Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης RNA που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση με στοχευμένη καταστολή της μεταγραφής και της μετάφρασης. Σε αυτή τη μελέτη δείξαμε ότι miRNA-23b (MIR-23b) δρα ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Ποσοτική ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR έδειξε ότι miR-23b είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης και των ιστών όγκου σε σύγκριση με μη κακοήθη κύτταρα και φυσιολογικά δείγματα ιστού. Μπορούμε επίσης να αποδείξει ότι η έκφραση του miR-23b έχει δυνατότητα να είναι διαγνωστικές και προγνωστικές βιοδείκτη στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. υψηλή έκφραση του miR-23b συσχετίζεται θετικά με την υψηλότερη συνολική επιβίωση των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, όπως αποκαλύπτεται από την ανάλυση Kaplan-Meier. ανάλυση ROC έδειξε ότι η έκφραση miR-23b μπορούν να διακρίνουν μεταξύ της κανονικής και της ουροδόχου κύστης καρκινικούς ιστούς. Περαιτέρω εμείς διευκρινιστεί η βιολογική σημασία του miR-23b στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Υπερ-έκφραση του miR-23b σε καρκινικά κύτταρα κύστης ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικιών εξασθενημένη. Ο φθορισμός ενεργοποιούμενο κυτταρικό διαχωρισμό (FACS) αποκάλυψε ότι η εκ νέου έκφραση του miR-23b σε καρκινικά κύτταρα κύστης που προκαλείται G0 /G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης ενώ αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Δοκιμασίες λουσιφεράσης ανταποκριτή καταδεικνύεται ότι Zeb1, ένα κρίσιμο ρυθμιστής επιθηλιακού-to-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ), είναι ένας άμεσος στόχος του miR-23b στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η απώλεια του miR-23b παρέχει πολλαπλασιαστικό πλεονέκτημα και προάγει τη μετανάστευση κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης και εισβολή. Επιπλέον, η εκ νέου έκφραση του miR-23b μπορεί να είναι μία ευεργετική θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία του καρκίνου ανθρώπινης κύστης

Παράθεση:. Majid S, Dar ΑΑ, Saini S, Deng G, Chang Ι, Greene Κ, et al. (2013) Λειτουργίες microRNA-23b ως ογκοκατασταλτικό ρυθμίζοντας Zeb1 σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 8 (7): e67686. doi: 10.1371 /journal.pone.0067686

Επιμέλεια: Karl X. Chai, University of Central Florida, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Μαρτίου του 2013? Αποδεκτές: 20 Μαΐου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Ιούλη, 2013

