Αφηρημένο

Συγκρίναμε την ανάπτυξη των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε ένα

ex vivo

τρισδιάστατη (3D) μοντέλο του πνεύμονα και του πολιτισμού 2D να καθοριστεί ποια καλύτερη ανάπτυξη του καρκίνου μιμείται πνεύμονα σε ασθενείς. κύτταρα Α549 αναπτύχθηκαν σε ένα

ex vivo

μοντέλο των πνευμόνων 3D και 2D στον πολιτισμό για 15 ημέρες. Μετρήσαμε το μέγεθος και το σχηματισμό οζιδίων όγκου μετρήθηκαν και τα κύτταρα μετά από 15 ημέρες. Μπορούμε επίσης χρωματίστηκαν ιστών /κυττάρων για Ki-67, και Caspase-3. Μετρήσαμε μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) επίπεδα στο ρυθμισμένο μέσο και στο πλάσμα του αίματος από ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Οργανωμένη οζίδια όγκου με άθικτο αγγειακό χώρο που σχηματίζεται στο

ex vivo

μοντέλο των πνευμόνων 3D αλλά όχι σε 2D πολιτισμό. Πολλαπλασιασμό και την απόπτωση ήταν μεγαλύτερη στο

ex vivo

μοντέλο των πνευμόνων 3D σε σχέση με τον πολιτισμό 2D. Μετά από 15 ημέρες, υπήρχαν σημαντικά περισσότερα κύτταρα στην καλλιέργεια 2D από το 3D μοντέλο. ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-10 ήταν σημαντικά μεγαλύτερες στην

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D. Δεν υπήρχε παραγωγή της MMP-9 στην καλλιέργεια 2D. Τα δείγματα ασθενών περιείχαν ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-10. Τα ανθρώπινα πνεύμονα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσονται σε

ex vivo

μοντέλο 3D μορφή μπορεί να κάνει διάχυση οζίδια που μεγαλώνουν την πάροδο του χρόνου. Παρήγαγε επίσης MMPs που δεν έχουν παραχθεί σε 2D πολιτισμό αλλά παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Η

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα μπορεί να μιμηθεί πιο στενά τη βιολογία της ανάπτυξης του ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα από τον πολιτισμό 2D

Παράθεση:. Mishra DK, Sakamoto JH, σκλάβο MJ, Baird ΒΝ, Blackmon SH , Ferrari M, et al. (2012) Ανθρώπινο Καρκίνο του Πνεύμονα κύτταρα που αναπτύσσονται σε ένα

Ex Vivo

3D πνεύμονα Μοντέλο Δημιουργήστε Matrix μεταλλοπρωτεϊνάσες που δεν παράγονται σε 2D Πολιτισμού. PLoS ONE 7 (9): e45308. doi: 10.1371 /journal.pone.0045308

Επιμέλεια: Έφη Γ Τσιλιμπάρη, Εθνικό Κέντρο Επιστημονικής Έρευνας Δημόκριτος, Ελλάδα |

Ελήφθη: 8, Μαΐου του 2012? Αποδεκτές: 20, Αυγ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Σεπ, 2012

Copyright: © Mishra et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις. MPK έχει υποβάλει αίτηση για δίπλωμα ευρεσιτεχνίας για την ex vivo μοντέλο των πνευμόνων 3D. Το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας έχει τίτλο «νεοπλασματικά κύτταρα αναπτύσσονται σε αποκυτταριωμένο βιομήτρας». Καλύπτει δημιουργία απο-κυτταρωμένο στρώμα και αυξανόμενη νεοπλασματικά κύτταρα για την απο-κυτταρωμένο στρώμα σε ένα βιοαντιδραστήρα. Καλύπτει επίσης τη δυνατότητα εφαρμογής του μοντέλου. Δεν υπάρχει καμία σχέση της εταιρείας για το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας και οι συγγραφείς δεν έχουν λάβει κανένα εισόδημα από το δίπλωμα ευρεσιτεχνίας. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

καρκίνου

πνεύμονα είναι η πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο που σχετίζονται με τις Ηνωμένες Πολιτείες [ ,,,0],1]. Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει αποτελεσματική θεραπεία για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, και το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών δεν έχει αυξηθεί σημαντικά από το 1975, 13% το 1975 και μόνο το 16% το 2005 [1]. Η έλλειψη προόδου στην αναζήτηση αποτελεσματικών θεραπειών για τον καρκίνο του πνεύμονα μπορεί να οφείλεται, εν μέρει, στην έλλειψη μιας ακριβούς μοντέλου που μιμείται τις βιολογικές διαδικασίες που συμβαίνουν σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Δύο-διαστάσεων καλλιέργειες (2D) τρυβλίο Petri κύτταρο παρείχαν μεγάλη εικόνα για την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να αυξάνεται, αλλά δεν παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τις πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και του περιβάλλοντος τους. Ζωικά μοντέλα παρέχουν οριστική δοκιμές για συγκεκριμένες διαδικασίες, αλλά υπάρχει συχνά η έλλειψη συσχέτισης μεταξύ της αναμενόμενης και τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν, η οποία μπορεί να οφείλεται σε μοντέλα ίδιοι [2]. Επιπλέον, η ανθρώπινη ανάπτυξη του όγκου και η απόκριση στη θεραπεία με φάρμακα σε ζωικά μοντέλα δεν συσχετίζονται πάντα με τα ευρήματα της ανθρώπινης δοκιμών [3] – [5]. Επιπλέον, ζωικά μοντέλα χρειαστούν αρκετές εβδομάδες για να παρέχουν στοιχεία σχετικά με τις βιολογικές διαδικασίες. Ως αποτέλεσμα,

in vitro έχουν

3D μοντέλα έχουν αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια ως μια προσπάθεια να καλύψει το κενό μεταξύ των παραδοσιακών πολιτισμών 2D και ζωικά μοντέλα.

