Αφηρημένο

Ιστορικό

Claudins είναι σφιχτό πρωτεΐνες διασταύρωση που εμπλέκονται σε σφιχτό σχηματισμό διασταύρωση και τη λειτουργία. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι κλαουδίνης-7 συχνά ρυθμίζεται αυξητικά σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) μαζί με κλαουδίνης-3 και κλαουδίνης-4. Εδώ, έχουμε διερευνήσει λεπτομερώς τα πρότυπα έκφρασης των κλαουδίνης-7, καθώς και τις πιθανές λειτουργίες της στην EOC.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Ένα σύνολο των 95 δειγμάτων ωοθηκικού ιστού (7 φυσιολογική ωοθηκική ιστούς, 65 ορώδες καρκίνωμα, 11 σαφή καρκινώματα, 8 καρκινώματα ενδομητριοειδές και 4 βλεννώδες καρκίνωμα) μελετήθηκαν για κλαουδίνης-7 έκφραση. Σε πραγματικό χρόνο ανάλυση RT-PCR, το γονίδιο για κλαουδίνης-7,

CLDN7

, βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε όλα τα δείγματα ιστού όγκου που μελετήθηκαν. Ομοίως, ανοσοϊστοχημική ανάλυση και κηλίδωση Western έδειξε ότι κλαουδίνης-7 πρωτεΐνη ήταν σημαντικά υπερεκφράζεται στην πλειονότητα των EOCs. Μικρό παρεμβαλλόμενο RNA διαμεσολαβούμενη knockdown του κλαουδίνης-7 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών οδήγησε σε σημαντικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, όπως μετράται με μικροσυστοιχίες και επικυρώνεται με RT-PCR και ανοσοστύπωμα. Οι αναλύσεις των γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά αποκάλυψε ότι τα γονίδια μεταβάλλονται σε απόκριση κλαουδίνης-7 knockdown συνδέθηκαν με πορείες που εμπλέκονται σε διάφορες μοριακές και κυτταρικές λειτουργίες όπως κυτταρικού κύκλου, κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό, κυτταρικό θάνατο, την ανάπτυξη, και την κίνηση των κυττάρων. Μέσω λειτουργικών πειράματα in vitro, βρήκαμε ότι τόσο η μετανάστευση και την εισβολή είχαν μεταβληθεί σε κύτταρα όπου

CLDN7

είχε χτυπηθεί κάτω ή υπερεκφράζεται. Είναι ενδιαφέρον, κλαουδίνης-7 έκφραση συνδέθηκε με μια καθαρή αύξηση στην εισβολή, αλλά και με μείωση της μετανάστευσης.

Συμπέρασμα /Σημασία

Η εργασία μας δείχνει ότι κλαουδίνης-7 είναι σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε EOC και ότι μπορεί να είναι λειτουργικά εμπλέκονται σε εισβολή καρκίνωμα των ωοθηκών.

CLDN7

ενδέχεται επομένως να αποτελούν δυνητικό δείκτη για την ανίχνευση του καρκίνου των ωοθηκών και ένα στόχο για θεραπεία

Παράθεση:. Dahiya Ν, Becker KG, ξύλο, WH III, Zhang Υ, Morin PJ (2011) κλαουδίνης -7 συχνά υπερεκφράζεται στον καρκίνο των ωοθηκών και προωθεί την εισβολή. PLoS ONE 6 (7): e22119. doi: 10.1371 /journal.pone.0022119

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15, Δεκεμβρίου, 2010? Αποδεκτές: 16 του Ιούνη 2011? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιούλ 2011

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα αυτή υποστηρίχθηκε πλήρως από το εσωτερικό ερευνητικό πρόγραμμα των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Γήρανσης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η έκτη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο [1]. Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι συνήθως διαγιγνώσκεται ως προχωρημένη νόσο, όταν οι θεραπευτικές επιλογές είναι περιορισμένες και η πρόγνωση είναι πολύ κακή. Τα τελευταία χρόνια έχει παρατηρηθεί μια σειρά από προόδους στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών [2], [3], αν και πολλά από τα στοιχεία παραμένουν άγνωστα. Μεταξύ των γονιδίων των οποίων η έκφραση συχνά μεταβάλλεται σε καρκίνο των ωοθηκών είναι εκείνα που κωδικοποιούν την οικογένεια των κλαουδίνης σφιχτό πρωτεϊνών συνδέσεως [4] – [7]. Claudins αποτελούν τη ραχοκοκαλιά της TJs και είναι συνεπώς απαραίτητη σε επιθηλιακά διαμερισματοποίηση και στον έλεγχο της μεταφοράς διαλυμένης ουσίας κατά μήκος των κυτταρικών μονοστοιβάδων [8] – [10]