Copyright: © 2013 Majid κ.ά.. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας μέσω των αριθμών επιδότησης RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, I01BX001123, VA κριτική Merit και VA Έργου του Προγράμματος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η τέταρτη πιο συχνή κακοήθεια στις Ηνωμένες Πολιτείες, και ένα από τα πιο δαπανηρή σε κλινικά διαχείριση [1]. Περισσότερο από το 90% του όγκους της ουροδόχου κύστης αποτελούνται από μεταβατικού κυτταρικού καρκινώματος (TCC) που προκύπτει από μεταβατικό επιθήλιο [2]. Όγκους της ουροδόχου κύστης κατατάσσονται σε δύο διακριτές κατηγορίες: μη μυών και των μυών επεμβατική καρκίνου της ουροδόχου κύστης [3], [4]. Οι περισσότεροι όγκοι (75-80%) που υπάρχει ως χαμηλής ποιότητας θηλώδες μη επεμβατική όγκους που σπάνια προχωρήσει για να γίνει θανατηφόρο, αλλά σχεδόν πάντα επαναληφθεί. Αυτός ο τύπος καρκίνου ονομάζεται «επιφανειακή» καρκίνος της ουροδόχου κύστης και απαιτεί δαπανηρές μακροπρόθεσμης διαχείρισης. Τα υπόλοιπα είναι υψηλής ποιότητας μυϊκή επεμβατικές όγκους (-15%), η οποία μπορεί γρήγορα να εξελιχθεί για να γίνει μεταστατική και να οδηγήσει στο θάνατο [4]. Αιτιολογικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην καρκινογένεση της ουροδόχου κύστης παραμένουν άγνωστοι, και αποτελεσματική μοριακών δεικτών για την ασθένεια είναι περιορισμένη.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης RNA που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση με στοχευμένη καταστολή της μεταγραφής και της μετάφρασης. Αρκετές μελέτες έχουν γίνει μια συνολική ανάλυση της έκφρασης miRNA σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές και βρέθηκε ιστού και πρότυπα έκφρασης συγκεκριμένες νόσους [5], [6]. Υπάρχει επίσης αυξανόμενες ενδείξεις ότι τα προφίλ έκφρασης των miRNAs μπορεί να είναι ενδεικτική του κινδύνου εκδήλωσης ασθένειας και την επιβάρυνση. Έτσι, miRNAs αξιολογούνται ως πιθανοί βιοδείκτες για να βοηθήσει στη διάγνωση και πρόγνωση των διαφορετικών τύπων καρκίνων [7], [8]. Αρκετές ανθρώπινα miRNAs δειχθεί ότι απορυθμίζεται σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης, συμπεριλαμβανομένων miR-1280, miR-203, miR-125b και miR-133α [9], [10], [11], [12] και να συμβάλουν στην ανάπτυξη και πρόοδο της νόσου. Εδώ αναφέρουμε ότι το miR-23b είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται στην κύστη καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές και αυτό το υψηλό επίπεδο έκφρασης του miR-23b θετικά συσχετίζονται με υψηλότερη συνολική επιβίωση των ασθενών μετά την επέμβαση. Επιπλέον, εξετάσαμε τη λειτουργική σημασία του miR-23b και προσδιορίζονται Zeb1 ως άμεσο στόχο του miR-23b στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Για πρώτη φορά, η μελέτη αυτή δείχνει ότι το miR-23b είναι ένας δυνητικός βιοδεικτών και ογκοκατασταλτικών στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης που στοχεύουν άμεσα ογκογονίδιο Zeb1.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και κυττάρων Πολιτισμού

SV-HUC-1, Τ24 και J82 κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και αναπτύχθηκαν σύμφωνα με τα πρωτόκολλα ATCC. Αυτές οι κυτταρικές σειρές ανθρώπινης προέλευσης είχαν επικυρώνονται από DNA ανάλυση επανάληψης μικρής tandem από την ATCC. Τα πειράματα με κυτταρικές γραμμές που εκτελούνται εντός 6 μηνών από την προμήθεια /ανάνηψης τους. κύτταρα SV-HUC-1 καλλιεργήθηκαν σε F-12K μέσο (ATCC) με 10% FBS. κύτταρα Τ24 καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% FBS και τα κύτταρα J82 καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστα βασικά μέσα (ΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν μέσα σε έναν επωαστήρα με υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 στους 37 ° C.

πλασμίδια, πρόδρομοι και διαμόλυνση

ανιχνευτές TaqMan και πρόδρομες ουσίες για HSA -miR-23b και αρνητικό έλεγχο προ-miR αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (Foster City, CA). pmir-GLO Dual-Luciferase miRNA στόχος φορέα έκφρασης αγοράστηκε από την Promega. microRNA-23b, ελέγχου-microRNA και siRNAs χρησιμοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 50 ηΜ και Lipofectamine 2000 (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις επιμολύνσεις.

RNA Extraction

miRNA και το συνολικό RNA εκχυλίστηκαν από κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας ένα miRNeasy Mini Kit και μια RNeasy Mini Kit (Qiagen). miRNAs από κλινικά δείγματα εκχυλίζονται χρησιμοποιώντας τεχνικές σύλληψης λέιζερ μικροδιατομής με ένα κιτ miRNeasy FFPE (Qiagen).

Ανθρώπινο Κλινικά δείγματα

Τα κλινικά δείγματα ελήφθησαν από τους Σαν Φρανσίσκο Υποθέσεων Βετεράνων (VA) Ιατρικό Κέντρο . Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή UCSF για τα Ανθρώπινα Ερευνών (αριθμός έγκρισης: H9058-35751-01).

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ζευγάρι miRNAs αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Δοκιμασίες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems). Όλες οι αντιδράσεις RT, συμπεριλαμβανομένων των ελέγχων χωρίς πρόπλασμα και RT μείον μάρτυρες, έτρεξαν σε ένα 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems). Οι συγκεντρώσεις RNA προσδιορίστηκαν με ένα NanoDrop (Thermo Scientific, Rockford, IL). Τα δείγματα κανονικοποιήθηκαν για RNU48 (Applied Biosystems). επίπεδα έκφρασης γονιδίων ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Fast Real Time λογισμικό του συστήματος ανίχνευσης αλληλουχίας 7500 (Applied Biosystems). Συγκριτικό πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη εις τριπλούν, συμπεριλαμβανομένων των ελέγχων χωρίς πρόπλασμα. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική Ct.

