρες. μετρήθηκε ο αριθμός των αποικιών των κυττάρων.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

TR-AGS-CDH17_KD σταθερά κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα έξι στα 1,0 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και κατεργάζεται με 5 μg /ml Tet. 120 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψίνη και σταθεροποιήθηκαν με EtOH στους 4 ° C για 3 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 1500 g για 5 λεπτά και πλύθηκαν με PBS. Re-αιωρημένα κύτταρα στη RNase /PBS διαλύματα (20 μg /ml), επωάστηκαν στους 37 ° C για 15 λεπτά, στη συνέχεια προστέθηκε PI /PBS διαλύματα (20 μg /ml) και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, επιθεώρησε τα χρωματισμένα κύτταρα με BD FACS Calibur και ανέλυσε τα δεδομένα με το Pro λογισμικό BD CellQuest.

Η απόπτωση ανάλυση

TR-AGS-CDH17_KD σταθερή κύτταρα σπάρθηκαν σε μια πλάκα από έξι σε 1,0 × 10

5 κύτταρα /καλά και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μg /ml Tet. 120 ώρες αργότερα, τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τρυψίνη και πλύθηκαν με προψυχθέν PBS μία φορά. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 500 μΙ 1 χ ρυθμιστικού διαλύματος και 5 μλ ΡΙ και προστέθηκαν 5 μΐ Αηηβχίην (BD) σύνδεση. Μετά από επώαση σε σκοτάδι (θερμοκρασία δωματίου) για 10 λεπτά, τα χρωματισμένα κύτταρα επιθεωρήθηκαν με BD FACS Calibur. Τα συλλεχθέντα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό Pro BD CellQuest.

κηλίδωση Western ανάλυση

Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό RIPA [150 mM NaCl, 1% ΝΡ40, 0.25% δεοξυχολικό και 10 mM Hepes (ρΗ 7.4)] που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Molecular Biochemicals). Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση της μεθόδου δικιγχονινικού οξέος (BCA) (Pierce). Τριάντα μικρογραμμάρια πρωτεΐνης ανά δείγμα έβρασε σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης και ηλεκτροφορήθηκε σε 8-12% κλίση γέλες SDS πολυακρυλαμιδίου (Invitrogen) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντισώματα (CDH17, Ιντεγκρίνης β1, Ιντεγκρίνης β4, β5 ιντεγκρίνη, ρ-ρ53, ρ53, ρ21 ήταν από R &? Α, Raf, π-ΜΕΚ, ΜΕΚ, ρ-ΕΚΚ, ERK ήταν από κυτταρική σηματοδότηση, και K-Ras ήταν από την Santa Cruz) και ακολουθείται από ένα συζευγμένο με υπεροξειδάση ανοσοσφαιρίνης. Κηλίδες Western έγιναν ορατά με ένα κιτ ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) (GE, Healthcare)

Antibody συστοιχίες δοκιμασία

Τρεις τύποι συστοιχίες αντισωμάτων ελήφθησαν από την R & amp?. D Systems, Inc. για αντίσωμα συστοιχίες δοκιμασία. Ανθρώπινη Phospho-κινάσης Array Kit (Cat. Νο ARY003) περιέχει 43 διαφορετικές κινάσες. Διαλυτού ανθρώπινου υποδοχέα Array Kit μη αιμοποιητικά Panel (Cat. Νο ARY012) περιέχει 119 διαφορετικά διαλυτών υποδοχέων. Ανθρώπινα απόπτωση Array Kit (Cat. No. ARY009) περιέχει 35 διαφορετικά αντισώματα απόπτωση. Περισσότερες λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με αυτές τις συστοιχίες μπορούν να βρεθούν στο σύνδεσμο των R &? D Systems: https://www.rndsystems.com/. TR-AGS-CDH17_KD σταθερά κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 120 ώρες σε επεξεργασία με ή χωρίς Tet (5 μg /ml) και οι πρωτεΐνες υπέστησαν λύση με ρυθμιστικό λύσης με αναστολείς πρωτεάσης, κυτταρικά εκχυλίσματα αραιώθηκαν και επωάστηκαν με τους τρεις τύπους των συστοιχιών αντισωμάτων επί μία νύκτα . Οι συστοιχίες πλύθηκαν για απομάκρυνση αδέσμευτων πρωτεϊνών, που ακολουθείται από επώαση με ένα κοκτέιλ από βιοτινυλιωμένα αντισώματα ανίχνευσης. Όλες οι διαδικασίες είναι σύμφωνα με τις οδηγίες του κιτ. Οι κηλίδες αναλύθηκαν με πυκνομετρία, και η έκφραση πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε σε θετικό έλεγχο που αντιπροσωπεύονται σε κάθε μεμβράνη.