Στην περίπτωση του καρκίνου, η κανονική λειτουργία TJ και η δομή είναι συνήθως μεταβάλλονται και οι ίδιοι οι TJs. συχνά αποσυναρμολογούνται [11], [12]. Πρόσφατες γονιδιακής έκφρασης προφίλ μελέτες έχουν αναφέρει αλλαγμένη έκφραση ενός αριθμού πρωτεϊνών TJ σε πολλαπλές μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων αρκετών κλαουδίνης πρωτεΐνες [4], [6]. Για παράδειγμα, κλαουδίνης-3 και κλαουδίνης-4 είναι αυξημένα στο ωοθηκών, του προστάτη, της μήτρας και του μαστού, ενώ κλαουδίνης-1 μειώνεται σε καρκίνους του μαστού και του προστάτη.

κλαουδίνης-7 έχει βρεθεί μειωτικά σε αρκετές καρκίνους συμπεριλαμβανομένων οισοφαγικού [13], [14], κεφαλής και λαιμού [15] και του καρκίνου του προστάτη [16]. Απώλεια κλαουδίνης-7 συσχετίστηκε με αποδιαφοροποίηση σε αρκετές διαφορετικές μορφές καρκίνου [16] – [19]. Στον καρκίνο του μαστού, κλαουδίνης-7 έκφραση βρέθηκε επίσης να μειωθεί και αντιστρόφως ανάλογη με το βαθμό του όγκου και μεταστατικής νόσου [17], [18], αν και υπάρχουν ενδείξεις ότι κλαουδίνης-7 μπορεί να γίνει εκ νέου εκφράζονται σε μεταστάσεις [20], [21]. Επομένως, έχει προταθεί ότι η απώλεια της κλαουδίνης-7 συνδέεται με μια απώλεια της κυτταρικής προσκόλλησης και αυξημένη μετάσταση [14], [17]. Ωστόσο, κλαουδίνης-7 έχει επίσης αποδειχθεί ότι είναι αυξημένα σε διάφορους καρκίνους. Για παράδειγμα, κλαουδίνης-7 είναι γνωστό ότι είναι αυξημένα σε καρκίνο των ωοθηκών [22] – [27], καθώς και άλλες κακοήθειες [28], [29]. Ο λόγος για τις διαφορετικές μορφές των αλλαγών που παρατηρούνται σε διαφορετικές μορφές καρκίνου είναι προς το παρόν άγνωστη, αλλά μπορεί να σχετίζεται με τις ακριβείς ρόλους των κλαουδίνης-7 σε διάφορες κακοήθειες, καθιστώντας διαλεύκανση αυτών των ρόλων ένας σημαντικός στόχος.

Στην παρούσα έκθεση , πρέπει πρώτα να αξιολογήσει κλαουδίνης-7 τα επίπεδα έκφρασης στα δείγματα ωοθηκικό ιστό και κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western, RT-PCR, και ανοσοϊστοχημεία και διαπιστώνουν ότι κλαουδίνης-7 εκφράζεται ευρέως σε όγκους των ωοθηκών. Χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες, διαπιστώνουμε ότι πολλά γονίδια εκφράζονται διαφορικά παρακάτω

CLDN7

νοκ ντάουν και ανάλυση αυτών των γονιδίων υποδηλώνει πολλά μονοπάτια μέσω των οποίων

CLDN7

μπορεί να λειτουργήσει στον καρκίνο των ωοθηκών. Δείχνουμε ότι

CLDN7

knockdown οδηγεί σε μείωση της φωσφο-ΕΚΚ και αύξηση των επιπέδων Raf-1, γεγονός που υποδηλώνει μια πιθανή οδό για κλαουδίνης-7 σηματοδότηση στον καρκίνο των ωοθηκών. Επιπλέον, διαπιστώνουμε ότι

CLDN7

έκφραση σχετίζεται με αυξημένη εισβολή, αλλά μειώθηκε η μετανάστευση σε πολλαπλές κυτταρικές σειρές που παρέχει μια λειτουργική σύνδεση με

CLDN7

έκφραση σε καρκίνωμα ωοθήκης.

