Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία σύντομη μη -κωδικοποιητικών RNA που ρυθμίζουν την ομοιόσταση των κυττάρων με αναστολή της μετάφρασης ή αποικοδόμησης mRNA των γονιδίων στόχων, και ως εκ τούτου μπορούν να δράσουν ως ογκοκατασταλτικά γονίδια ή ογκογονίδια. Ο ρόλος των microRNAs στο μυελοβλάστωμα μόλις πρόσφατα έχουν αντιμετωπιστεί. Υποθέσαμε ότι microRNAs που εκφράζονται διαφορικά κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής ανάπτυξης του ΚΝΣ μπορεί να ρυθμίζεται ανώμαλα στο μυελοβλάστωμα και είναι λειτουργικά σημαντικό για την ανάπτυξη μυελοβλάστωμα κυττάρων.

Μεθοδολογία και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Εξετάσαμε την έκφραση των microRNAs στο μυελοβλάστωμα και τότε διερευνηθεί ο λειτουργικός ρόλος ενός ειδικού ένα, miR-128a, στη ρύθμιση της ανάπτυξης των κυττάρων μυελοβλάστωμα. Βρήκαμε ότι πολλοί microRNAs που συνδέονται με την κανονική νευρωνική διαφοροποίηση είναι σημαντικά κάτω ρυθμίζονται μυελοβλάστωμα. Ένας από αυτούς, miR-128a, αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων μυελοβλάστωμα στοχεύοντας το ογκογονίδιο Bmi-1. Επιπλέον, miR-128a μεταβάλλει την ενδοκυττάρια οξειδοαναγωγική κατάσταση των καρκινικών κυττάρων και προάγει την κυτταρική γήρανση.

Συμπεράσματα και Σημασία

Εδώ αναφέρουμε το μυθιστόρημα ρύθμιση των αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) με microRNA 128α μέσω της ειδικής αναστολής της Bmi-1 ογκογονιδίου. Έχουμε αποδείξει ότι το miR-128a έχει κατασταλτική δράση ανάπτυξης στην μυελοβλάστωμα και ότι η δραστηριότητα αυτή είναι εν μέρει διαμεσολαβείται από τη στόχευση Bmi-1. Αυτά τα δεδομένα έχει επιπτώσεις για τη ρύθμιση της οξειδοαναγωγής μελών σε βλαστικά κύτταρα του καρκίνου, τα οποία πιστεύεται ότι είναι ανθεκτικοί στη θεραπεία λόγω της χαμηλής μελών τους ROS

Παράθεση:. Venkataraman S, Alimova Ι, Fan R, Harris P, εργοδηγός Ν, Vibhakar Ε (2010) microRNA 128a Αυξάνει ενδοκυτταρικό ποσοστό ROS από Στόχευση Bmi-1 και αναστέλλει τον καρκίνο Μυελοβλάστωμα κυτταρική ανάπτυξη κατά Προώθηση της γήρανσης. PLoS ONE 5 (6): e10748. doi: 10.1371 /journal.pone.0010748

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Φλεβάρη 2010? Αποδεκτές: 30, Απριλίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιούνη, 2010

Copyright: © 2010 Venkataraman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα όγκου Παιδιατρικής του εγκεφάλου (https://www.pbtfus.org/), τις ανάγκες Αρκούδα Παιδιατρικό Ίδρυμα Καρκίνου (https://www.bearnecessities.org), και το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας-Εθνικό Ινστιτούτο Νευρολογικών Διαταραχών και Stroke (ΝΙΗ-NINDS) K08NS059790 επιχορήγησης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μυελοβλάστωμα είναι η πιο συχνή κακοήθης όγκος στον εγκέφαλο της παιδικής ηλικίας. Ενώ τα αποτελέσματα έχουν βελτιωθεί, υπάρχει σημαντική θεραπεία που σχετίζονται με τη νοσηρότητα [1], [2]. Επιπλέον, οι ασθενείς με χαρακτηριστικά υψηλού κινδύνου συνεχίζουν να έχουν φτωχή πρόγνωση. Οι πρόσφατες εξελίξεις δείχνουν ότι μυελοβλάστωμα προκύπτει από προδρόμους παρεγκεφαλίδας κύτταρο κόκκου ή νευρικά βλαστικά κύτταρα που βρίσκονται στην παρεγκεφαλίδα [3], [4], [5], [6]. Ενώ οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην μυελοβλάστωμα ογκογένεση δεν είναι σαφώς καθορισμένες, είναι σαφές ότι δεν υπάρχει ανώμαλη τον έλεγχο της κανονικής αναπτυξιακών μηχανισμών [7].

Πρόσφατα εργασία από το εργαστήριο μας και άλλοι έχουν εμπλακεί microRNAs ως σημαντικοί ρυθμιστές της μυελοβλάστωμα κυτταρική ανάπτυξη [8], [9], [10]. Τα microRNAs αποτελούνται από 18-22 νουκλεοτιδίων μορίων RNA με δραστηριότητα μετα-μεταγραφική γονιδιακή σίγηση [11]. Συνηθέστερα αυτοί ελέγχουν την γονιδιακή έκφραση μέσω σύνδεσης με την 3′-αμετάφραστη περιοχή (3 ‘UTR) των γονιδίων και αναστέλλει τη μετάφραση πρωτείνης [12]. Τα microRNAs μπορεί επίσης να αποσταθεροποιήσει και μεσολαβούν την υποβάθμιση των μεταγραφών RNA [13]. Εκτός από το ρόλο τους στη φυσιολογική ανάπτυξη, microRNAs συνδέονται επίσης με την καρκινογένεση [14], [15]. Πολλοί microRNAs υπο-εκφράζονται σε ανθρώπινους όγκους σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς, ενώ μερικά είναι υπερεκφράζεται [16]. Είναι σημαντικό, απορύθμιση των microRNA αποτελεσμάτων της επεξεργασίας στην αυξημένη ογκογένεση [17]. Επιπλέον, ένας αυξανόμενος αριθμός microRNAs σχετίζονται με ειδικούς ανθρώπινους καρκίνους. Για παράδειγμα, microRNA 21 (MIR-21) επί εκφράζεται σε γλοιοβλάστωμα, και η αναστολή της miR-21 αναστέλλει την ανάπτυξη γλοιοβλάστωμα

in vitro

και

in vivo

[18]. Άλλοι έχουν δείξει ότι miR-137 και miR-124 προκαλεί διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων γλοιώματος [19]. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι miR-124 δρα επίσης ως καταστολέας όγκων σε κύτταρα μυελοβλάστωμα ενώ άλλες πρόσφατες μελέτες έχουν εμπλέξει την πολυκιστρόνης miR 17-92 ως ογκογονίδιο σε ηχητικό hedgehog μυελοβλάστωμα μεσολάβηση [9], [10], [20].