Υπάρχουν δύο κύριοι τύποι

in vitro

3D μοντέλα. Ο πρώτος τύπος παίρνει τα

in vivo

ιστούς των τόκων και των μοσχευμάτων και των πολιτισμών τους

in vitro

, το οποίο παρέχει πληροφορίες σχετικά με τη βραχυπρόθεσμη ανάπτυξη των ιστών [6], [7]. Ο άλλος τύπος αναπτύσσεται καρκινικών κυττάρων σε ένα 3D ικρίωμα τεχνητή μήτρα. Αυτή η

in vitro

3D μοντέλο χρησιμοποιώντας Matrigel έχει δειχθεί ότι είναι ανώτερη από 2D καλλιέργεια χρησιμοποιώντας ένα τρυβλίο Petri για την μελέτη της ανάπτυξης του όγκου [8] – [10]. Οι φυσιολογικές αλλαγές στα καρκινικά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Matrigel είναι σημαντικά διαφορετικές από εκείνες των όγκων που αναπτύσσονται σε 2D καλλιέργεια. Υπάρχουν περιορισμοί, ωστόσο, με την τρέχουσα

in vitro

3D μοντέλα. Αν και παρέχουν ένα υπόστρωμα για τους όγκους να αναπτύσσονται σε, το υπόστρωμα είναι ένα τεχνητό προϊόν που δεν συναντάται από αυτά τα κύτταρα σε ένα φυσικό περιβάλλον. Επιπλέον, αυτά

in vitro

μοντέλα 3D στερούνται την παρουσία του αγγειακού συστήματος, η οποία εμποδίζει την ικανότητά τους να μιμούνται την

in vivo

περιβάλλοντος και τη διατήρηση της δυναμικής συμπεριφοράς των κυττάρων [5].

εδώ, θα χαρακτηρίζεται ένα

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα που έχει αποδειχθεί ότι παράγουν αυξανόμενο να κάνει διάχυση οζίδια του πνεύμονα [11]. Σε αντίθεση με το

in vitro

μοντέλα 3D, μας

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα χρησιμοποιεί ένα φυσικό μήτρα, η οποία διατηρεί ομολογία της μεταξύ των ειδών [12], και η απο-κυτταρωμένο στρώμα σχηματίζει ένα φράγμα μεταξύ του ενδοθηλιακού και επιθηλιακά χώρους [13]. Έτσι, το ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές είναι σε θέση να σχηματίσουν οζίδια πνεύμονα σε αυτό το

ex vivo

μοντέλο με ανέπαφη αγγείωση [11], το οποίο ξεπερνά τους περιορισμούς με το

in vitro

3D μοντέλα. Επιπλέον, η

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα επιτρέπει στα κύτταρα να αυξηθεί με την πάροδο του χρόνου, η οποία μπορεί να αποδείξει μια δυναμική κατάσταση που δεν έχει δει το

in vitro

3D μοντέλα. Συγκρίναμε την ανάπτυξη των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα σε αυτό το

ex vivo

3D μοντέλο με ότι σε μια 2D καλλιέργεια υπό τις ίδιες συνθήκες καλλιέργειας για 15 ημέρες. Βρήκαμε σημαντικές διαφορές στο σχηματισμό οζιδίων όγκου, συνολικό αριθμό κυττάρων, τα ποσοστά πολλαπλασιασμού, τα ποσοστά κυτταρικού θανάτου, και μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) παραγωγής. Επιπλέον, τα ανθρώπινα πνεύμονα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσονται στο

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα που παράγονται MMPs που βρίσκονται σε ανθρώπινα δείγματα, ενώ τα κύτταρα από 2D καλλιέργεια δεν το έκανε.

Αποτελέσματα

Κυτταρική ανάπτυξη και οζιδίου Σχηματισμός

ο

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα, 96.3 ± 3.9% των κυττάρων Α549 προσκολλημένο στο απο-κυτταρωμένο στρώμα πνεύμονα μετά από 3 περάσματα και επώαση για 2 ώρες. Τα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 καλλιεργείται στις αποκυτταριωμένο μήτρες πνεύμονα από την 4-εβδομάδων (3D -4 Wk) και 6-εβδομάδων (3D -6 Wk) αρουραίοι που σχηματίζεται οζίδια όγκων που αυξήθηκε κατά την περίοδο των 15 ημερών. Καθ ‘όλη τη διάρκεια της περιόδου των 15 ημερών, ήμασταν σε θέση να διαχυθεί το μοντέλο 3D με τα μέσα ενημέρωσης σε 6 cc ανά λεπτό. Η κατανομή των οζιδίων επί της μήτρας ήταν τυχαία, αλλά η χρονική στιγμή της ανάπτυξης τους ήταν ως επί το πλείστον ομοιόμορφη, με λίγες οζίδια που σχηματίζουν μετά την ημέρα 6 για πνεύμονα μήτρες από 4 εβδομάδων αρουραίους και ημέρα 2 για matricies πνεύμονα από 6 εβδομάδων αρουραίους. Σημαντικά μεγαλύτερες οζίδια ανιχνεύθηκαν επί των καρκινικών κυττάρων Α549 πνεύμονα καλλιεργείται στις αποκυτταριωμένο μήτρες των πνευμόνων από τα 6 εβδομάδων αρουραίους σε σύγκριση με εκείνες από τις 4 εβδομάδων αρουραίοι (ρ = 0,03, Εικ. 1 a). Ωστόσο, τα οζίδια στις αποκυτταριωμένο μήτρες επίμυος από τα 4 εβδομάδων αρουραίους ήταν πυκνότερη (Σχ. 1β) από τα οζίδια στις αποκυτταριωμένο μήτρες επίμυος από τα 6 εβδομάδων αρουραίους (Σχ. 1 d). Υπολογίσαμε την πυκνότητα των οζιδίων αναπτύχθηκαν σε αποκυτταριωμένο μήτρες πνευμόνων από τις 4 εβδομάδων αρουραίους και 6-εβδομάδων αρουραίους με τη διαίρεση του αριθμού των κυττάρων κατά την ημέρα 15 διαιρείται με το συνολικό μέγεθος οζίδιο την ημέρα 15. Η πυκνότητα του τα οζίδια αναπτύσσονται επί του απο-κυτταρωμένο στρώμα πνεύμονα από τις 4 εβδομάδων αρουραίους (3,24 ± 0,24 εκατομμύρια κύτταρα /cm