Κυττάρων Η βιωσιμότητα και Clonability Δοκιμασίες

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σε 24, 48 και 72 ώρες με τη χρήση του CellTiter 96 Υδατικό One Solution κιτ δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού ( Promega, Madison, WI) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας SpectraMAX 190 (Molecular Devices). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή για τα πειράματα εις τριπλούν σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο. Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα (1000 κύτταρα /πλάκα) και αφέθηκαν να αναπτυχθούν έως ότου εμφανίστηκαν ορατές αποικίες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα βάφτηκαν με Giemsa και οι αποικίες μετρήθηκαν.

Μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασίες

Cytoselect 24 φρεατίων μετανάστευση των κυττάρων και προσδιορισμού εισβολή κιτ (Cell Biolabs, Inc) χρησιμοποιήθηκαν για τη μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασίες σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, Τ24 και J82 κύτταρα επιμολυσμένα με Pre-miR πρόδρομος miRNA ή αρνητικό μάρτυρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και επαναιωρήθηκε σε ελεύθερο ορού Ορίί-ΜΕΜ. Τα κύτταρα (10 χ 10

4 ανά 300 μΙ μέσου χωρίς ορό) προστέθηκαν στον άνω θάλαμο, και ο κατώτερος θάλαμος γεμίστηκε με 500 μΙ μέσου που περιείχε 10% FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 16 ώρες στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Μετά από 16 ώρες, η μη μετεγκατάσταση /μη-εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από πάνω πλευρά του φίλτρου μεμβράνης ενθέτων trans-φρεατίων χρησιμοποιώντας ένα βαμβάκι-στυλεό. Μετανάστευσαν /εισέβαλαν κύτταρα στην κάτω πλευρά χρωματίστηκαν και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 560 nm σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ανοσοαποτύπωσης

Η πρωτεΐνη απομονώθηκε από συρροή (70-80%) των πλακών καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο M-PER θηλαστικών Protein Extraction (Pierce Biotechnology, Rockfield, IL) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο Bradford. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου 4-20% νάτριο δωδεκυλ θειικό (SDS) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με μεταφορά βαθμιαίας πτώσης της τάσης. Τα προκύπτοντα στυπώματα φράχθηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα και ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα. Οι κηλίδες κατόπιν επωάστηκαν με κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση και κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Η εξάντληση των Zeb1 Χρησιμοποιώντας μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

καρκίνος της ουροδόχου κύστης Τ24 κύτταρα τοποθετήθηκαν 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Σε 40 έως 50% συρροή, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη-2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) με siRNA δίπολα ειδικό για την ανθρώπινη Zeb1 (SR304746? ΟηΟεηε Technology, Rockville, MD) ή τον έλεγχο μη-σίγηση (NS) siRNA για 72 ώρες . Αρχικά, δύο διαφορετικά σύνολα των siRNA διπόλων ελέγχθηκαν για να αξιολογηθεί η ειδικότητα στόχου και knockdown αποτελεσματικότητα. Ένα siRNA duplex χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω πειράματα στα 50 ηΜ συγκέντρωση.