Μέτρηση της in vivo δραστικότητας

κύτταρα TR-MGC803-CDH17_Over (1 × 10

7 κύτταρα σε 0,2 ml PBS) εγχύθηκαν σε αριστερό μασχάλη του 5~6-εβδομάδων BALB /c ηυ /ηυ αθυμικοί θηλυκού ποντικού (σινο-βρετανική SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Κίνα). Ο όγκος του όγκου (mm

3) μετρήθηκε με παχύμετρο και υπολογίζεται ως (W

2 χ L) /2, όπου W είναι το πλάτος και το L είναι το μήκος. Όταν ο όγκος του όγκου έφτασε ~ 100 mm

3, οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες (9 ποντικοί σε κάθε ομάδα). Tetracylcine επαγωγή (Invitrogen, 0,2 mg /ml, που παρέχεται σε αποστειρωμένο πόσιμο νερό που περιέχει 2.5% σακχαρόζη) προετοιμάστηκε για την ομαδοποίηση ημέρα. Αποστειρωμένο πόσιμο νερό που περιέχει 2.5% σακχαρόζη παρεσχέθη στους ποντικούς σε μη επαγόμενη ομάδα. Οι όγκοι των όγκων καταγράφηκαν κάθε 3 ημέρες έως ότου θυσιάστηκαν τα ζώα. Μετά την επαγωγή 35 ημέρες, ιστούς όγκων ξενομοσχεύματος συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western για σχετική έκφραση πρωτεΐνης.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσοι ± s.d. και στατιστικά υποβλήθηκαν σε unpaired t-test του Student. Το επίπεδο της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική

Αποτελέσματα

προφίλ έκφρασης των CDH17 στο γαστρικό καρκίνο

Το επίπεδο έκφρασης των πρωτεϊνών CDH17 σε 30 κυτταρικές σειρές κατηγοριοποιήθηκε. σε 4 ομάδες με βάση τα δεδομένα από την ανάλυση οπτικής πυκνότητας έναντι βήτα-ακτίνης. AGS κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο για την αποφυγή της ασυμφωνίας μεταξύ γέλες. Πάνω από το 66% των κυτταρικών γραμμών GC (20/30) ήταν θετικοί CDH17 (Σχήμα 1Α).

είναι (α) Τριάντα γαστρικού κυτταρικές σειρές λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση Western blot (αριστερά). Όλα ελέγχονται κύτταρα κατηγοριοποιούνται σε 4 επίπεδα έκφρασης των CDH17, High, Median (Medi), Low, δεν ανιχνεύεται (ΝΔ), με βάση την ανάλυση οπτικής πυκνότητας έναντι β-ακτίνης (δεξιά)? (Β) Εκπρόσωπος IHC εικόνες από ασθενή 1 (καλά διαφοροποιημένο γαστρικό καρκινικό ιστό), ασθενής 2 (ελάχιστα διαφοροποιημένο γαστρικό καρκινικό ιστό) και ο ασθενής 3 (παρακείμενο φυσιολογικό ιστό)? CDH17 έδειξε σαφή θέση της μεμβράνης σε όγκο ή γειτονικούς ιστούς? (C) Εκπρόσωπος IHC φωτογραφίες των θετικών λεκέ CDH17 με βαθμολογία από + έως +++.