αποτελέσματα

CLDN7

απομαγνητοφώνηση και τα επίπεδα της πρωτεΐνης είναι αυξημένα σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών

Πρόσφατες εργασίες δείχνουν ότι, εκτός από το

CLDN3

και

CLDN4

γονίδια,

CLDN7

συχνά αυξημένη σε καρκίνο των ωοθηκών [22] – [26], [30]. Προκειμένου να προσδιοριστεί με σαφήνεια όγκους ο

CLDN7

πρότυπα έκφρασης στον καρκίνο των ωοθηκών, των ωοθηκών μικροδιατομή από διάφορους υποτύπους, καθώς και κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR.

CLDN7

mRNA βρέθηκε να είναι ιδιαίτερα πάνω ρυθμισμένα σε όλες τις τέσσερις κύριες υποτύπων καρκίνου των ωοθηκών (δηλ ορώδης, βλεννώδες, σαφείς κυττάρων, και ενδομητριοειδές) σε σύγκριση με την κανονική ωοθηκών ιστούς (Σχήμα 1Α). Το επίπεδο της υπερέκφρασης ποικίλει σημαντικά και βρέθηκε να είναι οπουδήποτε από 2-πλάσια έως 50.000 φορές. Πράγματι, παρατηρήθηκε αύξηση κατά 2 φορές πάνω από ΣΩΛΗΝΑ-Β σε 2 από φυσιολογικούς ελέγχους της ωοθήκης, ενώ 50.000-πλάσια υπερέκφραση παρατηρήθηκε σε 3 ορώδες ιστούς καρκίνου των ωοθηκών.

CLDN7

κατανέμεται ευρέως σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς και μεταγραφή του βρέθηκε σε σχετικά υψηλά επίπεδα στο νεφρό, κόλον, πνεύμονα, έντερο, όρχεις, πλακούντα, σιελογόνους αδένες, θυρεοειδής, επινεφρίδια, πάγκρεας, προστάτη, ήπατος , του στομάχου, των ωοθηκών και του δέρματος (Σχήμα 1Β). Από την άλλη πλευρά, των μυών, του εγκεφάλου, της καρδιάς, σπλήνα, μήτρα, λευκοκύτταρα αίματος, μυελού των οστών, εμβρυϊκό εγκέφαλο, και εμβρυϊκό ήπαρ εκφράζεται χαμηλότερα επίπεδα

CLDN7

mRNA.

A. Τα υποδεικνυόμενα υπότυποι καρκίνωμα ωοθηκών δοκιμάσθηκαν για

CLDN7

έκφρασης με RT-PCR και τα επίπεδα φαίνονται σε σχέση με ΣΩΛΗΝΑ-Β κύτταρα (μια κυτταρική γραμμή ωοθηκών επιφάνεια επιθηλιακών αθανατοποιημένα με Ε6 και Ε7 [52]). Β

CLDN7

έκφραση σε φυσιολογικούς ιστούς. Οι ακόλουθοι ιστοί αναλύθηκαν: 1, Μύες? 2, του εγκεφάλου? 3, Καρδιά? 4, του νεφρού? 5, σπλήνα? 6, του ήπατος? 7, του παχέος εντέρου? 8, του πνεύμονα? 9, το λεπτό έντερο? 10, το στομάχι? 11, Όρχις? 12, πλακούντα? 13, σιελογόνων? 14, του θυρεοειδούς? 15, στα επινεφρίδια? 16, το πάγκρεας? 17, Μήτρα? 18, ωοθήκη? 19, του προστάτη? 20, του δέρματος? 21, Plasma λευκοκύτταρα του αίματος? 22, Bone Marrow? 23, εμβρύου εγκεφάλου? 24, εμβρυϊκού ήπατος. Τα επίπεδα δείχνονται ως προς μυς και ιστούς με επίπεδα υψηλότερα από 4-φορές φαίνεται στο γράφημα. Γ ανοσοκηλίδας ανάλυση των κλαουδίνης-7 έκφραση σε 2 κανονικές ωοθηκών ιστούς (Ν1 και Ν2), 7 ορώδες (S1, S2, S3, S4, S5, S6 και S7), ένα σαφές κυττάρων (C1) και μία ενδομητριοειδές (Ε1 ) καρκινώματα των ωοθηκών. Ένα σύνολο 29 δειγμάτων που ελέγχθηκαν με ανοσοστύπωση και είναι αντιπροσωπευτικά παραδείγματα δείχνονται. Δ Ανοσοϊστοχημεία της ορώδες καρκίνωμα των ωοθηκών. Επιλεγμένα ωοθηκών καρκινώματα (S3, S4, S5, S6) και ένα φυσιολογικό δείγμα ωοθηκών (Ν) απεικονίζεται. Ωοθηκών δείγματα καρκίνος χρωματίζονται με κλαουδίνης-7 αντίσωμα (Cl-7) επιδεικνύουν έντονη χρώση σε σύγκριση με τους αρνητικούς μάρτυρες χρώση λείπει πρωτογενές αντίσωμα (-).