Luciferase Assay Reporter

Α pmirGLO Dual-Luciferase miRNA φορέα έκφρασης στόχου χρησιμοποιήθηκε για 3′-UTR προσδιορισμούς λουσιφεράσης (Promega, Madison , WI). Το ογκογονίδιο στόχος των miRNA-23b επιλέχθηκε βάσει των online microRNA https://www.microrna.org/microrna/home.do βάσης δεδομένων προορισμού. Οι ακολουθίες αστάρι για τον άγριο τύπο 3’UTR ήταν: Επιθετικός 5 ‘CGCGGCCGCTAGTATTATGTTTTTTAAAATGTGAGT 3’ και Αντίστροφη 5 ‘CTAGACTCACATTTTAAAAAACATAATACTAGCGGCCGCGAGCT 3’. Για το μεταλλαγμένο 3’UTR, οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν: Επιθετικός 5 ‘CGCGGCCGCTAGTATCGTGCGCACTAAGGCTCACTT 3’ και να αντιστρέψει 5 ‘CTAGAAGTGAGCCTTAGTGCGCACGATACTAGCGGCCGCGAGCT 3’. Για lucifease δοκιμασία, Τ24 και J82 κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με HSA-miR-23b και οι φορείς έκφρασης στόχου pmirGLO Dual-Luciferase miRNA με άγριου τύπου ή μεταλλαγμένη αλληλουχία στόχου χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000. Firefly δραστηριότητες λουσιφεράσης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία λουσιφεράσης Διπλή (Promega, Madison, WI) 18 ώρες μετά την επιμόλυνση και τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με λουσιφεράση της Renilla. Κάθε πλασμίδιο αναφοράς επιμολύνθηκε τουλάχιστον τρεις φορές (σε διαφορετικές ημέρες) και κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν.

Στατιστική Ανάλυση

Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με GraphPad Prism 5 και MedCalc έκδοση 10.3.2 . Όλα τα ποσοτικά στοιχεία αντιπροσωπεύει κατά μέσο όρο τουλάχιστον εις τριπλούν δείγματα ή όπως υποδεικνύεται. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση της μέσης τιμής. Όλες οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν δύο ουρά και

ρ

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. καμπύλες λειτουργίας δέκτη (ROC) υπολογίστηκαν για τον προσδιορισμό του δυναμικού του miR-23b σε διακρίσεις μεταξύ των κακοήθεις και μη κακοήθεις δείγματα. Για την ανάλυση επιβίωσης, Kaplan-Meier (log-rank test) ανάλυση εκτελέστηκε.

Αποτελέσματα

miR-23b Έκφραση είναι φτωχό σε ουροδόχου κύστης όγκων και του καρκίνου κυτταρικές γραμμές

Προκαταρκτική δεδομένα microRNA μικροσυστοιχιών απεκάλυψε ότι miR-23b ήταν ιδιαίτερα προς τα κάτω σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με την μη-κακοήθεις κυτταρική γραμμή SV-HUC1. Εμείς επικύρωσε τα δεδομένα μικροσυστοιχιών με miRNA-ποσοτική RT-PCR (MIR qRT-PCR) ανάλυση και τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι miR-23b έχει προς τα κάτω σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές J82, Τ24 σε σύγκριση με μη-κακοήθεις κυτταρική γραμμή SV-HUC1 (Σχήμα 1Α) . Να εξετάσει τη βιολογική σημασία του miR-23b, η έκφρασή της αναλύθηκε σε λέιζερ κατέλαβε μικροτομή (LCM) καρκινικών ιστών ανθρώπινης κύστης και σε σύγκριση με την κανονική συμφωνημένα ιστούς ελέγχου. Η έκφραση του miR-23b βρέθηκε να είναι σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται σε όλα τα δείγματα όγκων συγκριτικά με τους αντίστοιχους κανονικά δείγματα τους (Σχήμα 1Α). Περαιτέρω η έκφραση του miR-23b σε φυσιολογικούς ιστούς σχετίζεται με εκείνη του μη-κακοήθη κυτταρική γραμμή και ότι του όγκου συσχετίζεται με τον καρκίνο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α) υποδεικνύοντας ότι αυτές οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές αντιπροσωπεύουν ένα σύστημα μοντέλο για την ανάλυση της λειτουργίας miR-23b στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν επίσης ένα υποθετικό ρόλο καταστολέα όγκων για miR-23b στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Α) Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR του miR-23b σε κυτταρικές σειρές και σε αντίστοιχα δείγματα μικροδιατομή ιστού με λέιζερ δεν σταματούν. Β) Ο πολλαπλασιασμός του J82 και τα κύτταρα Τ24 μετά την επιμόλυνση miR-23b ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με συν-miR. Γ) miR-23b υπερ-έκφραση αναστέλλει σημαντικά την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Η

microRNA-23β Ρυθμίζει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αποικιών Σχηματισμός