Η

Η έκφραση και ο εντοπισμός των CDH17 στην πρωτοβάθμια τμήμα παραφίνης ιστού ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε μικροσυστοιχίες ιστό. Σε σύγκριση με πλάκες ελέγχου χρωματίστηκαν με κανονικό IgG ποντικού, χρώση CDH17 mAb καταδείχθηκε σαφής εντόπιση της κυτταρικής μεμβράνης (Σχήμα 1Β). Μεταξύ των 216 περιπτώσεων με επιβεβαιωμένη έκθεση παθολογία διάγνωση, 73,6% καρκινικούς ιστούς (159/216) έτρεφε θετικά λεκέ CDH17 με βαθμολογία από + έως +++, ενώ το 37% θετική χρώση CDH17 στις αντίστοιχες παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς (Πίνακας 1). Σε CDH17 θετικές περιπτώσεις, το επίπεδο έκφρασης της CDH17 έχει θετική συσχέτιση με μετάσταση στους λεμφαδένες. Ωστόσο, το επίπεδο έκφρασης είναι αντίστροφα σχετίζεται με γαστρικό εισβολή τοίχο, όγκου μακρινή μετάσταση, και τα στάδια ΤΝΜ του όγκου. Η παρατήρησή μας ήταν σύμφωνη με προηγούμενες κλινικές εκθέσεις [20] – [22]. Μεταξύ CDH17 θετικές περιπτώσεις, καρκινικούς ιστούς παρουσίασαν ισχυρότερη χρώση του CDH17 (32,1% ως βαθμολόγησης +, 25,2% ως βαθμολόγησης ++ και 42,8% ως βαθμολόγησης +++) από εκείνη των γειτονικών φυσιολογικών ιστών (62,5% ως βαθμολόγησης +, 21,3% ως σκοράροντας ++ και 16,3% ως βαθμολόγησης +++). Παρόλο που δεν παρατηρήθηκε σημαντική σχέση μεταξύ της βαθμολόγησης λεκέ και κλινικό στάδιο. Λαμβάνοντας όλα αυτά μαζί αποδεικνύει, CDH17 μπορεί να είναι ένα διαγνωστικό δείκτη για πρώιμο στάδιο γαστρικού καρκίνου στην κινεζική πληθυσμούς.

Η

μεσολάβηση RNAi γκρεμίζω CDH17 σε κυτταρικές σειρές GC έδειξε καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών in vitro

με βάση τα αποτελέσματα του προφίλ έκφρασης CDH17 σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών GC (Σχήμα 1Α), AGS (υψηλότερη CDH17), BGC-823 (κατώτερο CDH17) και HGC-27 κυτταρικές γραμμές (κανένας CDH17) ήσαν επιλέγονται για περαιτέρω in vitro κυτταρική λειτουργική εκτίμηση με μεσολάβηση RNAi CDH17 σίγηση. Κηλίδωση Western έδειξε ότι AGS κύτταρα είχαν υψηλό επίπεδο πρωτεϊνών CDH17 και έκφραση CDH17 χτυπήθηκε κάτω σχεδόν εξ ολοκλήρου από siCDH17. κύτταρα BGC823 είχαν χαμηλά επίπεδα της πρωτεΐνης CDH17 και HGC-27 δεν είχε καμία CDH17 πρωτεΐνης (Εικόνα 2Α). Σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου σκαρφάλωμα, CDH17 χτυπήσει κάτω είχε μικρή επίδραση επί της πολλαπλασιαστικής ικανότητας των κυττάρων BGC823 και HGC27, ενώ είχε δραματική επίδραση επί AGS (κατά 60% σε 72 ώρες, Σχήμα 2Β). Δοκιμασία μαλακού άγαρ έδειξε ότι η ικανότητα να σχηματίζουν αποικία αναστάλθηκε σε AGS κύτταρα εάν CDH17 ήταν γκρεμίζω (κατά 66% στα 14 δ), αλλά σε BGC823 κύτταρα και HGC27 κύτταρα, CDH17 χτυπήσει κάτω είχε μικρή επίδραση στην ικανότητα σχηματισμού αποικιών (Εικόνα 2C). Δεν υπήρχε εμφανής διαφορά μεταξύ BGC823 κύτταρα (χαμηλό επίπεδο CDH17) και HGC-27cells (μη-CDH17) στην αναστολή του πολλαπλασιασμού και της αποικίας σχηματισμό που προκαλείται από siRNA CDH17 νοκ ντάουν.