2) ήταν σημαντικά υψηλότερο από την πυκνότητα των οζιδίων αναπτύσσονται επί της απο-κυτταρωμένο στρώμα πνεύμονα από την 6-εβδομάδα- παλιά αρουραίους (1,12 ± 0,20 εκατομμύρια κύτταρα /cm

2, p = 0.02). Η υψηλότερη πυκνότητα ήταν επίσης εμφανής από την Η &? Ε χρώση του ικριώματος. Η H & amp? Λεκέ Ε της όζος του πνεύμονα από τις 4 εβδομάδων αρουραίους έδειξαν το μεγαλύτερο μέρος της περιοχής καλύπτεται από μεγάλο αριθμό κυττάρων με ελάχιστη έκταση ενιαίου στρώματα του όγκου (Σχήμα 1γ.), Ενώ το οζίδιο του πνεύμονα από το 6-εβδομάδα- παλιό αρουραίοι έδειξαν μεγάλες περιοχές με μονά στρώματα κυττάρων όγκου (Εικ. 1ε). Επιπλέον, δεν υπάρχει ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων στο αγγειακό χώρο τόσο για Η &?. Ε με καρκινικά κύτταρα αυξάνονται γύρω από αυτό, χωρίς να παρεμποδίζεται το

(α) Τα οζίδια όγκου αυξήθηκε σε μέγεθος την πάροδο του χρόνου. Σημαντικά μεγαλύτερες οζίδια σχηματίζονται στο απο-κυτταρωμένο στρώμα πνεύμονα από 6 εβδομάδων αρουραίους (3D – 6 Wk, η = 2) σε σύγκριση με 4 εβδομάδων αρουραίους (3D – 4 Wk, η = 2, p = 0.03). Τα οζίδια όγκου ήταν πυκνότερη στις 4 εβδομάδων αρουραίους (β) σε σχέση με τις 6-εβδομάδων αρουραίους (δ). Η H & amp? E λεκέ (4Χ) του όζου των πνευμόνων από τις 4 εβδομάδων αρουραίους έδειξαν το μεγαλύτερο μέρος της περιοχής καλύπτεται από μεγάλο αριθμό των κυττάρων με ελάχιστη έκταση ενιαίου στρώματα του όγκου (γ) ενώ το οζίδιο του πνεύμονα από το 6- εβδομάδων αρουραίοι έδειξαν μεγάλες περιοχές με μονά στρώματα κυττάρων όγκου (ε). μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

Στην κουλτούρα 2D, τα κύτταρα Α549 έγινε συρροή την ημέρα 5. Κατά την περίοδο των 15 ημερών, δεν υπήρχαν σχηματισμούς οζίδιο.

Δομή και κυττάρων

H & amp? E ανάλυση του μπλοκ των κυττάρων γίνεται από 2D πολιτισμό δεν έδειξε καμία οργάνωση (σχήμα, 2α), ενώ υπήρχε κυττάρου-κυττάρου και την οργάνωση των κυττάρων-μήτρας στο

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα, με ανέπαφη αγγείωση (Σχ. 2β). Στο

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα, ο αριθμός των κυττάρων Α549 αναπτύχθηκαν σε δύο διαφορετικού μεγέθους ικριώματα μετά από 15 ημέρες δεν διέφερε σημαντικά: 32 ± 3 εκατομμύρια κύτταρα από την 4-εβδομάδων αρουραίου σε σύγκριση με 27 ± 5 εκατομμύρια κύτταρα από το 6 εβδομάδων αρουραίου (ρ = 0.45, Σχ. 2c). Ωστόσο, ο μέσος αριθμός των κυττάρων μετά από 15 ημέρες στην καλλιέργεια 2D (471 ± 70 εκατομμύρια) ήταν περίπου 16 φορές υψηλότερη από τον μέσο αριθμό κυττάρων από την

ex vivo

3D μοντέλο (29 ± 3 εκατομμύρια? p = 0.0007, σχήμα 2γ)

Εκπρόσωπος αιματοξυλίνη και ηωσίνη (η & amp?.. Ε) χρώση των κυττάρων από το (α) καλλιέργεια 2D και (β) το

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα . Η Η &? Ε του

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα δείχνει κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-μήτρας. (Γ) Υπήρχαν σημαντικά περισσότερα κύτταρα στην καλλιέργεια 2D (471 ± 70 εκατομμύρια, η = 3) σε σχέση με το

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D (29 ± 3 εκατομμύρια, η = 4, ρ = 0.0007) . Ο συνολικός αριθμός των κυττάρων εις την 4-εβδομάδων (32 ± 3 εκατομμύρια, η = 2) και 6-εβδομάδων (27 ± 5 εκατομμύρια, η = 2) μήτρες αρουραίου δεν διέφερε (p = 0.45). μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

Διάδοση και θάνατο των κυττάρων

Τα Α549 κύτταρα που αναπτύσσονται στην καλλιέργεια 2D (Εικ. 3α) και

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα (Εικ. 3b) χρωματίστηκαν θετικά για Ki-67. Το ποσοστό των κυττάρων με χρώση Ki-67 ήταν πολύ υψηλότερο στο

ex vivo

3D μοντέλο (23,8 ± 2,9%) σε σχέση με τον πολιτισμό 2D (6,7 ± 0,9%, p & lt? 0,0001). Υπήρχαν πολύ λίγα κύτταρα στην καλλιέργεια 2D (Εικ. 4α) που βάφτηκαν θετικά για κασπάση-3, ενώ υπήρχαν πολλά κύτταρα του

ex vivo

3D μοντέλο που χρωματίζονται θετικά για Caspase-3 (Σχ. 4β ). Ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των κυττάρων στο

ex vivo

3D μοντέλο (5.5 ± 0.8%) χρωματίστηκαν θετικά για κασπάση-3 σε σύγκριση με την καλλιέργεια 2D (0.1 ± 0.1%? Ρ & lt?. 0,0001, Σχήμα 4γ).