Αυτές και άλλες πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η microRNAs είναι κρίσιμη ρυθμιστές της ογκογένεσης και ότι η συμβολή τους στην μυελοβλάστωμα ογκογένεση είναι σημαντική. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να ερευνήσουμε τη λειτουργία microRNA στο μυελοβλάστωμα. Ερευνήσαμε την πιθανότητα ότι η έκφραση του microRNAs εγκεφάλου εμπλουτισμένο μεταβάλλεται σε μυελοβλαστώματος και ότι ορισμένες από αυτές microRNAs μπορεί να παίζει έναν κρίσιμο ρυθμιστικό ρόλο σε αυτή του όγκου. Βρήκαμε ότι πολλές microRNAs που συνδέονται με την κανονική νευρωνική διαφοροποίηση είναι σημαντικά κάτω ρυθμίζονται μυελοβλάστωμα. Από αυτά τα microRNA 128α (miR-128a) ήταν έντονα προς τα κάτω ρύθμιση. Ενώ ο ρόλος του miR-128a έχει διερευνηθεί σε αστροκυτταρικές όγκους όπως γλοιοβλάστωμα, ο ρόλος του στην νευρωνική όγκους όπως μυελοβλάστωμα δεν είναι γνωστή. Εδώ περιγράφουμε ο λειτουργικός ρόλος του miR-128a στο μυελοβλάστωμα για πρώτη φορά. Βρήκαμε ότι το miR-128a αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων μυελοβλάστωμα με στόχο την ογκογονίδιο Bmi-1 και αυξάνοντας έτσι τα επίπεδα σταθερής κατάστασης του υπεροξειδίου και την προώθηση της κυτταρικής γήρανσης.

Αποτελέσματα

Brain εμπλουτίζεται microRNAs είναι διαφορικά εκφρασμένο σε μυελοβλάστωμα

Ως ένα πρώτο βήμα για την αντιμετώπιση του ρόλου των microRNA στο μυελοβλάστωμα πραγματοποιήσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών με βάση των microRNA στα κύτταρα μυελοβλάστωμα και τον συνέκρινε με την ανθρώπινη παρεγκεφαλίδα φυσιολογικό ενήλικα. Εμείς επιλέξαμε να εξετάσει μοσχεύματα πρωτογενών μυελοβλάστωμα τηλέφωνο στο χωρίο 2 στον πολιτισμό για να αποφευχθεί ο θόρυβος από μολυσματικά στοιχεία του φυσιολογικού εγκεφάλου σε δείγματα βιοψίας. Από τις 385 ανθρώπινης microRNAs δοκιμάστηκαν, 167 εκφράστηκαν σε χαμηλότερα επίπεδα σε μυελοβλάστωμα σε σύγκριση με την κανονική παρεγκεφαλίδα. Ιεραρχική συσταδοποίηση της έκφρασης microRNA διαχωρίζονται σωστά την κανονική παρεγκεφαλίδα από τα δείγματα μυελοβλάστωμα (Σχήμα S1-Α). Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι μειωμένη έκφραση του 90 microRNAs σε μυελοβλάστωμα ήταν στατιστικά σημαντικές (ρ & lt? 0,05). Αυτή η λίστα εξετάστηκε στη συνέχεια για να διαχωρίσει τα microRNAs που εκφράστηκαν στα τρία δείγματα της παρεγκεφαλίδας και στατιστικώς μειώθηκε στα τρία δείγματα μυελοβλάστωμα. Αυτό περιόρισε τον κατάλογο των στατιστικά σημαντική ανθρώπινης microRNAs με μειωμένη έκφραση σε όλα τα τρία δείγματα μυελοβλάστωμα έως 30 microRNAs (Σχήμα S1-Β). Αξίζει να σημειωθεί ότι πολλές από τις microRNAs είχαν προηγουμένως ταυτοποιηθεί ως εμπλουτίζεται σε φυσιολογικό εγκέφαλο [21]. Μερικοί αλλά όχι όλοι αυτοί οι microRNAs αναφέρθηκαν επίσης προηγουμένως ως μειώθηκε το μυελοβλάστωμα, σε σύγκριση με την κανονική παρεγκεφαλίδα [8], [9]. Σύγκριση των συνόλων δεδομένων της μειώθηκε microRNAs έχουν αναφερθεί στο παρελθόν και τα δεδομένα που μας αποκάλυψε ότι μόνο πέντε microRNAs είχαν εντοπιστεί από τις τρεις ομάδες (Εικόνα S2). Αυτά είναι miR-124, miR-129, miR-138, miR-150 και miR-323. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι το miR-124 είναι λειτουργικά σημαντική μυελοβλάστωμα, ενώ η βιολογία των άλλων τεσσάρων κοινών Mirs δεν είναι ακόμη σαφές [10]. Ferretti

et al

είχε ένα επιπλέον 12 microRNAs από κοινού με τα δεδομένα μας που, όπου, όπως Northcott

et al

είχε μόνο 3 επιπλέον microRNAs κοινά με μας (Εικόνα S2). Επιπλέον, υπήρχαν 10 επιπλέον microRNAs που εντοπίστηκαν μόνο από εμάς, ως μειώθηκε σημαντικά στο μυελοβλάστωμα (Εικόνα S2).