(Α) Το siRNA knock-down αποτελεσματικότητα επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με 20 nM siCDH17 ή αγωνίζομαι siRNA? δοκιμασία (Β) Πολλαπλασιασμός. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 20 ηΜ siCDH17 ή σκαρφάλωμα siRNA σε δίσκους 10 εκ. 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα αιωρήθηκαν και επανακαλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με πολλαπλασιασμό CCK-8 κύτταρο κιτ 72 ώρες μετά την διαδικασία σποράς. Το πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση? δοκιμασία σχηματισμού (C) αποικίας. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siCDH17 ως δοκιμασία πολλαπλασιασμού και επανακαλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων. Οι αποικίες μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο μετά χρωματίστηκαν με ΜΤΤ 14 ημέρες μετά τη σπορά. Το πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και οι τυπικές εικόνες απεικονίζεται. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση.

Η

Σταθερές κυτταρικές σειρές που φέρουν TR επαγώγιμη knockdown του CDH17 σε AGS κύτταρα και υπερέκφραση του CDH17 σε MGC-803 κύτταρα

Η αλληλουχία στόχος σε exon13 (90-2) έδωσε πάνω από 90% μείωση στο επίπεδο του mRNA (Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε pLenti4 /ΝΑ /V5-miRNA-90-2 CDH17 φακοϊού για την μεταγωγή TR-AGS σταθερή κύτταρα και πήρε μια σταθερή Tet-ρυθμισμένη έκφραση shRNA των κυττάρων γονιδίου CDH17 (TR-AGS-CDH17_KD), το οποίο μειώθηκε το επίπεδο της πρωτεΐνης CDH17 περίπου 90% μετά από επαγωγή με 5 μg /ml Tet (Σχήμα 3Β). Η pLenti6.3 /ΤΟ /V5-CDH17-IRES-EGFP lentivirus χρησιμοποιήθηκε για τη μεταγωγή TR-MGC-803 σταθερά κύτταρα και επιλέγονται με βλαστισιδίνη για να πάρετε ένα σταθερό Tet-ρυθμιζόμενη έκφραση γονιδίων κυττάρων CDH17 (TR-MGC-803-CDH17_Over) . Η υπερέκφραση του CDH17 σε αυτή σταθερές κυτταρικές επιβεβαιώθηκε στο επίπεδο πρωτεΐνης με κηλίδωση Western (Εικόνα 4Α).

Διαφορετικές δοκιμασίας που περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους. (Α) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση έδειξε ότι το χτύπημα κάτω των CDH17 σε επίπεδο mRNA στο AGS κύτταρα (C), AGS κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με ροϋΝΑ

TM6.2-GW /EmGFP-αγωνίζομαι miR πλασμίδιο (NC) και pcDNA

TM6.2-GW /EmGFP-CDH17 miR πλασμίδια (90-1, 90-2, 90-3, και 90-4)? (Β) Κηλίδωση Western για την επίδραση των CDH17 knockdown χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις του Tet για 48 ώρες σε κύτταρα TR-AGS-CDH17_KD? (Γ) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, η μετανάστευση (6 ημέρες μετά τη θεραπεία), πρόσφυσης (6 ημέρες μετά τη θεραπεία **

P

& lt?. 0.01). Και το σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ (7 ημέρες μετά τη θεραπεία **

P

& lt? 0,01)? δοκιμασία διάσωσης (D) Πολλαπλασιασμός. TR-διεγέρσιμο AGS-CDH17_KD σταθερά κύτταρα σπάρθηκαν σε 60 mm × 15 mm δίσκου και καλλιεργήθηκαν για 10 ημέρες με ή χωρίς 5,0 μg /ml Tet. Για την ομάδα διάσωσης, το μέσο καλλιέργειας που περιείχε Tet αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο την ημέρα 4, και τα κύτταρα συνέχισαν να καλλιεργηθούν σε μέρα 10. Τα κύτταρα σε κάθε ομάδα συλλέχθηκαν την ημέρα 2, 4, 6, 8 και 10 για τον αριθμό των κυττάρων καταμέτρηση (αριστερά) και κηλίδωση Western ανάλυση (δεξιά)? (Ε) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου μετά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5,0 μg /ml Tet για 6 ημέρες? και (F) ανάλυση κυτταρικής απόπτωσης αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5,0 μg /ml Tet για 6 ημέρες με κυτταρομετρία ροής

Η

(Α) Κηλίδωση Western έδειξε την αποτελεσματικότητα επαγωγή CDH17 υπερέκφραση.? (Β) Η ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια. Όταν ο όγκος του όγκου έφτασε ~ 100 mm

3, το πόσιμο νερό αντικαταστάθηκε με 2,5% σακχαρόζη που περιείχε 0,2 mg /ml Tet ή όχι. *

P

& lt? 0,05, Tet-on ομάδα vs Tet-ελεύθερη ομάδα? (C) Κηλίδωση Western ανάλυση των ιστών ξενομοσχεύματος όγκου.