Εκπρόσωπος Ki-67 χρώση των κυττάρων Α549 καλλιεργούνται σε (α) καλλιέργεια 2D και (β) το

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα. (Γ) Υπήρξε σημαντικά περισσότερο Ki-67 χρώση στο

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D (23,8 ± 2,9%, η = 4) σε σύγκριση με την καλλιέργεια 2D (6.7 ± 0.9%, η = 3, ρ & lt ? 0,0001). μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

Εκπρόσωπος της κασπάσης-3 χρώση των κυττάρων Α549 καλλιεργούνται σε (α) καλλιέργεια 2D και (β) το

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα. (Γ) Υπήρξε σημαντικά περισσότερο Caspase-3 κηλίδωση στο

ex vivo

3D μοντέλο (5.5 ± 0.8%, η = 4) σε σχέση με την καλλιέργεια 2D (0.1 ± 0.1%, η = 3, ρ & lt? 0.0001). μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

MMPs mRNA επίπεδο στα μοντέλα

Υπήρχε σημαντικά υψηλότερη έκφραση της ΜΜΡ-1 (p = 0.003) και ΜΜΡ-2 (p = 0.01) στα κύτταρα Α540 καλλιεργούνται στο 3D -4 Wk σε σύγκριση με το 3D -6 Wk στο mRNA που λαμβάνεται από την ημέρα 15 (Σχήμα 5Α & amp?. 5β). Ένα σημαντικά υψηλότερη έκφραση του ΜΜΡ-1 παραγωγή τόσο 3D -4 Wk (ρ & lt? 0,0001) και 3D -6 Wk (p = 0.0002) παρατηρήθηκε σε σύγκριση με το επίπεδο του mRNA σε 2D. Αυτό παρατηρήθηκε επίσης με ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-10 έκφραση (Εικ 5c & amp?. 5d). Για ΜΜΡ-2, υπήρχε σημαντικά υψηλότερη έκφραση στα κύτταρα Α549 καλλιεργούνται στο 3D -4 Wk (p = 0,006) σε σύγκριση με το επίπεδο σε 2D, αλλά ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα κύτταρα Α549 καλλιεργούνται στο 3D -6 Wk (p = 0,001) σε σύγκριση με το επίπεδο σε 2D (Σχ. 5D).

Υπήρχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα της ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-10 στα κύτταρα Α549 στο

ex vivo

3D μοντέλα σε σχέση με τον πολιτισμό 2D. Υπήρξε σημαντική υψηλότερο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης ΜΜΡ-2 σε 3D -4 Wk σε σύγκριση με την καλλιέργεια 2D Ωστόσο, υπήρχε σημαντικά χαμηλότερο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης ΜΜΡ-2 σε 3D -6 Wk σε σύγκριση με την καλλιέργεια 2D. μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

MMPs επίπεδο πρωτεΐνης στα μοντέλα

ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και MMP-10 ανιχνεύτηκαν στο μέσα κυττάρων Α549 καλλιεργούνται στο

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D, ενώ μόνο ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-10 ανιχνεύθηκαν στο μέσο των κυττάρων Α549 αναπτύσσονται στην καλλιέργεια 2D. ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-10 δεν ανιχνεύθηκαν στα μέσα του

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D χωρίς κύτταρα Α549. Δεδομένου ότι υπάρχει σημαντική διαφορά στον αριθμό των κυττάρων μεταξύ του 2D καλλιέργεια και το

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα κατά την ημέρα 15, υπολογίσαμε το επίπεδο πρωτεΐνης ΜΜΡ ανά κύτταρο. Βρήκαμε υπήρχε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα της ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ -9 και MMP-10 ανά κύτταρο στο 3D -4 Wk και 3D -6 Wk σε σύγκριση με την καλλιέργεια 2D (Εικ. 6).

(α) Υπήρξε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο από ΜΜΡ-1, (β) ΜΜΡ-2, (γ) ΜΜΡ-9, και (δ) ΜΜΡ-10 ανά κύτταρο στο

ex vivo

3D μοντέλα σε σύγκριση με την καλλιέργεια 2D ανά κύτταρο. μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

Στη συνέχεια, θα αξιολογηθεί το επίπεδο ΜΜΡ σε διαφορετικές ημέρες στα μέσα μαζικής ενημέρωσης του 2D σε σύγκριση με το 3D -4 Wk και το 3D -6 Wk. Τα επίπεδα ΜΜΡ στο

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D αυξήθηκε κατά τη διάρκεια των πρώτων 6 ημέρες του πειράματος. Αν και υπήρχαν περισσότερα κύτταρα στην καλλιέργεια 2D, υπήρχαν σημαντικά υψηλότερες ποσότητες ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-10 στο

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D σε σύγκριση με το πρότυπο 2D για όλες τις ημέρες εκτός για ΜΜΡ-1 και τα επίπεδα ΜΜΡ-10 την ημέρα 3 για 3D -4 Wk οποίο ήταν παρόμοιο με το μοντέλο 2D. Δεν υπήρχε συνεπής σχέση μεταξύ των επιπέδων ΜΜΡ-2 στο μοντέλο 2D και 3D μοντέλων -4 Wk και 3D -6 Wk για διαφορετικές ημέρες (Εικ. 7).

(α) Υπήρξε μια σημαντικά υψηλότερη επίπεδο του ΜΜΡ-1 παραγωγή στην

ex vivo

3D πνεύμονα μοντέλα σε σύγκριση με την καλλιέργεια 2D εκτός για 3D -4 Wk ημέρα ΜΜΡ-1 επίπεδο 3, η οποία ήταν παρόμοια με επίπεδο 2D την ημέρα 3. (β) υπάρχει δεν ήταν σταθερή τάση μεταξύ των

ex μοντέλα πνεύμονα vivo

3D και 2D του πολιτισμού για τα επίπεδα της ΜΜΡ-2 μεταξύ των διαφορετικών ημέρες. (Γ) Δεν υπήρχε παραγωγή της MMP-9 σε 2D πολιτισμό και σημαντικά υψηλότερη παραγωγή της MMP-9 στο

ex vivo

μοντέλο των πνευμόνων 3D. (Δ) Υπήρξε σημαντικά περισσότερο ΜΜΡ-10 που παράγεται στο

ex vivo μοντέλα πνεύμονα

3D σε σύγκριση με την καλλιέργεια 2D εκτός για 3D -4 Wk ημέρα 3 ΜΜΡ-10 επίπεδο το οποίο ήταν παρόμοιο με το επίπεδο την ημέρα 3 για 2D πολιτισμό. μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύει το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.