επόμενο εκτελούνται σε πραγματικό χρόνο RT-PCR σε μια ομάδα αυτών των miRNA σε επιπλέον δείγματα για την επικύρωση των μικροσυστοιχιών μας δεδομένων (Σχήμα 1Α). Συγκρίνοντας πρωτογενή κύτταρα μυελοβλάστωμα τόσο ενήλικων και παιδιατρικών κανονική παρεγκεφαλίδα αποκάλυψε μια σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των εμπλουτίζεται microRNAs εγκεφάλου σε μυελοβλάστωμα. Υπάρχουν τέσσερις πολύ κάτω ρυθμίζονται microRNAs δηλαδή, miR-125, miR-128a, miR -139 και αφήστε-7 γρ. Από αυτές τις τέσσερις microRNAs, miR-139 αναγνωρίστηκε από εμάς, αλλά όχι σε δύο προηγούμενες εκθέσεις [8], [9]. Επιπλέον εμείς καθώς Ferretti

et al

αλλά δεν Northcott

et al

ανιχνεύεται miR-128a και μειώθηκε στο μυελοβλάστωμα. Είναι ενδιαφέρον ενήλικος παρεγκεφαλίδα είχαν υψηλότερη έκφραση πολλών από αυτά τα microRNAs, σε σύγκριση με τα παιδιατρικά παρεγκεφαλίδα. Η έκφραση του άκρως κατασταλεί microRNAs περαιτέρω επικυρωθεί σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών μυελοβλάστωμα. Παρόμοια με τα πρωτογενή μοσχεύματα και οι τέσσερις microRNAs μειώθηκαν στις κυτταρικές γραμμές όταν συγκρίνονται με την κανονική παρεγκεφαλίδα (Σχήμα 1Β). Συνεπής με προηγουμένως δημοσιευμένα δεδομένα βρήκαμε επίσης miR17-5p να είναι υπερ-εκφράζεται σε μυελοβλάστωμα [9].

Α) microRNA χάρτη θερμότητας χαρακτηριστικών των δειγμάτων ασθενών μυελοβλάστωμα και σύγκριση με την κανονική παρεγκεφαλίδα. Β) Καταστολή του miR-125, miR-128, miR-139, αφήστε-7g και αυξημένη έκφραση της miR17-5p σε κυτταρικές σειρές μυελοβλάστωμα. C) Σχετική έκφραση των microRNAs σε δείγματα ασθενών μυελοβλάστωμα.

Η

Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση ας-7g, miR-125 και miR-128a σε πρωτογενείς όγκους μυελοβλάστωμα και φυσιολογικό εγκεφαλικό ιστό. Χρησιμοποιώντας qRT- PCR βρήκαμε ότι και οι τρεις miRNAs μειώθηκε σημαντικά σε έκφραση σε αρχειοθετημένα δείγματα 10 μυελοβλάστωμα ασθενούς (ANOVA, ρ & lt? 0.001, Εικόνα 1C). Λόγω του μικρού σύνολο του δείγματος, είναι δύσκολο να αναπτυχθεί οποιαδήποτε συσχέτιση με όγκο υπο-τύπου ή την έκβαση των ασθενών. Ωστόσο, τα δείγματα δεν είχαν Gli1 υψηλό και ως εκ τούτου όχι στην υποκατηγορία ΕΛΕΡΠΕ [9], [22]. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι αυτά τα microRNAs θα μπορούσαν να έχουν ένα σημαντικό βιολογικό ρόλο σε μυελοβλάστωμα. Με βάση την έκταση του miR-128a καταστέλλεται στο μυελοβλάστωμα σε αντίθεση με υψηλή έκφραση της στην κανονική παρεγκεφαλίδα, επιλέξαμε να διερευνήσουμε περαιτέρω το λειτουργικό ρόλο του miR-128a στο μυελοβλάστωμα

Re-έκφραση του miR-128a μειώσεις. ϋΑΟΥ μυελοβλάστωμα κυτταρική ανάπτυξη

Για να προσδιοριστεί εάν η επανέναρξη της έκφρασης των microRNAs μεταβάλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, επιμολύναμε ΩΑΟΥ κύτταρα μυελοβλάστωμα με microRNA πρόδρομα ολιγονουκλεοτίδια. Αυτά τα πρόδρομα μόρια microRNA σχεδιαστεί για να μιμείται την ενδογενή microRNAs. Re-έκφραση του miR-128a μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων μυελοβλάστωμα, όπως μετράται με τη δοκιμασία ΜΤΤ (Σχήμα 2Α). Παρόμοια ευρήματα παρατηρήθηκαν σε D283 μυελοβλάστωμα κυτταρική σειρά (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η επίδραση αναστολής της ανάπτυξης του miR-128a, εμείς επιμολυσμένα κύτταρα ϋΑΟΥ με έλεγχο miR ή miR-128a ολιγονουκλεοτίδια και μετρήθηκαν τα κύτταρα για 5 ημέρες χρησιμοποιώντας τη μέθοδο trypan αποκλεισμού μπλε χρωστική ουσία. Σε συμφωνία με τα δεδομένα ΜΤΤ, miR-128a μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων ϋΑΟΥ με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 2Β).

Α) MiR-128α αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μυελοβλάστωμα, όπως μετράται με ΜΤΤ δοκιμασία. (P & lt? 01) β) τον αριθμό των κυττάρων ϋΑΟΥ, όπως μετράται με trypan δοκιμασία αποκλεισμού μπλε χρωστική ουσία. Γ) Μειώθηκε το σχηματισμό αποικιών σε miR-128a επιμολυσμένα κύτταρα (επάνω σειρά διάνυσμα miR-128a, κάτω σειρά είναι φορέας ελέγχου). Δ) Αποικία μετράει εις τριπλούν από 2 ανεξάρτητα πειράματα. (P & lt? 0.001)

Η

Για να αξιολογεί καλύτερα τον αντίκτυπο των microRNAs στα κύτταρα μυελοβλάστωμα χρησιμοποιήσαμε ένα λεντοϊού πλασμίδιο, το οποίο εκφράζει την κασέτα miR-128a και εκτελούνται δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2C και D, η επιμόλυνση με miR-128a ανέστειλε το σχηματισμό αποικιών από κύτταρα μυελοβλάστωμα υποδεικνύοντας ότι miR-128a είναι ένας υποθετικός καταστολέας όγκων σε μυελοβλάστωμα. Επιπλέον miR-128a μείωσε ισχυρά την ικανότητα των κυττάρων ϋΑΟΥ να αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ περαιτέρω προτείνοντας ένα ρόλο κατασταλτικό όγκου για miR-128a σε μυελοβλάστωμα (Σχήμα S3).