Η

εξόντωση CDH17 επάγεται αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, η μετανάστευση, προσκόλληση, το σχηματισμό αποικίας και επαγωγή στη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την απόπτωση

οι TR-AGS κύτταρα (κύτταρα ελέγχου) και τα κύτταρα TR-AGS-CDH17_KD χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθούν οι πιθανές κυτταρικές λειτουργικές επιδράσεις της shRNA μεσολάβηση CDH17 νοκ ντάουν στα AGS κύτταρα. κύτταρα TR-AGS-CDH17_KD κατεργασία με 5 μg /ml Tet έδειξαν μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (κατά 75,8% σε 5 ημέρες), ικανότητα μετανάστευση κυττάρων (κατά 68,1% σε 16 ώρες), την ικανότητα προσκόλλησης κυττάρου (κατά 46,8% στα 30 λεπτά ), και την ικανότητα σχηματισμού (κατά 92,7% στις 7 ημέρες αποικία) σε σύγκριση με Tet δωρεάν (Σχήμα 3C). Στη μελέτη διάσωσης πολλαπλασιασμό, CDH17 νοκ ντάουν στα κύτταρα TR-AGS-CDH17_KD προκαλείται από Tet μπορεί να διασωθεί από την αφαίρεση Tet. Μετά την αφαίρεση Tet την ημέρα 4, εκ νέου έκφραση CDH17 παρατηρήθηκε την ημέρα 8 και 10 του πολιτισμού στην CDH17 shRNA νοκ ντάουν AGS κύτταρα. Re-έκφραση του CDH17 θα μπορούσε να διασώσει την ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων TR-AGS-CDH17_KD (Σχήμα 3D). Σε σύγκριση με ελεύθερα κύτταρα TR-AGS-CDH17_KD Tet, Tet επί κυττάρων έδειξε ένα σημαντικά αυξημένο ποσοστό κυττάρων σε G0 /G1 και G2 /M φάση και μια εντυπωσιακά απεβίωσε ποσοστό των κυττάρων στη φάση S (Σχήμα 3Ε). Εν τω μεταξύ, παρατηρήσαμε επίσης ότι ο αριθμός των αποπτωτικών κυττάρων (κατά 52,2% σε 5 ημέρες) αυξήθηκε κατά μειορύθμιση CDH17 σε κύτταρα TR-AGS-CDH17_KD (Σχήμα 3F). Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στο TR-AGS σταθερή κυτταρική γραμμή με ή χωρίς Tet επώασης.

Η υπερέκφραση της CDH17 προώθησε την ανάπτυξη των καρκινικών ξενομοσχευμάτων σε γυμνά ποντίκια

κύτταρα TR-MGC-803-CDH17_Over εγχύθηκαν υποδόρια στις λαγόνες BALB /c γυμνά ποντίκια για να σχηματίσουν συμπαγή όγκο. Η έκφραση του CDH17 ήταν υπό τον έλεγχο του Tet στο πόσιμο νερό. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά από επαγωγή 35 ημέρες, Tet επαγόμενη ομάδα (όγκος όγκου = 1849,08 ± 423.46m3) παρουσίασαν 2,27 φορές υψηλότερο ρυθμό ανάπτυξης πρόοδος έναντι Tet-ελεύθερη ομάδα (όγκος όγκου = 814,04 ± 234.69m3) (ρ & lt? 0,05) ( Σχήμα 4Β), και επαγόμενη έκφραση CDH17 σε ιστούς όγκων μπορεί να αναλυθεί με κηλίδωση Western (Σχήμα 4C). Ανέφερε ότι CDH17 παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του γαστρικού καρκίνου. Χρησιμοποιήσαμε επίσης τα κύτταρα TR-AGS-CDH17_KD να παρατηρήσει αν φίμωση της CDK17 μπορεί να επηρεάσει την ογκογονικότητα σε γυμνούς ποντικούς. Δυστυχώς, ο όγκος λάβει ποσοστό αυτής της κυτταρικής σειράς ήταν πολύ χαμηλή και δεν υπάρχει αξιόπιστη in vivo αποτελέσματα παρατηρήθηκαν με κυτταρική σειρά TR-AGS-CDH17_KD.