Η

MMPs σε ασθενείς

ανέλυσαν δείγματα από τέσσερις ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Κανένας από τους ασθενείς δεν είχε προεγχειρητική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Το μέσο μέγεθος όγκου ήταν 2,6 ± 1,1 cm, και κανένας από τους ασθενείς είχαν εμπλοκή των λεμφαδένων. ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-10 ανιχνεύθηκαν στο άνω κοίλης φλέβας και πνευμονικές φλέβες των δειγμάτων λοβεκτομή και από τις τέσσερις ασθενείς. Υπήρχε ένα μέσο όρο 11,8 ± 22,3 ng /mL της ΜΜΡ-1, 40,4 ± 23,2 ng /mL του ΜΜΡ-2, 41,6 ± 27,6 ng /mL της ΜΜΡ-9 και 100,4 ± 128,5 pg /mL της ΜΜΡ-10 στο πλάσματος του αίματος από την ανώτερη κοίλη φλέβα. Υπήρχε ένα μέσο όρο 7,8 ± 13,8 ng /mL της ΜΜΡ-1, 37,8 ± 19,9 ng /mL του ΜΜΡ-2, 134,5 ± 83,3 ng /mL του ΜΜΡ-9, και 105 ± 90,9 pg /mL της ΜΜΡ-10 σε το πλάσμα του αίματος που λαμβάνεται από τις πνευμονικές φλέβες των δειγμάτων λοβεκτομή. Δεδομένου ότι υπήρχε μεγάλη διακύμανση μεταξύ των ασθενών για το επίπεδο των MMPs, εμείς κανονικοποιηθεί η τιμή στο επίπεδο που διαπιστώθηκε στην ανώτερη κοίλη φλέβα για κάθε ασθενή. Στη συνέχεια συγκρίναμε τις τιμές μεταξύ των ασθενών. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-10 επίπεδα, όμως, υπήρξε σημαντικά υψηλότερο επίπεδο ΜΜΡ-9 στην πνευμονική φλέβα σε σύγκριση με την ανώτερη κοίλη φλέβα (ρ = 0,02, Εικ. 8). επίπεδα

ΜΜΡ κανονικοποιούνται στο επίπεδο που βρίσκονται στο άνω κοίλης φλέβας (SVC). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στα επίπεδα ΜΜΡ μεταξύ της ΜΚΕ και της πνευμονικής φλέβας για ΜΜΡ-1 (p = 0.03), ΜΜΡ-2 (ρ = 0.9) και ΜΜΡ-10 (ρ = 0,6). Υπήρξε σημαντική αύξηση των-ΜΜΡ 9 επίπεδα στην πνευμονική φλέβα σε σύγκριση με το SVC (p = 0.02).

Η

Συζήτηση

Τα κύτταρα Α549 καλλιεργούνται στο

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα ήταν περισσότερο παρόμοια με τα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα αυξάνεται σε ασθενείς από ό, τι τα κύτταρα Α549 αναπτύσσονται σε 2D καλλιέργεια. Όπως δείξαμε προηγουμένως [11], τα κύτταρα Α549 καλλιεργούνται στους

που σχηματίζεται οζίδια ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα, αλλά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια 2D δεν το έκανε. Το σήμα κατατεθέν του καρκίνου του πνεύμονα είναι ο σχηματισμός ενός όζου του πνεύμονα που μπορεί να ανιχνευθεί κλινικά με απεικόνισης όπως μια ακτινογραφία θώρακος ή αξονική τομογραφία [14]. Αυτοί οι καρκίνοι του πνεύμονα αυξηθεί με την πάροδο του χρόνου και μεταστάσεις σε λεμφαδένες και άλλα όργανα. Η

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα έδειξε όζος σχηματισμό και την ανάπτυξη την πάροδο του χρόνου, αλλά ο πολιτισμός 2D δεν το έκανε. Επιπλέον, μεγαλύτερα οζίδια ανιχνεύθηκαν όταν ένα μεγαλύτερο απο-κυτταρωμένο στρώμα πνεύμονα χρησιμοποιήθηκε στο πείραμα. Ο πιθανός λόγος για αυτή τη διαφορά είναι ότι το μέγεθος του οζιδίου περιορίζεται από το εμβαδόν της επιφάνειας του απο-κυτταρωμένο στρώμα του πνεύμονα. Περαιτέρω, τα κύτταρα Α549 που σχηματίζονται πυκνότερο οζίδια στο μικρότερο μήτρα πνεύμονα από ό, τι στη μεγαλύτερη μήτρα πνεύμονα και του συνολικού αριθμού των κυττάρων μετά από 15 ημέρες ανάπτυξης η

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα δεν διέφερε μεταξύ των δύο μεγέθη decellularlized μήτρας του πνεύμονα. Αυτό υποδηλώνει ότι οι μεγαλύτερες και λιγότερο πυκνά οζίδια καλλιεργείται στις αποκυτταριωμένο μήτρες των πνευμόνων από τα 6 εβδομάδων αρουραίοι είχαν παρόμοιο αριθμό κυττάρων καθώς τα μικρότερα και πιο πυκνά οζίδια αναπτύσσονται επί των μητρών από τις 4 εβδομάδων αρουραίους. Ανεξάρτητα από το μέγεθος της απο-κυτταρωμένο στρώμα πνεύμονα που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα, υπήρχε σχηματισμός οζιδίων όγκου και τα οζίδια μεγάλωσε την πάροδο του χρόνου.