Η

Προκειμένου να διερευνηθεί κλαουδίνης-7 επίπεδα πρωτεΐνης στον καρκίνο των ωοθηκών , ένα πάνελ 29 πρωταρχικών δειγμάτων καρκίνου των ωοθηκών καθώς και 4 κανονικούς ιστούς των ωοθηκών μελετήθηκε με ανοσοκηλίδωση (Εικόνα 1 C, Πίνακας S1). Κλαουδίνης-7 απουσίαζε σε όλους τους φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών, αλλά βρέθηκε σε υψηλή /μέτρια επίπεδα σε 66% (19/29) των δειγμάτων καρκίνου. Κλαουδίνης-7 βρέθηκε εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα σε 24% (7/29) των περιπτώσεων, και δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε 10% (3/29).

ανοσοϊστοχημεία (IHC) πειράματα επιβεβαίωσαν ότι κλαουδίνης-7 εκφράστηκε σε υψηλά επίπεδα σε καρκίνο των ωοθηκών (Εικόνα 1 D). Η μελέτη έδειξε ότι IHC κλαουδίνης-7 υπερέκφραση περιορίστηκε στα καρκινικά κύτταρα και δεν περιλαμβάνει το στρώμα. Επιπλέον, ενώ ορισμένοι όγκοι εμφάνισαν σημαντική χρώση μεμβράνης (S3 και S4), άλλοι έδειξαν μειωμένη χρώση στην μεμβράνη και τα υψηλά επίπεδα κυτταροπλασματικής χρώσης.

CLDN7

είναι αυξημένη σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών και μπορεί να βρίσκεται στη μεμβράνη ή στο κυτταρόπλασμα

για να αξιολογηθεί

CLDN7

έκφραση σε κυτταρικές σειρές, 7 κυτταρικές γραμμές αξιολογήθηκαν με RT-PCR και ανοσοστύπωμα (Σχήμα 2Α, Β) . Η

CLDN7

μετάγραφο δεν ανιχνεύεται στον μη κακοήθη γραμμή επιφανειακό επιθήλιο ΣΩΛΗΝΑ-Β, αλλά βρέθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών, εκτός UCI101 και OVCA432 (Σχήμα 2Α). Παρομοίως, κλαουδίνης-7 πρωτεΐνη δεν ανιχνεύθηκε σε ΣΩΛΗΝΑ-Β, αλλά ήταν παρόν σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών πλέον (αλλά όχι σε ΗΕΥ και UCI101) (Σχήμα 2Β). Είναι ενδιαφέρον, hey κύτταρα έδειξαν υψηλά επίπεδα

CLDN7

mRNA, αλλά τα χαμηλά επίπεδα της πρωτεΐνης, ενώ OVCA432 παρουσίασαν πολύ χαμηλή

CLDN7

μεταγραφή επίπεδα, αλλά η υψηλή έκφραση της πρωτεΐνης κλαουδίνης-7. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ενώ κλαουδίνης-7 μεταγραφή διατηρείται σε κυτταρικές γραμμές, κλαουδίνης-7 επίπεδα πρωτεΐνης μπορεί να ρυθμίζεται μέσω μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς.

A. Κλαουδίνης-7 ανοσοκηλίδωση αποκαλύπτει υψηλά επίπεδα έκφρασης σε υποδεικνυόμενα κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Ανάλυση Β RT-PCR του

CLDN7

mRNA σε κυτταρικές σειρές. Γ ανοσοφθορισμού των επιλεγμένων κυτταρικών σειρών καρκίνου εμφανίζει ισχυρή κλαουδίνης-7 έκφραση στον κόμβο κυττάρου σε BG-1, OVCA433, OVCA420 και OVCA432, καθώς και στικτή κυτταροπλασματική χρώση σε BG-1 και OVCA420. Κλαουδίνης-7 ανιχνεύτηκε με ένα αντι-κλαουδίνης-7 αντίσωμα και οπτικοποιήθηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με Alexa φθορίου. Οι πυρήνες των κυττάρων βάφτηκαν αντίθετα με DAPI. Εικόνες συγχωνεύθηκαν για να προσδιοριστεί σωστή εντοπισμού.