microRNA 128α κάτω ρυθμίζει Bmi-1 σε κύτταρα μυελοβλάστωμα

επόμενο πραγματοποιηθεί μια ανάλυση των πιθανών θέσεων στόχων microRNA χρησιμοποιώντας δύο χρησιμοποιούνται συνήθως αλγόριθμους πρόβλεψης, TargetSCAN (https://www.targetscan.org) και PicTar (https://pictar.bio.nyu.edu) [23], [24]. Και οι δύο αλγόριθμοι προβλέψει το Polycomb γονίδιο Bmi-1 να είναι ένας στόχος για miR-128a. Η θέση στόχος πληροί τα κριτήρια αντιστοίχισης των σπόρων (Εικόνα 3Α). Για να δοκιμαστεί εάν πειραματικά προβλεπόμενη στόχους μας ρυθμίζονταν από miR-128a, η θέση στόχος Bmi-1 κλωνοποιήθηκε στο 3’UTR του γονιδίου της λουσιφεράσης της Renilla στον φορέα siCHECK. κύτταρα ϋΑΟΥ επιμολύνονται με έλεγχο ή miR-128a ολιγονουκλεοτίδια. Συν-επιμόλυνση με miR-128a μειώθηκε σημαντικά δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla στις Bmi-1 φορείς θέση στόχο, αλλά όχι στα μεταλλαγμένα φορείς θέση (Σχήμα 3Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Bmi-1 είναι ένας στόχος του miR-128a. Μια άλλη πρόσφατη μελέτη του miR-128a σε γλοίωμα ανέφερε επίσης ότι Bmi-1 είναι ένας στόχος για miR-128a [25]. Αυτό είναι ιδιαίτερα συναρπαστικό αφού Polycomb γονίδια παίζουν ζωτικό ρόλο στην ανανέωση των βλαστικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης και είναι επίσης γνωστό ότι είναι βιολογικά σημαντικό σε νευρικά κυτταρικό πολλαπλασιασμό και μυελοβλάστωμα παθογένεση [26] – [27].

Α) ΜΙΚ θέση στόχο 128α στην Bmi-1 3’UTR. Β) δοκιμασίες λουσιφεράσης ανταποκριτή υποδεικνύουν ότι miR-128a στοχεύει λειτουργικά το wt Bmi-1 3’UTR, * ρ & lt? 0,01 Γ) ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαιώνει ότι miR-128a, αλλά όχι η έκφραση ελέγχου miR (CM), αναστέλλει πρωτεΐνη Bmi -1 σε κύτταρα μυελοβλάστωμα. Δ) Η ποσοτικοποίηση των ζωνών κηλίδος Western. (P & lt? 0,01)

Η

Για να επικυρώσετε την περαιτέρω Bmi-1 ως στόχο του miR-128a, πραγματοποιήθηκε ανάλυση ανοσοστυπώματος ελέγχου ή miR-128a επιμολυσμένα κύτταρα. κύτταρα ϋΑΟΥ επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή miR-128a ολιγονουκλεοτίδια και συλλέχθηκαν 48 ώρες αργότερα. Η ανάλυση στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-Bmi-1 αντίσωμα. MiR-128α μειωμένα επίπεδα πρωτεΐνης Bmi-1 σε κύτταρα ϋΑΟΥ συνεπής με τις λουσιφεράση δεδομένων. (Σχήμα 3C, D).

microRNA 128α αναστέλλει Bmi-1 μεσολαβούμενων σηματοδότησης

Bmi-1 είναι γνωστό ότι καταστέλλει την έκφραση ρ16 [28]. Ελλείψει Bmi-1, p16 είναι επάνω ρυθμίζεται σε νευρωνικά βλαστοκύτταρα μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [26]. Επίσης, έχει αποδειχθεί ότι Bmi-1 που προκαλείται καταστολή της ρ16 μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη επιθετική συμπεριφορά του μελανώματος βλαστοκυττάρων [29]. ΫΑΟΥ και ONS76 μυελοβλάστωμα κύτταρα επιμολυσμένα με miR-128a p16 up-ρυθμίζεται όπως ανιχνεύεται με κηλίδωση Western (Εικόνα 4Α). Οι ίδιες κυτταρικές σειρές όταν επιμολυσμένα με Bmi-1 εντελώς καταπιεσμένη έκφραση p16. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι miR-128a αποτρέπει την καταστολή του ρ16 με αναστολή Bmi-1, και οι δύο κυτταρικές σειρές ONS76 ϋΑΟΥ και συν-επιμολύνθηκαν με miR-128a και Bmi-1. Αυτό οδήγησε σε μια μέτρια αύξηση σε επίπεδο πρωτεΐνης ρ16 σε σύγκριση με εκείνη των κυττάρων που επιμολύνθηκαν μόνο με Bmi-1.

Α) ανάλυση κηλίδας Western έδειξε αυξημένη έκφραση ρ16 σε κύτταρα επιμολυσμένα με ϋΑΟΥ miR-128a σε σύγκριση με εκείνη της φορέα ελέγχου, pVETL. Το επίπεδο έκφρασης ρ16 αναστάλθηκε πλήρως σε κύτταρα ϋΑΟΥ που επιμολύνθηκαν με τον φορέα Bmi-1 μόνη ενώ μέτρια αναστολή παρατηρήθηκε σε κύτταρα συν-επιμολυσμένα με miR-128a. Β) Μειωμένη δραστηριότητα E2F1 σε κύτταρα ϋΑΟΥ επιμολυσμένα με miR-128a, όπως μετράται με λουσιφεράσης δημοσιογράφος. (P & lt? 0,01)

Η

Προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι Bmi-1 αναστέλλει ρ16 και έτσι ενισχύει την δραστηριότητα E2F1 [30]. Οι E2F μεταγραφικοί παράγοντες διαδραματίζουν βασικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και την τερματική διαφοροποίηση. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε η επίδραση του miR-128a στην μεταγραφική δραστηριότητα E2F1. Διαπιστώθηκε ότι η επιμόλυνση του miR-128a σε κύτταρα ϋΑΟΥ μειώθηκαν σημαντικά δραστικότητα E2F1 όπως μετράται με δραστικότητα λουσιφεράσης ανταποκριτή, ρ & lt? 0,05 (Σχήμα 4Β). Αυτό είναι σύμφωνο με τα ευρήματά μας ότι το miR-128a μειώνει Bmi-1 και αυξάνει την p16.