Υπήρξε σημαντικά πιο αναδιαμόρφωση του όγκου των κυττάρων Α549 καλλιεργούνται στο

ex vivo μοντέλο πνεύμονα

3D σε σχέση με αυτά που καλλιεργούνται στην κουλτούρα 2D. Μετά από 15 μέρες, ένας πολύ μεγαλύτερος αριθμός των κυττάρων που βρέθηκε στην καλλιέργεια 2D σε σχέση με το

ex vivo

μοντέλο των πνευμόνων 3D. Η ανάπτυξη των κυττάρων στην καλλιέργεια 2D περιορίστηκε από το διάστημα, ενώ η ανάπτυξη των κυττάρων στο

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα φαίνεται να έχουν περιοριστεί από παράγοντες εκτός από το διάστημα, δεδομένου ότι χρησιμοποιούν ένα μεγαλύτερο αποκυτταριωμένο πνεύμονα μήτρα δεν αύξησε τον συνολικό αριθμό των κυττάρων στο τέλος του πειράματος. Στο

ex vivo

μοντέλο των πνευμόνων 3D, τα καρκινικά κύτταρα σχηματίζονται οζίδια σε ορισμένα μέρη στη μήτρα, και μόλις τα οζίδια σχηματίζονται, αυξήθηκαν σε μέγεθος, με μερικά πρόσθετα οζίδια που σχηματίζουν κατά τη διάρκεια της περιόδου των 15 ημερών. Αυτό υποδηλώνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε περιοχές της ευνοϊκής ανάπτυξης και κυτταρικού θανάτου σε τομείς δυσμενής ανάπτυξης. Αυτό αποδεικνύεται από την ανάλυση του Ki-67, το οποίο είναι ένας δείκτης του πολλαπλασιασμού, και κασπάση-3, το οποίο είναι ένας δείκτης του κυτταρικού θανάτου. Υπήρχε ένα σημαντικά υψηλότερο ποσό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου στο

ex vivo

μοντέλο των πνευμόνων 3D σε σχέση με τον πολιτισμό 2D. Αυτό συνέβη αναδιαμόρφωση στα πλαίσια των κυττάρων του όγκου που οργανώνονται με κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-μήτρας που έχουν δει μόνο σε ένα

in vivo

ρύθμιση [11].

Οι παράγοντες που μπορεί να συμβάλλουν στη διαμόρφωση ευνοϊκών συνθηκών για την ανάπτυξη οζιδίων όγκου περιλαμβάνουν τα θρεπτικά συστατικά από τα μέσα μαζικής ενημέρωσης και τις τσέπες των υποξία που δημιουργήθηκε από το μοντέλο [15]. Τα καρκινικά κύτταρα είναι πιθανό να σχηματίζουν οζίδια σε περιοχές που είναι πλούσια σε θρεπτικά συστατικά, τα οποία μπορεί να επιτρέψει τα κύτταρα να αναπτυχθούν καλύτερα από ό, τι σε περιοχές με χαμηλή αιμάτωση? Έτσι, τα κύτταρα στα πλούσια σε θρεπτικά συστατικά περιοχές πιο κοντά στα αιμοφόρα αγγεία ενδέχεται να έχουν μεγαλύτερο πολλαπλασιασμό από εκείνες σε περιοχές με λιγότερο αιμάτωσης. Η ικανότητα του

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα να μιμηθούν αυτή την κατάσταση είναι το καλύτερο μοντέλο του

in vivo

περιβάλλον από την καλλιέργεια 2D κάνει.

Επιπλέον, η

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα μπορεί να μιμηθεί το

in vivo

περιβάλλον καλύτερα από ό, τι

in vitro

3D μοντέλα (όπως η αυξανόμενη καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα σε Matrigel) επειδή διατηρεί μια αγγειακή χώρου, έχει τη φυσική αρχιτεκτονική ενός μπορεί να κάνει διάχυση οργάνου, και το σημαντικότερο, η σύνθεση της μήτρας διατηρείται μεταξύ των ειδών [12]. Τα δύο χαρακτηριστικά είναι η πιο σημαντική πτυχή του

ex vivo

3D μοντέλο. Το ακέραιο αγγειακό χώρο είναι αποτέλεσμα της ανάπτυξης των κυττάρων όγκου στο ακυτταρικό μήτρα. Καθώς η μήτρα ακυτταρικού δημιουργείται μέσω της διαδικασίας απο-κυττάρωση, όπου η βασική μεμβράνη διατηρείται και διατηρεί την ακεραιότητα του αγγειακού χώρου και επιθηλιακών χώρο. Η διαδικασία απο-κυττάρωση απομακρύνει τα ενδοθηλιακά κύτταρα από το χώρο αγγειακών και επιθηλιακά και μεσεγχυματικά κύτταρα από το επιθηλιακό χώρο. Τα καρκινικά κύτταρα τοποθετούνται στο επιθηλιακό χώρο, μέσω της τραχείας και ο μέσο αντλείται μέσω του αγγειακού χώρου. Καθώς ο όγκος μεγαλώνει και σχηματίζει οζίδια, διατηρεί το αγγειακό χώρο. Εάν ο όγκος καταστρέφει το αγγειακό χώρο, στη συνέχεια, τα μέσα μαζικής ενημέρωσης δεν θα είναι σε θέση να αντλεί μέσα από το ικρίωμα σε 6 cc ανά λεπτό. Καθ ‘όλη τη 15-ημερών, δεν είχαμε κανένα πρόβλημα διάχυση της οζίδιο όγκου. Έτσι, το μοντέλο δημιουργεί μπορεί να κάνει διάχυση οζίδιο όγκου. Δεν υπάρχει κανένα άλλο μοντέλο που μπορεί να παραδώσει τα θρεπτικά συστατικά και να αφαιρέσετε εκκρινόμενη παράγοντες όπως αυτό το μοντέλο. Επιπλέον, σε αντίθεση

in vitro

3D μοντέλα που βασίζονται σε ένα τεχνητό μήτρας, η σύνθεση της μήτρας που χρησιμοποιείται στην

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D είναι η σύνθεση που είναι πιθανότερο θεωρείται από τον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα στο

in vivo

περιβάλλον. Όπως κύτταρο σηματοδότηση και η συμπεριφορά εξαρτάται από τη σύνθεση και την ακαμψία της εξωκυττάριας μήτρας [9], [16], [17], η συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων μπορεί να εκπροσωπείται με μεγαλύτερη ακρίβεια από το

ex vivo

3D πνεύμονα μοντέλο.