Η

Χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμό, κηλίδωση κλαουδίνης-7 βρέθηκε εντοπίζεται κυρίως στην κυτταρική μεμβράνη, με διάστικτη χρώση στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών BG-1, OVCA420 και OVCA433 (Σχήμα 2C). Σε OVCA432, παρατηρήσαμε επίσης χρώση μεμβράνη, αλλά λίγη έκφραση στο κυτταρόπλασμα.

αλλάζει γονιδιακή έκφραση μετά από

CLDN7

νοκ ντάουν στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Για να διερευνηθούν οι πιθανοί ρόλοι του

CLDN7

στον καρκίνο των ωοθηκών, εξετάσαμε τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης μετά από

CLDN7

νοκ ντάουν. Αυτά knockdown πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε κυτταρικές σειρές OVCAR-2 και OVCA420, δύο από τα οποία εμφανίζουν μέτρια ενδογενή επίπεδα κλαουδίνης-7 έκφρασης (Σχήμα 3Α).

CLDN7

siRNA θεραπεία οδήγησε σε σημαντική μείωση της κλαουδίνης-7 πρωτεΐνη 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 3Α) και αυτό το χρονικό σημείο επιλέχθηκε για ανάλυση μικροσυστοιχίας. Σε κύτταρα OVCAR-2, τα οποία σχηματίζουν TJs σε καλλιέργεια,

CLDN7

knockdown οδηγεί σε μείωση της διεπιθηλιακής αντίστασης (TER, ένα μέτρο της TJ στεγανότητας) και ταυτόχρονη αύξηση στην διαπερατότητα διαμέσου της μονοστιβάδας (Σχήμα 3Β). Αυτό αποδεικνύει ότι

CLDN7

knockdown έχει λειτουργικό αποτέλεσμα σε TJ σε αυτά τα κύτταρα. Σε OVCA420 κύτταρα, τα οποία δεν αποτελούν TJ στον πολιτισμό, ΔΣΕ ήταν εξαιρετικά χαμηλό και παρέμεινε ανεπηρέαστη από

CLDN7

νοκ ντάουν (Εικόνα 3Β). Συνεπής με αυτό το εύρημα, η διαπερατότητα ήταν επίσης επηρεάζεται από

CLDN7

νοκ ντάουν.

Α. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως της OVCAR-2 και OVCA420 κύτταρα μετά από

CLDN7

knockdown για 72 ώρες. B. Επιπτώσεις της

CLDN7

νοκ ντάουν για TJ και διαπερατότητα. Διεπιθηλιακό αντίστασης (TER) μετρήθηκε σε πολλαπλά χρονικά σημεία μετά

CLDN7

νοκ ντάουν. Η διαπερατότητα μετρήθηκε με αξιολόγηση της ικανότητας των φλουορεσκεΐνη ισοθειοκυανικό-δεξτράνης (40 kDa) για να διασχίσει την μονοστιβάδα. μετρήσεις φθορισμού αντανακλά διαπερατότητα μονοστιβάδας και τα αποτελέσματα αντικατοπτρίζουν τις μετρήσεις ΔΣΕ. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος +/- S.E.M. Ένας αστερίσκος (*) υποδηλώνει μια τιμή p & lt? 0,05, και ένα διπλό αστερίσκο (**), μια τιμή p & lt? 0,01. Γ Ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης της γονιδιακής έκφρασης μετά από

CLDN7

νοκ ντάουν στις δύο κυτταρικές σειρές. Το πράσινο χρώμα αντιπροσωπεύει ρύθμιση προς τα κάτω, ενώ το κόκκινο αντιπροσωπεύει πάνω ρύθμιση. Εντοπίστηκαν συνολικά 20 ομάδες γονιδίων που εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα.