Bmi-1 είναι ένα λειτουργικό συστατικό του miR-128a μεσολάβηση μυελοβλάστωμα διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω κατά πόσον bmi-1 καταστολή είναι ένα λειτουργικό συστατικό του miR-128a φαινότυπο διακοπή της ανάπτυξης ερευνήσαμε αν bmi-1 θα μπορούσε να διασώσει το miR-128a αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων μυελοβλάστωμα. κύτταρα Μυελοβλάστωμα επιμολύνθηκαν με miR-128a, miR-128a και Bmi-1 ή των αντίστοιχων ελέγχων και τα κύτταρα υποβάλλονται σε δοκιμασία εστίαση αποικία. Η συν-επιμόλυνση του miR-128a με Bmi-1 είχε σαν αποτέλεσμα εξασθένηση του μεσολάβηση miR-128a διακοπή της ανάπτυξης και στις δύο κύτταρα ϋΑΟΥ (Σχήμα 5Α και Β). κύτταρα ϋΑΟΥ συν-επιμολυσμένα με Bmi-1 που δεν 3’UTR και miR-128a διασώθηκε επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων όπως αναστέλλονται από μόνος miR-128a (Σχήμα S4A). Αυτό δείχνει σαφώς ότι το miR-128a στοχεύει Bmi-1 και να μειώσει την επιβίωση των κυττάρων. Μια άλλη κυτταρική σειρά μυελοβλάστωμα έδειξε ONS76 κύτταρα επίσης την ίδια τάση στην απόδοση επιμετάλλωση όταν επιμολύνονται με miR-128a και Bmi-1 (Σχήμα S4B). Αυτά τα δεδομένα τοποθετεί λειτουργικά Bmi-1 στον καταρράκτη miR-128a.

Α) Συν-επιμόλυνση κυττάρων ϋΑΟΥ με miR-128a και Bmi-1 αύξησε τον αριθμό των αποικιών που σχηματίστηκαν σε σύγκριση με εκείνη του μόνος miR-128a . Β) Ποσοτική ανάλυση του αριθμού των αποικιών που σχηματίστηκαν από τα κύτταρα ϋΑΟΥ μετά από διαφορετικούς επιμολύνσεις, συμπεριλαμβανομένων Bmi-1 που στερείται 3’UTR της. ρΒΑΒΕ-puro είναι ένας φορέας ελέγχου για το πλήρες μήκος Bmi-1. * P & lt? 0,05 για miR-128a εναντίον pVETL και ** p & lt? 0,001 για miR-128a έναντι miR-128a + Bmi-1

Η

microRNA 128α αυξάνει το επίπεδο σταθερής κατάστασης του υπεροξειδίου. σε ϋΑΟΥ κύτταρα

Πρόσφατα έχει δειχθεί ότι η απουσία Bmi-1 οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) σε κύτταρα που προέρχονται από Bmi-1 ποντίκια knockout [31]. ROS είναι καλά γνωστές για να διαμορφώνει μια ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου κυτταρική βιολογία [32]. Δεδομένου ότι το miR-128a μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης Bmi-1, θέλαμε να ελέγξετε αν μια παρόμοια αύξηση των επιπέδων ROS ήταν εμφανής σε κύτταρα ϋΑΟΥ θεραπεία με miR-128a. Πραγματοποιήσαμε γύρισμα παγίδευση των ελεύθερων ριζών και παραμαγνητικά συντονισμού (EPR) φασματοσκοπία ηλεκτρονίων για να διαπιστωθεί αν υπήρξε αύξηση του επιπέδου ROS στα κύτταρα εκ νέου εκφράζουν miR-128a. Η παγίδα σπιν, DMPO επιλέχθηκε λόγω της χαμηλής κυτταροτοξικότητας του, την προσβασιμότητα στο κύτταρο, και αντίδραση με ρίζες υδροξυλίου (ΟΗ ·) για να αποδώσει ένα διακριτικό DMPO-ΟΗ σπιν προϊόν προσθήκης [33]. Η αντίδραση των DMPO με δισμουτάση αποδίδει ένα προϊόν (ϋΜΡΟ-ΟΟΗ), που μετατρέπεται σε ϋΜΡΟ-ΟΗ με GPx στα κύτταρα. Ως εκ τούτου, ϋΜΡΟ είναι ένα χρήσιμο ανιχνευτή για την ανίχνευση οξυγόνου επίκεντρο ρίζες που προκύπτουν από υπεροξειδίου και H

2O

2. Τα φάσματα EPR δείχνουν ένα τυπικό 1:2:2:1 DMPO-ΟΗ τετραπλή (κλειστοί κύκλοι, Εικόνα 6Α-ϋ). Αποτελέσματα EPR δείχνουν σαφώς την αύξηση του DMPO-ΟΗ ένταση κουαρτέτο σε κύτταρα που εκφράζουν ϋΑΟΥ miR-128a σε σύγκριση με εκείνη του κενού φορέα (Σχήμα 6Α-i). Να προσδιορίσει με ακρίβεια αν το σήμα κουαρτέτο ϋΜΡΟ-ΟΗ μπορεί να οφείλεται άμεσα στην υπεροξειδίου ή H