Εκτός από τον σχηματισμό μπορεί να κάνει διάχυση οζίδια όγκου, τα κύτταρα Α549 αναπτύσσονται στο

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα παράγονται ΜΜΡ-9 που παράγεται από τα κύτταρα του καρκίνου του πνεύμονα σε ασθενείς. MMPs είναι μια οικογένεια εξαρτώμενων από ψευδάργυρο ενδοπεπτιδασών που παίζουν καθοριστικό ρόλο στην εισβολή των καρκινικών κυττάρων, μετανάστευση, και η μετάσταση, υποβαθμίζοντας την εξωκυττάρια μήτρα (ECM) και των βασικών μεμβρανών [18]. ECM είναι ένα πολύπλοκο δίκτυο μακρομορίων όπως κολλαγόνο, πρωτεογλυκάνες, λαμινίνη, ινονεκτίνη, και πολλές άλλες γλυκοπρωτεΐνες. Το mRNA των ΜΜΡ ανιχνεύθηκαν επίσης επί των κυττάρων όγκου αυξάνεται στο

ex vivo

3D μοντέλο την ημέρα 15. Επιπλέον, η ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και ΜΜΡ-10 βρέθηκαν στα μέσα του

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D, καθώς και στον ορό των δειγμάτων αίματος που συλλέγονται από την ανώτερη κοίλη φλέβα και πνευμονικές φλέβες των δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα λοβεκτομή. Η πνευμονική φλέβα είναι η πρώτη μεγάλη σκάφος που αντιμετωπίζουν οι εκκρινόμενη πρωτεΐνη από τον καρκίνο του πνεύμονα, το οποίο θα κρατήσει την υψηλότερη συγκέντρωση των πρωτεϊνών που εκκρίνονται από τον καρκίνο. Επιπλέον, η άνω κοίλη φλέβα περιέχει αίμα που ταξιδεύει προς την πνευμονική αρτηρία η οποία πηγαίνει στον πνεύμονα με τον όγκο. Έτσι, η ΜΜΡ που πιθανόν παράγεται από τον όγκο θα πρέπει να έχουν υψηλότερη συγκέντρωση στην πνευμονική φλέβα και χαμηλότερη συγκέντρωση στην άνω κοίλη φλέβα. Μεταξύ των τεσσάρων MMPs που μελετήθηκαν, διαπιστώσαμε ότι η ΜΜΡ-9 είναι η μόνη πρωτεΐνη που ανταποκρίνονταν αυτά τα κριτήρια. MMP-9 βρέθηκε στα μέσα του

ex vivo

μοντέλο των πνευμόνων 3D, ενώ δεν βρέθηκε στον πολιτισμό 2D. Η μελέτη μας επιβεβαιώνει την προηγούμενη διαπίστωση ότι τα κύτταρα Α549 δεν θα παράγουν ΜΜΡ-9 σε 2D πολιτισμού [19]. ΜΜΡ-9 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αποδόμηση του κολλαγόνου τύπου IV, η οποία είναι μια κύρια δομική πρωτεΐνη για την ECM και βασικές μεμβράνες. Οι ΜΜΡ-9 Υψηλά επίπεδα ορού έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με κακή επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα [20], [21]. Έτσι, η παρουσία της MMP-9 στο

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα δείχνει ότι μιμείται

in vivo

καλύτερες συνθήκες από ό, τι τον πολιτισμό 2D.

Η δύναμη του τρέχουσα μελέτη δείχνει πως ανθρώπινου πνεύμονα καρκινικά κύτταρα συμπεριφέρονται σε 2D σε σύγκριση με το

ex vivo

3D μοντέλο χρησιμοποιώντας τον ίδιο αριθμό κυττάρων και με τη χρήση του ίδιου μέσου καλλιέργειας. Μια αδυναμία της παρούσας μελέτης είναι ότι δεν ήμασταν σε θέση να συγκρίνει το

ex vivo

3D μοντέλο με τις

in vitro

3D μοντέλα. Εμείς δεν ήταν σε θέση να τον πολιτισμό 25 εκατομμύρια κύτταρα σε matrigel να παρέχει μια σύγκριση λόγω των τεχνικών περιορισμών του

in vitro

3D μοντέλα. Ωστόσο, ήμασταν σε θέση να αποδείξει τις δυνατότητές του

ex vivo

μοντέλο 3D που δεν είχαν δει στο

in vitro

3D μοντέλα, όπως η ανάπτυξη των οζιδίων του όγκου και τη διατήρηση του αγγειακού χώρου.

Συνολικά, τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα που καλλιεργούνται στο em> ex vivo

μοντέλο πνεύμονα

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα που σχηματίζεται μπορεί να κάνει διάχυση οζίδια του όγκου, με εκκρινόμενες πρωτεΐνες που είναι σημαντικά για την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση. Ως εκ τούτου, η

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα μπορεί να είναι ένα καλύτερο μοντέλο με το οποίο να μελετήσει την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα και μετάσταση από τον πολιτισμό 2D και, ενδεχομένως, άλλα

in vitro

3D μοντέλα.

Υλικά και Μέθοδοι

Έχουμε λάβει ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση από τους ασθενείς για να καθορίσει secretome προφίλ στο αίμα. Τα πειράματα με ασθενείς εγκρίθηκαν από το Διοικητικό Συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμικών στο Methodist Hospital Research Institute (IRB (2) 0811-0142). Όλα τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με όλους τους ισχύοντες νόμους, κανονισμούς, τις κατευθυντήριες γραμμές και τις πολιτικές που διέπουν τη χρήση των πειραματόζωων στην έρευνα. Τα πρωτόκολλα για τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Φροντίδας και Χρήσης Θεσμικών ζώων στο Methodist Hospital Ινστιτούτο Έρευνας (AUP-0910 – 0018).