Η

ανάλυση μικροσυστοιχιών χρησιμοποιήθηκε για να ερευνήσει τις επιπτώσεις της

CLDN7

νοκ ντάουν στη γονιδιακή έκφραση τόσο OVCAR-2 και κυττάρων OVCA420 γραμμές. ανάλυση ομαδοποίησης αποδειχθεί πολλές μορφές αλλαγών μετά

CLDN7

νοκ ντάουν και αυτά τα πρότυπα εκπροσωπήθηκαν από 20 διαφορετικές ομάδες γονιδίων, όπως προσδιορίζονται από ανεξέλεγκτους ομαδοποίηση μοτίβο χρησιμοποιώντας το λογισμικό JMP (Σχήμα 3C).

CLDN7

ήταν το μόνο γονίδιο στο σύμπλεγμα 3 και, όπως αναμενόταν, ήταν ιδιαίτερα μειωτικά στις δύο κυτταρικές σειρές. Από τα 1327 γονίδια εκφράζονται διαφορικά σε δύο γραμμές (Πίνακας S2), 297 (200 ρυθμίζεται προς τα πάνω και 97 ρυθμίζεται προς τα κάτω) μοιράστηκαν με OVCAR-2 και OVCA420 (Σχήμα 4). Αυτό αντιπροσωπεύει μια επικάλυψη 23% του συνόλου των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων, ένα ποσό πολύ υψηλότερο από εκείνο που αναμένεται από την τύχη και μόνο (ρ & lt? 0.001). Σε OVCAR-2, ένα σύνολο 553 γονιδίων απορυθμίζεται και 415 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και OVCA420, 404 γονίδια υπερεκφράζονται και 252 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω. Οι 20 κορυφαίοι γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένα σε κάθε κυτταρική σειρά (όπως και στα δύο ταυτόχρονα) απαριθμούνται στο Σχήμα 4.

Στο διάγραμμα Venn, αριθμοί σε κόκκινο αντιπροσωπεύουν γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω και αριθμούς στην πράσινη αντιπροσωπεύουν γονίδια ρυθμίζεται προς τα κάτω. Τα 20 κορυφαία γονίδια σε κάθε κατηγορία που αναφέρεται στο παρακάτω διάγραμμα Venn πίνακα.

Η

Για την επικύρωση και την επέκταση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών, 15 γονίδια που ήταν σημαντικά μεταβληθεί από

CLDN7

νοκ ντάουν ένας ή και οι δύο κυτταρικές σειρές, επιλέχθηκαν για την επικύρωση με ανάλυση RT-PCR (Σχήμα 5). Ενώ η πτυχή έκφραση φάνηκε να υποτιμηθεί από ανάλυση μικροσυστοιχιών, σε πραγματικό χρόνο PCR επιβεβαίωσε τις τάσεις για όλα τα γονίδια που ελέγχθηκαν (Σχήμα 5Α, Β). Επιπλέον, τα επίπεδα της πρωτεΐνης για πολλά από αυτά τα γονίδια (

CA12

,

RRAS2

,

PRSS8

,

APOE

,

AGT

,

SPRR3

, και

CLDN7

) ελέγχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά

CLDN7

knockdown (Σχήμα 5C). Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων ήταν σύμφωνα με τις αλλαγές που παρατηρούνται με RT-PCR. Συνολικά τα δεδομένα μας δείχνουν μια εξαιρετική συσχέτιση μεταξύ των μεταβολών ανιχνεύονται από μικροσυστοιχίες και τα αντίστοιχα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης.

A. Διπλώστε αλλαγές των διαφόρων υποδεικνυόμενα γονίδια σε OVCA420 και OVCAR-2 κυττάρων μετά από

CLDN7

knockdown. επικύρωση Β RT-PCR των γονιδίων φαίνεται στο (Α). Γ Ανοσοαποτύπωσης ανάλυση των επιλεγέντων υποψηφίων σε διάφορα χρονικά σημεία μετά από

CLDN7

νοκ ντάουν. ελέγχου GAPDH συμπεριλήφθηκε να επιβεβαιώσει παρόμοια φόρτωσης σε όλες τις λωρίδες.