2O

2, κύτταρα ΩΑΟΥ επιμολυσμένα με miR-128a επωάστηκαν με ΟυΖηδΟϋ για 30 λεπτά πριν από την προσθήκη του ϋΜΡΟ. Η προσθήκη του SOD ελάττωσε σημαντικά την EPR σήματος ύψος γεγονός που υποδηλώνει ότι το σήμα DMPO-ΟΗ οφείλεται άμεσα να υπεροξειδίου (Εικόνα 6Α-III). Η ποσοτική ανάλυση του ύψους του σήματος τετραπλή (Σχήμα 6Β) έδειξαν σημαντική αύξηση (ρ & lt? 0,05) του σουπεροξειδίου σε κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με miR-128a σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με τον φορέα ελέγχου. Αυτή η αύξηση στην ένταση σήματος ανεστάλη με την προσθήκη του SOD. Είναι, επομένως, σαφές ότι το miR-128a αυξάνει το επίπεδο σταθερής κατάστασης του υπεροξειδίου στα κύτταρα μυελοβλάστωμα. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι η αύξηση της ROS οφείλεται στην αναστολή της Bmi-1, τα κύτταρα ΩΑΟΥ συν-επιμολύνθηκαν με Bmi-1 και miR-128a. Αυτό οδήγησε σε ένα μειωμένο επίπεδο ROS στα κύτταρα σε σύγκριση με εκείνη του miR-128a μόνο (Σχήμα 6Α-IV). πειράματα διάσωσης με Bmi-1 που στερούνται 3’UTR της αποκάλυψε επίσης ότι το miR-128a στοχεύει Bmi-1 και ως εκ τούτου οδηγεί σε αύξηση του επιπέδου ROS στα κύτταρα (Σχήμα S5)

Α) Αύξηση της ρίζας υπεροξειδίου σχηματισμό των κυττάρων ϋΑΟΥ ότι επιμολύνθηκαν με miR-128a όπως ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας EPR φάσματα του σπιν προϊόντος προσθήκης DMPO-ΟΗ (κλειστοί κύκλοι σε (ii)). Τα φάσματα που συλλέγονται είναι ένα μέσο σήμα του 15 σαρώσεις. Το σήμα 1:2:2:1 (κλειστοί κύκλοι) κουαρτέτο φαίνεται οφείλεται στον σχηματισμό DMPO-ΟΗ. Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με miR-128a έχει ~ 3 φορές αύξηση στην ένταση σήματος ROS (ii) σε σύγκριση με τον κενό φορέα (i). Συν-επιμόλυνση των κυττάρων με miR-128a και Bmi-1 οδήγησε σε μειωμένο επίπεδο ROS σε σύγκριση με εκείνη του miR-128a μόνο (iii). Η θεραπεία της SOD σε miR-128a-επιμολυσμένα κύτταρα καταργούνται τα σήματα που δείχνουν ότι η ρίζα που σχηματίζεται είναι κυρίως υπεροξειδίου (iv). Β) Η ποσοτική ανάλυση των EPR ύψους κορυφής κανονικοποιήθηκαν προς τον αριθμό των κυττάρων. * P & lt?. 0.05 miR128a εναντίον pVETL και miR-128a + SOD

Η

microRNA 128a επάγει κυτταρική γήρανση των κυττάρων ϋΑΟΥ

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου, ένα υποπροϊόν του οξειδωτικού στρες μπορεί να προκαλέσει μη αναστρέψιμη διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων και γήρανση [34]. Επιπλέον γηρασμένα κύτταρα έχουν σημαντικά περισσότερο ROS σε σύγκριση με τα αποπτωτικά κύτταρα [35]. Στην έκφραση p16 Επιπλέον είναι ένα από τα σήματα αίθουσα της κυτταρικής γήρανσης [36]. Δεδομένου ότι βρήκαμε miR-128a επιμολυσμένων κυττάρων ϋΑΟΥ έδειξαν αυξημένη στην σταθερή κατάσταση επίπεδο του ROS, αυξήθηκε το επίπεδο πρωτεΐνης ρ16 και έδειξε μια διακοπή της ανάπτυξης των κυττάρων, εκτελέσαμε μία δοκιμασία για γήρανση. Πέντε ημέρες μετά την επιμόλυνση με miR-128a, έναν αυξημένο αριθμό γήρανση που σχετίζεται με β-γαλακτοσιδάση (SA-β-Gal) θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν (Σχήμα 7Α). Υπήρξε μια πενταπλάσια αύξηση σε κύτταρα σε γήρανση μετά miR-128a επιμόλυνση των κυττάρων σε σύγκριση με τον κενό φορέα επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 7Β) παρατηρήθηκε Παρόμοια δεδομένα σε ONS 76 μυελοβλάστωμα κύτταρα (Σχήμα S6).

Α ) MiR-128a προκαλεί γήρανση των κυττάρων μυελοβλάστωμα όπως ανιχνεύεται με χρώση SA-βήτα γαλακτοσιδάση (σκούρο μπλε κύτταρα? παραδείγματα υποδεικνύονται με κόκκινα βέλη). Β) Cell μετρήσεις ανά High Powered Πεδίο β-gal θετικά κύτταρα σε φορέα ελέγχου (pVETL) ή miR-128a επιμολυσμένα κύτταρα, * ρ = 0,003. Γ) ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει αυξημένο επίπεδο H3K9me2 πρωτεΐνης σε κύτταρα επιμολυσμένα με ϋΑΟΥ miR-128a σε σύγκριση με τον κενό φορέα. Ακτίνη χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Για να υποστηρίξει περαιτέρω το εύρημα μας ότι η επιμόλυνση miR-128a οδηγεί στην κυτταρική γήρανση, εξετάσαμε τα επίπεδα μεθυλίωσης της ιστόνης 3, λυσίνη 9 (H3K9) με western αποτύπωση. Οι γήρανση σχετίζεται με εστίες ετεροχρωματίνης που σχετίζονται με τη μεθυλίωση των ιστονών 3 λυσίνη 9 (H3K9me2). Είναι ενδιαφέρον ότι, η εκ νέου έκφραση του miR-128a οδήγησε σε αυξημένη μεθυλίωση των ιστονών 3 λυσίνης 9 (H3K9me2), ένα άλλο σήμα καταπιεσμένη έκφραση γονιδίου που προκαλείται από το Bmi-1 σύμπλοκο Polycomb καταστολέα (Σχήμα 7C). Όλα αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι η επίδραση ανασταλτική ανάπτυξης του miR-128a οφείλεται στην οδό γήρανση σηματοδότησης όπως πυροδοτήθηκε από την αύξηση των ROS

Συζήτηση

Εδώ αναφέρουμε το μυθιστόρημα ρύθμιση της αντιδραστικής είδη οξυγόνου με microRNA 128α μέσω της ειδικής αναστολής της Bmi-1 ογκογονιδίου. Ο λειτουργικός ρόλος των microRNA 128a στο μυελοβλάστωμα δεν έχει προηγουμένως περιγραφεί.