Για να προσδιοριστεί η λειτουργική σημασία της miR-23b πάνω έκφραση στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, εμείς επιμολυσμένα κύστης καρκινικές κυτταρικές σειρές J82 και Τ24 με τις πρόδρομες ουσίες miR-23b. Η έκτοπη έκφραση του miR-23β μειώθηκε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα που εκφράζουν συν-miR (Εικόνα 1Β). miR-23β επιμολυσμένα κύτταρα είχαν ικανότητα χαμηλό σχηματισμό αποικιών καθώς ο αριθμός των εστιών σε miR-23β κύτταρα που εκφράζουν μειώθηκε όταν συγκρίθηκε με συν-miR επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 1 C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του miR-23b στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

miR-23β Εναύσματα κυτταρικού κύκλου σύλληψης και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα κύστης Καρκίνος

ανάλυση

FACS (φθορισμο-ενεργοποιούμενο κυτταρικό διαχωρισμό) αποκάλυψε ότι επανέκφραση του miR-23b οδήγησε σε σημαντική αύξηση του αριθμού των κυττάρων στην φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου (59% έως 67%), ενώ ο πληθυσμός S-φάση μειώθηκε από 18% σε 9% το J82 κύτταρα (Σχήμα 2Α). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα Τ24 με την αύξηση του πληθυσμού G0 /G1 κύτταρο (70% έως 84%) και μείωση του πληθυσμού φάση S (15% έως 5%) (Σχήμα 2Β). Έτσι, γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-23b ενεργοποιεί G0 /G1 σύλληψη στην miR 23β-επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με συν-miR. FACS ανάλυση για απόπτωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας αννεξίνη-V-FITC-7-AAD χρωστική. Το ποσοστό της συνολικής αποπτωτικών κυττάρων (πρώιμων αποπτωτικών + αποπτωτικών) ήταν σημαντικά αυξημένη (4% έως 19%) σε απάντηση miR-23b υπερέκφραση σε σύγκριση με συν-miR με αντίστοιχη μείωση 14% στον πληθυσμό βιώσιμων κυττάρων σε κύτταρα J82 (Σχήμα 2C). Σε κύτταρα Τ24, μια αύξηση (4% έως 9%) σε αποπτωτικά κύτταρα παρατηρήθηκε με miR-23β υπερ-έκφραση σε σύγκριση με συν-miR (Σχήμα 2D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ένα ρόλο καταστολέα όγκων για miR-23b στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Α-Β) Αντιπροσωπευτική εικόνες της ανάλυσης FACS δείχνει miR-23β υπερ-έκφραση επάγει σύλληψη G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου σε J82 και τα κύτταρα Τ24 με μία αντίστοιχη μείωση σε κύτταρα S-φάσης. C-D) miR-23b υπερ-έκφραση επάγει απόπτωση σε J82 και Τ24 κύτταρα με ταυτόχρονη μείωση του αριθμού βιώσιμων κυττάρων. Τα δεδομένα φαίνεται από πειράματα εις τριπλούν ± SD.

Η

miR-23b Καταστέλλει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

Η υπερέκφραση του miR-23b είχαν αντι-μεταναστευτικών και αντι-επεμβατική αποτελέσματα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Λιγότερο απορρόφηση παρατηρήθηκε στα 560 nm με miR-23β επιμολυσμένα κύστη καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με συν-miR στη δοκιμασία μετανάστευσης (Σχήμα 3Α) και miR-23β υπερέκφραση επίσης μείωσε σημαντικά την ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων κύστης (Σχήμα 3Β).

Α) δοκιμασίες Μετανάστευσης της J82 και T24 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-23b. Β) Εκπρόσωπος εικόνες της δοκιμασίας μετανάστευσης. Γ) δοκιμασίες Εισβολή δείχνουν σημαντική μείωση στον αριθμό των εισβάλλοντας J82 και Τ24 κύτταρα επιμολυσμένα με miR-23b. Δ) Εκπρόσωπος εικόνες της ανάλυσης εισβολής.