Η

Διαδρομή ανάλυση

Χρησιμοποιώντας Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (IPA), αναλύσαμε τα μονοπάτια και τις πιθανές λειτουργίες που σχετίζονται με τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης μετά από

CLDN7

νοκ ντάουν. Πολλά από τα κορυφαία δίκτυα προσδιορίζονται εμπλέκονται καρκίνο, κυτταρική ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό, αλλά δεν ήταν σαφώς διατηρούνται μεταξύ των κυτταρικών σειρών (Πίνακας S3). Είναι ενδιαφέρον, «ενσωματίνη σηματοδότηση» βρέθηκε στις δύο κυτταρικές σειρές από τα πιο σημαντικά κανονικά οδούς που εντοπίστηκαν (Πίνακας S3). Τα κορυφαία βιολογικές λειτουργίες περιλαμβάνεται μια ποικιλία λειτουργιών, όπως η κυτταρική ανάπτυξη και τον κυτταρικό θάνατο, και έχει ενδιαφέρον, κυτταρική κίνηση. Οι φυσιολογικές συστημάτων που προσδιορίζονται περιλαμβάνονται αιματολογικές και ανοσοαπόκριση, καθώς και την ανάπτυξη του συνδετικού ιστού (Πίνακας S3). γονιδιακή ανάλυση οντολογία μεταβάλλεται γονίδια εντοπίστηκαν σημαντικές κατηγορίες όπως «δραστηριότητα δομικό μόριο», «δραστηριότητα μετατροπέας σήματος», «δραστηριότητα ρυθμιστής μεταγραφής», «δραστηριότητα ρυθμιστή μετάφραση» και «δραστηριότητα μεταφορέα» (Πίνακας S4).

Οι πιθανές λειτουργικές σχέσεις μεταξύ των διαφόρων διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων στη συνέχεια προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια ποικιλία προσεγγίσεων. Τα 5 πιο σημαντικά κοινά μονοπάτια KEGG (όπως καθορίζεται από Webgestalt) ήταν «ρύθμιση της ακτίνης του κυτταροσκελετού», «εστιακή προσκόλληση», «ΜΑΡΚ μονοπάτι σηματοδότησης», και «ινσουλίνη σηματοδότηση μονοπατιού». Πίνακας λίστα S5 όλες τις οδούς που εντοπίστηκαν. Τα κορυφαία γονίδια από τα 5 πιο σημαντικές οδούς που αναφέρονται παραπάνω χρησιμοποιήθηκαν για την αναζήτηση στη βάση δεδομένων Pathway Studio για γνωστές αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης (Σχήμα 6Α). Πίνακας S6 απαριθμεί τα στοιχεία αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και αντίστοιχες αναφορές τους. Είναι ενδιαφέρον ότι ένα από τα πιο γνωστά οδούς που εντοπίστηκαν μέσω αυτής της προσέγγισης ήταν η RAS-RAF-ΜΑΡΚ οδού (Σχήμα 6Α). Στη συνέχεια μελετήθηκε σε αυτή την οδό OVCA420 κύτταρα εξετάζοντας Erk και Raf-1 έκφραση και η φωσφορυλίωση σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 6Β). Κλαουδίνης-7 knockdown οδήγησε σε μια αύξηση στη φωσφορυλιωμένη Raf-1 (Ser-338) το οποίο αντικατοπτρίζεται από την αύξηση των συνολικών Raf-1 σε κάθε χρονικό σημείο, γεγονός που υποδηλώνει ότι πράγματι αυτή η οδός θα μπορούσε να επηρεαστεί από κλαουδίνης-7. /2 επίπεδα ERK1 δεν επηρεάστηκαν από κλαουδίνης-7 νοκ ντάουν, αλλά φωσφορυλιωμένη Erk παρουσίασαν μικρή μείωση, ιδιαίτερα σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία.

Α. Ανάλυση μονοπατιού Studio. Οι άμεσες αλληλεπιδράσεις των 33 σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (κόκκινο ανοδική βέλος) ή μειωτικά γονίδια (πράσινα βέλη προς τα κάτω) φαίνεται στην εικόνα. Το υπόμνημα για τα διάφορα είδη των αλληλεπιδράσεων παρουσιάζεται κάτω από το χάρτη. B. ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση των Erk1 /2, φωσφο-Erk1 /2 (ρ-Erk) και Raf-1 και φωσφο-Raf (Ser-338) σε OVCA420 στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία μετά

CLDN7

knockdown.