Βρήκαμε σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των πολλών microRNAs που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην ανάπτυξη του ΚΝΣ σε μυελοβλάστωμα ,. Τα στοιχεία μας είναι σύμφωνη με προηγούμενες μελέτες που έχουν περιγράψει μειωμένη έκφραση των microRNAs στο μυελοβλάστωμα [8], [9]. Ferretti

et al

βρέθηκαν 55 microRNAs να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε μυελοβλάστωμα με διαφορές στην έκφραση μεταξύ των μεγάλων ιστολογικών υποτύπων [8]. Ομοίως Northcott

κ.ά.

βρέθηκαν 61 microRNAs να μειωθεί σε μυελοβλάστωμα σε σύγκριση με την κανονική παρεγκεφαλίδα [9]. Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν ταξινομούνται περαιτέρω σε 4 μοριακές ομάδες υπήρχαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση microRNA. Για παράδειγμα, η Sonic Hedge Hog (ΕΛΕΡΠΕ) οδηγούνται οι όγκοι είχαν μειωμένη έκφραση των 10 microRNAs, αλλά κανένας που επικαλύπτονται με microRNAs που προσδιορίζονται από εμάς ή από Ferretti

et al

. Πράγματι ανάλυση σύγκριση αποκάλυψε σημαντικές διαφορές μεταξύ των microRNAs ανιχνεύονται από τις τρεις ομάδες (Εικόνα S2). Οι διαφορές αυτές είναι πιθανόν σχετίζονται με τις πλατφόρμες που χρησιμοποιούνται από κάθε ομάδα, την πηγή του όγκου και την πηγή και την ηλικία του κανονικού παρεγκεφαλίδας που χρησιμοποιείται. Χρησιμοποιήσαμε μοσχεύματα πρωτογενών κυττάρων σε καλλιέργεια σε πέρασμα 2, ενώ οι άλλες δύο ομάδες που χρησιμοποιούνται υλικό βιοψίας. Επιπλέον, οι ιστοί μας ασθενή ήταν όλα της κλασικής ιστολογίας, και δεν έχουν την υπογραφή της γονιδιακής έκφρασης για ΕΛΕΡΠΕ. Αξίζει να σημειωθεί ότι τόσο η μελέτη μας και η έκθεση της Ferretti

et al.

Διαπίστωσε ότι το miR-128a μειώθηκε σημαντικά στην έκφραση στο μυελοβλάστωμα, σε σύγκριση με την κανονική παρεγκεφαλίδα.

Θα δείξουμε ότι αυτή η μειωμένη έκφραση είναι μια ιδιότητα των δειγμάτων πρωτογενούς όγκου, καθώς και ένα πάνελ που χρησιμοποιούνται συνήθως κυτταρικές γραμμές μυελοβλάστωμα. Αυτά τα δεδομένα θα είναι ιδιαίτερα χρήσιμο ως συνάρτηση microRNA περαιτέρω διερευνάται στο μυελοβλάστωμα. Αξίζει να σημειωθεί ότι το σύμπλεγμα miR17-5p ήταν πάνω από εκφράζεται σε δείγματα μας, το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές [9].

Η ανάλυση του νέου εκφράζουν miR-128a στα κύτταρα μυελοβλάστωμα έδειξε ότι το miR-128a ανέστειλε την ανάπτυξη κυττάρων μυελοβλάστωμα πιθανότατα με τη μείωση του πολλαπλασιασμού. MiR-128α αποδειχθεί όγκου κατασταλτικά αποτελέσματα από ισχυρά αναστολή του σχηματισμού αποικίας των κυττάρων μυελοβλάστωμα. Περαιτέρω ανάλυση των πιθανών μηχανισμών αποκάλυψε ότι η Bmi-1 ογκογονίδιο ήταν ένας πιθανός στόχος του miR-128a. Δείξαμε ότι η πρωτεΐνη Bmi-1 κάτω ρυθμίζεται από miR-128a, το οποίο με τη σειρά του οδηγεί σε αύξηση της ρ16 ένας αναστολέας του κυτταρικού κύκλου. Κανονισμός Bmi-1 με microRNAs δίνεται συναρπαστικό ότι Bmi-1 υπερεκφράζεται σε μυελοβλαστώματος και κρίσιμες για την κανονική ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας [27]. Bmi-1 είναι επίσης κρίσιμη για νευρικών βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση [26]. Bmi-1 αποδείχθηκε επίσης προσφάτως να είναι ένας στόχος του miR-128a σε γλοιοβλάστωμα [25]. Τα δεδομένα μας εκτείνεται αυτή η παρατήρηση, αποδεικνύοντας ότι η αναστολή της Bmi-1 είναι λειτουργικά κρίσιμη για τη λειτουργία κατασταλτική ανάπτυξη miR-128a. Αποκατάσταση Bmi-1 έκφρασης σε miR-128a κύτταρα που εκφράζουν διασώζει τα κύτταρα μυελοβλάστωμα από τη σύλληψη της ανάπτυξης. Στη συνέχεια προσπάθησε να διερευνήσει περαιτέρω το μηχανισμό του miR-128a-Bmi-1 μονοπάτι στο μυελοβλάστωμα.