Η

Oncogene Zeb1 αποτελεί άμεσο στόχο του miR-23b

Zeb1 έχει αναφερθεί ότι είναι ένα σημαντικό μόριο που οδηγεί την κινητικότητα των κυττάρων του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Χρησιμοποιώντας μια ηλεκτρονική βάση δεδομένων στόχο microRNA βρήκαμε ογκογονίδιο Zeb1 να είναι ένας πιθανός στόχος του miR-23b με ένα συμπληρωματικό θέση πρόσδεσης 3’ΙΙΤΡ για την ακολουθία των σπόρων του miR-23b (Εικόνα 4Α). Πραγματοποιήσαμε ανάλυση Western με miR-23b επιμολυσμένα κύτταρα και βρήκαν ότι miR-23β εξασθενημένη έκφραση της πρωτεΐνης Zeb1 σε σύγκριση με συν-miR στις δύο καρκινικών κυττάρων κύστης J82 και Τ24 (Σχήμα 4Β). Για να ελέγξετε αν μια άμεση αλληλεπίδραση εμπλέκεται μεταξύ miR-23b και στόχος ογκογονιδίου του Zeb1, πραγματοποιήσαμε αναλύσεις λουσιφεράσης δημοσιογράφος. Βρήκαμε ότι η συν-επιμόλυνση του miR-23b μαζί με τον άγριο τύπο 3’UTR του Zeb1 προκάλεσε σημαντική μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Σχήμα 4C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-23b στοχεύει άμεσα ογκογονίδιο Zeb1. Ακολουθίες στην Zeb1 3’ΙΙΤΡ δεσμευτική

Α) Δωρεάν miR-23b. Β) ανάλυση Western blot δείχνει ότι το miR-23b καταστέλλει τη μετάφραση της Zeb1 πρωτεΐνης σε J82 και Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα. αναλύσεις C) λουσιφεράσης δείχνουν μειωμένη δραστηριότητα δημοσιογράφος μετά από συν-διαμόλυνση είτε του άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο Zeb1-3’UTR με miR-23b σε J82 και Τ24 κύτταρα. Mut- Μεταλλαγμένα Zeb1 3’ΙΙΤΡ ακολουθία.

Η

Η εξάντληση των Zeb1 από παρέμβαση RNA μιμείται miR-23b Ανασύσταση σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης

πειράματα Phenocopy πραγματοποιήθηκαν επίσης από siRNA αναστολή των Zeb1 (Σχήμα 5). Εμείς επικυρωμένη δύο σειρές siRNA (Si-1 και Si-2) που είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική knockdown του Zeb1 σε επίπεδο πρωτεΐνης (Σχήμα 5Α) σε Τ24 καρκινικών κυττάρων κύστης και χρησιμοποιούνται ένα siRNA duplex για περαιτέρω πειράματα στα 50 ηΜ συγκέντρωση. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι siRNA αναστολή της Zeb1 προκάλεσε μειωμένη βιωσιμότητα κυττάρων (Σχήμα 5Β), τα μεταναστευτικά και επεμβατική ικανότητα (Σχήμα 5C-D) των καρκινικών κυττάρων Τ24. Παρατηρήσαμε επίσης ότι siRNA αναστολή της Zeb1 αυξήθηκε περίπου 7% της αποπτωτικής κλάσμα των κυττάρων σε Zeb1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με & lt? 1% σε μη ειδικό έλεγχο (Σχήμα 5Ε). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η εξάντληση του siRNA Zeb1 μιμείται την επίδραση του miR-23β υπερέκφραση στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Α) τα επίπεδα πρωτεΐνης Zeb1 σημαντικά εξασθενημένο με 50 ηΜ siRNA δίπολα (Si) σε σύγκριση με ένα μη σίγηση siRNA διπλής όψης (Con) σε κύτταρα Τ24. Β) Επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. C-D) Επίδραση σχετικά με τη μετανάστευση και την εισβολή του Τ24 καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα. δοκιμασία Ε) Η απόπτωση που δείχνει την επαγωγή απόπτωσης μετά Zeb1 νοκ ντάουν από siRNA στα κύτταρα Τ24. * P & lt?. 0.05