Προσδιορισμός τα συναφή επίπεδα της πρωτεΐνης μετά από νοκ ντάουν CDH17 από αντίσωμα δοκιμασία συστοιχίες

Σύμφωνα με τα ογκογόνα αποτελέσματα (αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, σχηματισμό αποικιών, και την ανάπτυξη του όγκου in vivo) και μεταστατική αποτελέσματα (αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων και προσκόλληση) του CDH17 knockdown, επιλέγουμε τρεις συστοιχίες αντισωμάτων (από την R & amp? συστήματα D ) για να ελέγξετε τις σχετικές μεταβολές των πρωτεϊνών και ελπίζουν να βρουν ρυθμίζονται πρωτεΐνες που σχετίζονται με ισχυρή CDH17. Στην συστοιχία απόπτωση, φωσφο-ρ53 (S15, S46 και S392) και p21 /έκφραση /CDNK1A Cip1 αυξήθηκε περίπου δύο φορές μετά από 5 μg /ml θεραπεία Tet για 5 ημέρες σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5Α (α) και 5Β). Στο φωσφο-κινάση συστοιχία, φωσφο-ρ53 (S15, S46 και S392) έκφραση επίσης αυξήθηκε μετά τη θεραπεία Tet και, την ίδια στιγμή, η έκφραση φωσφο-ERK1 /2 (T202 /Y204) μειώθηκαν (Σχήμα 5Α (β) και 5Β). Στην συστοιχία διαλυτό υποδοχέα, knockdown του CDH17 σε AGS κύτταρα θα μπορούσαν να μειώσουν σημαντικά την έκφραση του ιντεγρίνης β1, β4, β5, ενώ δεν είχε επίδραση στην έκφραση του EGFR (Εικόνα 5Α (γ) και 5Β). Οι αναλογίες αλλοίωση των ενδιαφερομένων πρωτεϊνών μεταξύ Tet-on και Tet-free AGS κύτταρα συνοψίζεται στην Εικόνα 5Β.

TR-AGS-CDH17_KD σταθερά κύτταρα επεξεργασμένα ή μη επεξεργασμένα με 5 μg /ml Tet για 5 ημέρες. δοκιμασία array (Α) αντισωμάτων. (Α) Ανθρώπινη Απόπτωση Array Kit, (β) Ανθρώπινη Phospho-Κινάσης Array Kit, (γ) διαλυτού ανθρώπινου υποδοχέα Array Kit μη αιμοποιητικά παράθυρο? (Β) Η αλλαγή αναλογίας σχετικών πρωτεϊνών μεταξύ Tet-on και Tet-ελεύθερα κύτταρα? (C) Αλλαγές των σχετικών πρωτεϊνών που βρέθηκαν σε δοκιμασία συστοιχία αντισωμάτων επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση Western αποτύπωση.

Η

Νοκ ντάουν της CDH17 στο AGS μειωτικά β-ιντεγκρίνες και Ras /Raf /MEK /ERK σηματοδότησης μονοπατιού

Οι πρωτεΐνες αλλαγές από την δοκιμασία συστοιχία αντισωμάτων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western αποτύπωση. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική μείωση της ιντεγκρίνης β1, β4, β5 και φωσφο-ΕΚΚ σε CDH17 knockdown κυττάρων AGS, αλλά καμία σημαντική μεταβολή στην ολική ΕΚΚ (Εικόνα 5C). Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε τη συμμετοχή των άλλων συστατικών της οδού σηματοδότησης Ras /Raf /MEK /ERK. Knockdown του CDH17 οδήγησε σε ρύθμιση προς τα κάτω της Raf, φωσφο-ΜΕΚ, και πρωτεΐνες φωσφο-ΕΚΚ (Εικόνα 5C). Από TR-MGC-803-CDH17_Over in vivo μελέτη, παρατηρήθηκε η υπερέκφραση του CDH17 ενίσχυσε την β1 ιντεγκρίνης, β4, β5 έκφρασης και ERK ενεργοποίηση (Σχήμα 4C) και είναι συνεπής με τις παραπάνω διαπιστώσεις.