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι Bmi-1 ρυθμίζει αντιδραστικά είδη οξυγόνου [31]. Δείχνουμε ότι microRNA 128α επάγει ενδοκυτταρική δημιουργία υπεροξειδίου, ενδεχομένως με ρύθμιση των επιπέδων Bmi-1 και ότι Bmi-1 επανέκφραση αντιστρέφει την δημιουργία υπεροξειδίου. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα είναι πιο ανθεκτικά στην θεραπεία λόγω χαμηλότερη συνολική κατάσταση οξειδοαναγωγής [37]. Έτσι διαμόρφωση των ρυθμιστικών μηχανισμών της γενιάς ROS στα καρκινικά βλαστικά κύτταρα ίσως μια χρήσιμη στρατηγική για να καταστρέψει αυτά τα κύτταρα. Οραματιζόμαστε ένα σενάριο στο οποίο microRNA 128α μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επαγωγή ROS σε μυελοβλάστωμα βλαστικά κύτταρα και έτσι να γίνουν πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία. Το κλειδί είναι να ρυθμίζουν την ομοιόσταση των ROS. Σε κανονικές συγκεντρώσεις, ROS παίζει ένα ρόλο στην κυτταρικές λειτουργίες που περιλαμβάνουν μεταγωγής σήματος. Ωστόσο, μια ανισορροπία μεταξύ παραγωγή ROS και την ικανότητα των αντιοξειδωτικών να εξουδετερώνουν ROS μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή της κατάστασης κυτταρικής οξειδοαναγωγής, οδηγώντας σε οξειδωτικό στρες. Η παρατήρησή μας από ένα αυξημένο επίπεδο σταθερής κατάστασης των ROS, και επαγωγή στο p16 μπορεί να συμβάλλει στην πρόωρη γήρανση, στα κύτταρα που εκφράζουν miR-128a (Σχήμα S7).

Εν ολίγοις, έχουμε περιγράψει το λειτουργικό ρόλο του microRNA 128a στο μυελοβλάστωμα. Έχουμε αποδείξει ότι microRNA 128α μειώνει την ανάπτυξη των κυττάρων μυελοβλάστωμα μέσω των μηχανισμών που αφορούν ROS και γήρανση. Είμαστε τώρα διερεύνηση του ρόλου των microRNA 128a σε Ραδιοευαισθητοποίησης μυελοβλάστωμα χρησιμοποιώντας το

in vivo

ορθοτοπική μοντέλα ξένου μοσχεύματος.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα, ιστούς και Πολιτισμού

ϋΑΟΥ και D283 μυελοβλάστωμα κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Rockville, Md.) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ (Gibco, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco) σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή . Η γραμμή κυττάρων ONS76 παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. James T. Rutka (Πανεπιστήμιο του Τορόντο, Καναδάς) και καλλιεργήθηκε σε DMEM που περιείχε 10% FBS. D341 ελήφθη από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 20% FBS και 1% πυροσταφυλικό νάτριο και L-γλουταμίνη. πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων που προέρχονται από δείγματα βιοψίας των ασθενών μυελοβλάστωμα υπό ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο αναθεώρηση Θεσμικών στο Πανεπιστήμιο της Αϊόβα Νοσοκομεία και Κλινικές. Γραπτή συγκατάθεση από όλους τους ασθενείς ελήφθη ως εντολή από το Πανεπιστήμιο της Αϊόβα IRB. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν σε χαμηλό αριθμό διόδου (Ρ2-Ρ4) σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 20% ορό εμβρύου μόσχου. Δείγματα φυσιολογικού ανθρώπινου παρεγκεφαλίδα και τον ασθενή μυελοβλάστωμα ελήφθησαν από την Παιδιατρική Συνεταιριστική Ανθρώπινο Δίκτυο ιστών (Columbus, Οχάιο) κάτω από ένα Πανεπιστήμιο της Αϊόβα IRB εγκεκριμένο πρωτόκολλο. Όλα τα δείγματα ελήφθησαν σε ένα ανώνυμο τρόπο, όπως επιβάλλεται από το IRB. Δείγματα εμείς Κανονική παρεγκεφαλίδας δείγματα ήταν από μη κακοήθη παιδιατρικούς και ενήλικες εγκεφάλου. Όλα τα δείγματα μυελοβλάστωμα ήταν από παιδιατρικούς ασθενείς. Οι λεπτομέρειες των δειγμάτων των ασθενών έχουν περιγραφεί προηγουμένως [38]. Εν συντομία όλα τα δείγματα ήταν από μη-μεταστατικά (Μ0) όγκους με ιστολογία κλασική μυελοβλάστωμα.

microRNA Απομόνωση και ανάλυση ποσοτική PCR

απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης mirVANA RNA (Ambion) μικρά RNAs.

έκφραση microRNA μετρήθηκε με ποσοτική PCR, χρησιμοποιώντας ΑΒΙ 7700 θερμικό-ανακυκλωτή. εκκινητών microRNA και ανιχνευτές αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (Foster City, CA) και οι δοκιμασίες διεξάγονται σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή με αρκετές τροποποιήσεις για να μας δώσει τη δυνατότητα να ανιχνεύει χαμηλή microRNAs αφθονία. Για την αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (RT) χρησιμοποιήθηκε 20 νανογραμμάρια ολικού RNA. Για την αντίδραση qPCR το προκύπτον cDNA αραιώθηκε 1:02. Κάθε στάδιο RT διεξήχθη εις διπλούν και το qPCR εις τριπλούν για κάθε αντίδραση RT. U6b και U66 μικρό RNAs χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι και ενδογενείς σχετική ποσότητα microRNA υπολογίζεται με τη μέθοδο ΔΔCT.

Παροδική επιμόλυνση κυττάρων ϋΑΟΥ με miR-128a και ανάλυση κυτταρικού πολλαπλασιασμού και βιωσιμότητας

Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με δοκιμασία και η κυτταρική βιωσιμότητα ΜΤΤ προσδιορίστηκε με trypan δοκιμασία αποκλεισμού μπλε βαφής. Για δοκιμασία για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τα κύτταρα μυελοβλάστωμα επιμολύνθηκαν με έλεγχο Mir, miR-9 ή miR-128a ολιγονουκλεοτιδίου σε πλάκες 24 φρεατίων χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο LT1 (Mirus, Madison WI). 6, 000 κύτταρα /φρεάτιο στη συνέχεια εμβολιάζονται εις τριπλούν σε σε τρυβλία 96 φρεατίων σε 100 μΐ μέσου. Μετά από 2 ημέρες, 100 μΐ κυττάρων Titer υδατικό (Promega, Madison, WI) προστέθηκε και τα κύτταρα επωάστηκαν για 1 ώρα και μετριέται η απορρόφηση στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. (ΦΆ).