Η

Διαγνωστική και προγνωστική σημασία του miR-23b σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Για να καθοριστεί εάν η έκφραση του miR-23b μπορεί να διακρίνει μεταξύ των όγκων της ουροδόχου κύστης και των φυσιολογικών ιστών, και να προβλέψει τον ασθενή επιβίωση, πραγματοποιήσαμε ανάλυση ROC και ανάλυση Kaplan-Meier. Τα κλινικά δημογραφικά της κοόρτης του ασθενούς που συνοψίζονται στο Σχήμα 6Α. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (AUC) του 0.885 (Ρ & lt? 0,0001? 95% CI = 0,75 να 0.97) (Εικόνα 6Β) πρότεινε ότι η έκφραση miR-23b μπορεί να διακρίνει μεταξύ κακοηθών και μη κακοηθών ιστών και δυνητικά να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό δείκτης για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Για να προσδιορίσετε αν το miR-23b έχει οποιαδήποτε προγνωστική σημασία, χωρίσαμε ιστούς ασθενών σε χαμηλά επίπεδα (έκφραση Τ /Ν & lt? 1,2 φορές) και υψηλή (έκφραση Τ /N & gt? 1,2 φορές) Ομάδες miR-23b και πραγματοποιείται ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier. Kaplan-Meier ανάλυση έδειξε ότι η υψηλή miR-23b ομάδα είχαν σημαντικά υψηλότερη συνολική πιθανότητα επιβίωσης σε σύγκριση με την ομάδα χαμηλής miR-23b (Logrank Test p & lt? 0,03, Λόγος Κινδύνου (HR) = 4,3, 95% CI = 2-14) ( Σχήμα 6C). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το miR-23b είναι δυνητικά ένα διαγνωστικό και προγνωστικό δείκτη για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης και αν οι μελέτες για επιπλέον δείγματα που απαιτούνται για την ενίσχυση αυτών των αποτελεσμάτων.

Α) κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά της κοόρτης ασθενών. Β) ανάλυση καμπύλης ROC που δείχνει την ικανότητα της έκφρασης miR-23b σε διακρίσεις μεταξύ των δειγμάτων κακοήθη και μη κακοήθη ιστό. Ανάλυση C) κατά Kaplan-Meier για ολική επιβίωση με βάση την έκφραση του miR-23b.

Η

Συζήτηση

Τα microRNAs μπορεί να έχει επιπτώσεις μεγάλης κλίμακας με τη ρύθμιση της έκφρασης μιας ποικιλίας των γονιδίων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των θηλαστικών και καρκινογένεση. Ως αποτέλεσμα, η κατανόηση των μηχανισμών και λειτουργία των επιμέρους miRNAs δημιούργησε μεγάλο ενδιαφέρον. Παρά τη συσσώρευση αποδεικτικά στοιχεία σχετικά με το ρόλο των διαφόρων miRNAs στον καρκίνο, είναι πολύ περιορισμένες πληροφορίες είναι διαθέσιμες σχετικά με τη λειτουργία των miRNAs στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, και μόνο λίγοι στόχοι miRNA έχουν εντοπιστεί.

Εδώ αναφέρουμε ότι το miR-23b σε να ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με την κανονική παρακείμενους ιστούς και αυτό παρατηρήθηκε επίσης σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης και μη κακοήθεις κυτταρικές σειρές. Τα δεδομένα μας δείχνουν ένα πιθανό διαγνωστικό /προγνωστικό ρόλο για miR-23b στην πρόβλεψη συνολική επιβίωση και διάκριση malignant from φυσιολογικούς ιστούς και δείχνει ότι miR-23b ευρίσκεται ογκοκατασταλτική σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Για να προσδιοριστεί η βιολογική σημασία του miR -23b σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης, εκτελέσαμε λειτουργικές δοκιμασίες. Η έκτοπη έκφραση του miR-23b οδήγησε σε σημαντική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, σχηματισμό αποικιών, τη μετανάστευση /την εισβολή και την επαγωγή της διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Η έκφραση του miR-23b στον καρκίνο είναι κάπως αμφιλεγόμενη επειδή έχει βρεθεί να είναι είτε επάνω ρυθμισμένη και ογκογόνο σε καρκίνο του νεφρού, όπου προκάλεσε μεταφραστική καταστολή του γονιδίου καταστολής ΡΤΕΝ όγκου [13] ή προς τα κάτω ρυθμισμένα και ένας καταστολέας όγκων σε καρκίνο του προστάτη όπου στοχεύει άμεσα Src κινάση και Akt ογκογονίδια [14], ενώ η μελέτη μας δείχνει ότι είναι ένας καταστολέας όγκων σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η microRNAs είναι εξαιρετικά ειδικό ιστό και μπορούν να δρουν ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια [15], [16]. Τα microRNAs έχουν πολλά χαρακτηριστικά που τα καθιστούν ελκυστικά υποψήφιοι ως νέα προγνωστικούς βιοδείκτες και ισχυρά εργαλεία για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου [17]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το miR-23b ήταν προγνωστική της συνολικής επιβίωσης, έτσι ώστε οι ασθενείς με υψηλότερη έκφραση του miR-23b είχαν μεγαλύτερη συνολική επιβίωση συγκριτικά με τους ασθενείς με χαμηλή έκφραση του miR-23b. έκφραση microRNA-23β ήταν επίσης σε θέση να διακρίνουν τα κακοήθη από φυσιολογικούς ιστούς που δείχνει τη διαγνωστική σημασία του miR-23b στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, αν και οι συμπληρωματικές μελέτες με μεγαλύτερο ομάδα των δειγμάτων ιστού που απαιτείται.