Δείγματα Ασθενών

Οι ασθενείς που υποβάλλονται σε λοβεκτομή για καρκίνο του πνεύμονα έδωσε τη συγκατάθεσή να έχουν αίματος που λαμβάνονται από την ανώτερη κοίλη φλέβα και πνευμονική φλέβα των εκτομή δείγματος. Συλλέξαμε επίσης ασθενούς δημογραφικές πληροφορίες και τα αποτελέσματα παθολογίας για το δοκίμιο. Μετά ασθενής είχε μια κεντρική θέση γραμμή, έχουμε απομακρυνθεί περίπου 10 mL από την κεντρική γραμμή που βρίσκεται στην άνω κοίλη φλέβα σε ένα BD Vacutainer με Κ

2 EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ, USA. Στη συνέχεια, αφού το δείγμα ήταν αφαιρείται από τον ασθενή, ταυτοποιήθηκε η πνευμονική φλέβα. Απομακρύναμε περίπου 10 mL του αίματος από τη φλέβα και τοποθετούνται σε ένα BD Vacutainer με K

2 EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). το δείγμα αραιώθηκε με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) σε 1:01? τότε, το δείγμα επιστρώθηκε επί 18 ml μέσων διαχωρισμού λεμφοκυττάρων και περιστράφηκε σε 2200

g

σε φυγόκεντρο για 20 λεπτά η συγκέντρωση ΜΜΡ του πλάσματος. στρώμα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα Luminex (Luminex, Austin, TX, USA) δοκιμασία που περιγράφεται παρακάτω.

Cell Culture

Το ανθρώπινο κυψελιδικό βασικών επιθηλιακών Α549 κυτταρική γραμμή αδενοκαρκινώματος ελήφθη από την American Type Culture Collection ( Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 525 cm

2 φιάλες κυτταρικής καλλιέργειας (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) σε πλήρες μέσο που κατασκευάζεται από RPMI 1640 (Hyclone, South Logan, UT, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Lonza, Walkersville, MD, USA) και αντιβιοτικά (100 IU /ml πενικιλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη, και 0,25 μg /mL αμφοτερικίνη? MP Biomedicals, Solon, ΟΗ, USA) στους 37 ° C σε 5% CO

2. Μόλις τα κύτταρα ήταν 85% συρρέοντα, πλύθηκαν με PBS και υποβλήθηκαν σε αγωγή με θρυψίνη χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη (Cellgro, Manassas, VA, USA) για τη συλλογή των κυττάρων από τις φιάλες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με τα μέσα ενημέρωσης και τελικά ανασταλεί σε 30 έως 50 ml πλήρους μέσου.

Ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα

Εμείς δημιουργήσαμε το

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Χρησιμοποιήσαμε αποκυτταριωμένο μήτρες πνεύμονα από την 4-εβδομάδων (n = 2) και 6-εβδομάδων (n = 2) αρουραίους. Οι αποκυτταριωμένο μήτρες πνεύμονα από την 4-εβδομάδων αρουραίους ήταν σημαντικά μικρότερες από εκείνες από 6 εβδομάδων αρουραίους. Τοποθετήσαμε 25 εκατομμύρια κύτταρα Α549 αραιώνονται σε 50 ml πλήρους μέσου μέσω της τραχείας του

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D (n = 4). Συλλέξαμε το μέσο που παθητικά βγήκε από το μοντέλο σε ένα δοχείο των 500 mL, πέρασε ξανά μέσω της τραχείας τρεις φορές, και επωάστηκαν αυτό στους 37 ° C για 2 ώρες για να επιτραπεί προσκόλληση των κυττάρων. Στη συνέχεια υπολογίζονται τα κύτταρα στο δοχείο και προσδιορίσθηκε το ποσοστό των κυττάρων του όγκου σπάρθηκαν στο

ex vivo

μοντέλο πνεύμονα 3D. Έχουμε τοποθετηθεί ένα επιπλέον 200 mL πλήρη μέσα στον βιοαντιδραστήρα που περιγράφηκε προηγουμένως [11] και επέτρεψε τα μέσα ενημέρωσης να περάσουν από την αντλία σε 6 ml ανά λεπτό και στη συνέχεια μέσω της οξυγόνωσης και της πνευμονικής αρτηρίας του

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα. Τρέξαμε επίσης ένα στοιχείο ελέγχου

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα, όπου αλλάξαμε 200 ml πλήρους μέσου στον βιοαντιδραστήρα καθημερινά χωρίς τη διάθεση τυχόν κυττάρων στο μοντέλο. Συλλέξαμε τα μέσα ενημέρωσης κάθε μέρα από το δοχείο των 500 mL και περιστρέφεται προς τα κάτω την χρησιμοποιούμενα μέσα σε 400

g

για 5 λεπτά και έσωσε 10 ml από το υπερκείμενο για secretome ανάλυση. Αντικαταστήσαμε το χρησιμοποιημένο μέσο με φρέσκα μέσα κάθε μέρα για 15 ημέρες. Κάθε δεύτερη μέρα, εξετάσαμε την

ex vivo

3D μοντέλο του πνεύμονα για την παρουσία όζων. Υπολογίσαμε την περιοχή ανά οζίδιο και προστίθενται όλους τους τομείς όζος να υπολογιστεί το συνολικό μέγεθος του όζου ανά μοντέλο. Μετά από 15 ημέρες, περίπου το 5% της

ex vivo

3D μοντέλο πνεύμονα απομακρύνθηκε και σταθεροποιήθηκε σε 10% φορμαλίνη για αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε), Ki-67, και δοκιμασία Caspase-3. Στη συνέχεια δημιουργήθηκε ένα αιώρημα μονών κυττάρων από το υπόλοιπο του πνεύμονα χρησιμοποιώντας μηχανική βλάβη που ακολουθείται από ενζυματική αποικοδόμηση με κολλαγενάση και δισπάση στους 37 ° C για 45 λεπτά. Εμείς περιδινήθηκαν τα κύτταρα σε 400

g

για 5 λεπτά και επαναιωρήθηκαν του σφαιριδίου σε 1 mL μέσου? τα κύτταρα στη συνέχεια μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το TC10 αυτοματοποιημένο μετρητή κυττάρων (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

2D Πολιτισμού

Έχουμε τοποθετηθεί 25 εκατομμύρια κύτταρα Α549 σε ένα 525-cm