Ένα σημαντικό εμπόδιο για την κατανόηση της λειτουργίας miRNA υπήρξε η σχετική έλλειψη πειραματικά επικυρωμένων στόχων. Για τον προσδιορισμό των τελεστών του miR-23b, αλγόριθμοι σε silico και λειτουργικές αναλύσεις εντοπίστηκαν Zeb1 ως στόχο της. Έχουμε αποδείξει ότι το miR-23b στοχεύει άμεσα την 3’UTR της Zeb1, ως υπερ-έκφραση του συνδέθηκε με την καταστολή της δραστηριότητας της λουσιφεράσης. Επιπλέον, μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω του επιπέδου της πρωτεΐνης Zeb1 παρατηρήθηκε μετά miR-23β υπερ-έκφραση, υποδεικνύοντας μετα-μεταγραφική ρύθμιση Zeb1 μέσω στόχευσης 3’UTR της. Λειτουργικοί προσδιορισμοί εκτελούνται μετά την εξάντληση Zeb1 με siRNA διαμόλυνση μιμήθηκε τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με miR-23β υπερέκφραση. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι επιπτώσεις των miR-23b στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι εν μέρει με την άμεση στόχευση Zeb1, αν και άλλοι στόχοι μπορούν επίσης να συμμετέχουν, δεδομένου microRNAs μπορεί να στοχεύσει χιλιάδες γονίδια. Zeb1 είναι ένα από τα κρίσιμα ρυθμιστές του επιθηλιακού-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [18] και έχει δειχθεί ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην εισβολή και τη μετάσταση των επιθηλιακών όγκων [19]. Η συνάφεια των πρωτεϊνών Zeb εξέλιξης του όγκου έχει μελετηθεί σε αρκετές ανθρώπινων καρκίνων. Έκφραση ZEB1 συσχετίζεται με μια επιθετική φαινότυπο σε διάφορους ιστολογικών τύπων καρκινώματος του ενδομητρίου και ανιχνεύθηκε στο σαρκωματώδεις διαμέρισμα του ενδομητρίου καρκινοσάρκωμα [20]. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, ZEB1 εκφράστηκε στο μεταναστευτικό μέτωπο των όγκων, σε συνδυασμό με την παροδική απώλεια βασικών μεμβρανών [21]. Η αμοιβαία έκφραση ZEB1 και Ε-καδερίνης έχει επίσης παρατηρηθεί σε καρκίνωμα μη-μικροκυττάρου πνεύμονα [22]. Μία άμεση συσχέτιση μεταξύ ZEB1 ανοσοαντιδραστικότητα και βαθμό Gleason έχει αναφερθεί σε ανθρώπινους όγκους του προστάτη [23], και καρκίνου της ουροδόχου κύστης, ZEB1 έχει αναφερθεί ότι υπερ-εκφράζεται και υπεύθυνη για την ενισχυμένη κινητικότητα [18]. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η υπερ-έκφραση του miR-23b οδήγησε σε καταστολή της ογκογονιδίου Zeb1 στα καρκινικά κύτταρα κύστης υποδεικνύοντας ότι miR-23b μπορούν να μεσολαβήσουν EMT, που αντιπροσωπεύει έτσι ένα πιθανό μηχανισμό μέσω του οποίου επηρεάζει τη μετανάστευση καρκίνο της ουροδόχου κύστης και εισβολή.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι το miR-23b έχει διαγνωστική /προγνωστική σημασία και άμεσα στοχεύει ογκογόνο Zeb1 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. miR-23β υπερέκφραση οδήγησε σε καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης και εισβολή, επαγωγή απόπτωσης, και διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Τέλος, η μελέτη αυτή δείχνει ότι το miR-23b υπερ-έκφραση μπορεί να είναι θεραπευτικά χρήσιμη στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε τον Δρ Ρότζερ Erickson για την υποστήριξη και τη βοήθειά του με η προετοιμασία του χειρογράφου.