κλαουδίνης-7 έκφραση της πρωτεΐνης σχετίζεται με την κυτταρική εισβολή, αλλά αντιστρόφως ανάλογη με τη μετανάστευση

Επειδή η ανάλυση γονιδίων μας παραπάνω αποκαλύπτει την κίνηση των κυττάρων ως συνάρτηση επηρεάζεται ενδεχομένως από

CLDN7

, αποφασίσαμε να δοκιμάσει τις πιθανές ρόλους των

CLDN7

στη μετανάστευση των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή. Πραγματοποιήσαμε το πρώτο παροδικό siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν του

CLDN7

έκφραση σε δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών (OVCAR-2 και OVCA420) και δοκιμάστηκε μετανάστευσης με τη χρήση της δοκιμασίας κυτταρικής μετανάστευσης Oris.

CLDN7

knockdown οδήγησε σε αναπαραγώγιμη αύξηση στη μετανάστευση των κυττάρων και στις δύο κυτταρικές σειρές σε κάθε χρονικό σημείο που εξετάστηκαν (Σχήμα 7Α). Κυττάρων εισβολή στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία θαλάμου Boyden και, όπως φαίνεται στο Σχήμα 7Β, η αναστολή της κλαουδίνης-7 έκφραση σε OVCAR-2 και OVCA420 κύτταρα μείωσε σημαντικά την επεμβατική δυναμικό αυτών των κυττάρων. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση του ρόλου της κλαουδίνης-7 στην εισβολή, κλαουδίνης-7 υπερεκφράζεται σε OV-90 κύτταρα (τα οποία στερούνται ενδογενή έκφραση κλαουδίνης-7) και διαπίστωσε ότι σταθερή υπερέκφραση της πρωτεΐνης αυτής οδήγησε σε αυξημένη εισβολή σε σύγκριση με ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα ή γονική OV-90 κύτταρα (Σχήμα 7C).

Α. δοκιμασίες μετανάστευσης στην OVCAR-2 και OVCA420 κύτταρα. Η μετανάστευση των κυττάρων με

CLDN7

χτυπηθεί κάτω (σκοτεινές ράβδοι) ή κύτταρα ελέγχου (λευκές μπάρες) μετρήθηκε σε διαφορετικά χρονικό σημείο μετά την έναρξη της δοκιμασίας. Β Boyden δοκιμασία εισβολής θάλαμο του OVCAR-2 και OVCA420 κύτταρα με και χωρίς

CLDN7

νοκ ντάουν. Ο αριθμός των εισβάλλοντα κύτταρα μετρήθηκε κάθε ώρα για 6 ώρες. προσδιορισμοί Γ Εισβολή σε ένα μοντέλο του

CLDN7

υπερέκφραση. Δύο σταθερές γραμμές, OV90-CLDN7 και OV90-CiNeo, καθώς και μη επιμολυσμένα μητρικά κύτταρα OV90 χρησιμοποιήθηκαν για να ελέγξετε τις αλλαγές στην εισβολή παρακάτω

CLDN7

υπερέκφραση. Για όλα τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται σε αυτό το σχήμα, τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή +/- S.E.M. Ένας αστερίσκος (*) έδειξε μία τιμή p & lt? 0,05, και ένα διπλό αστερίσκο (**), μια τιμή p & lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι

CLDN7

είναι αυξημένα τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης στους περισσότερους ιστούς με καρκίνο των ωοθηκών και κυτταρικές σειρές. Με ανάλυση Western, πρωτογενείς ιστούς όγκου ωοθήκης παρουσίασαν μεταβλητή έκφραση του κλαουδίνης-7 που κυμαίνεται από μέτρια έως υψηλή έκφραση σε 66%, χαμηλή περιεκτικότητα σε 24%, και μη ανιχνεύσιμη σε δείγματα καρκινικού ιστού 10%. Ο λόγος για αυτή την μεταβλητότητα είναι ασαφής, καθώς η μεταγραφική ρύθμιση του

CLDN7

παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Είναι ενδιαφέρον, υπερμεθυλίωση έχει να εμπλέκεται στην μειορύθμιση του

CLDN7

έκφραση στον καρκίνο του μαστού [17] και των δύο παραγόντων μεταγραφής, από TCF 4 και SOX9, έχουν δειχθεί να συνεργάζονται σε

CLDN7

καταστολή σε κύτταρα του παχέος εντέρου [31]. Δεν είναι γνωστό εάν αυτοί οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην

CLDN7

ρύθμιση στον καρκίνο των ωοθηκών, αλλά αυτές οι δυνατότητες είναι επί του παρόντος υπό διερεύνηση.

Θεωρούμε ότι

CLDN7

είναι αυξημένα σε όλες τις μεγάλες υποτύπων του καρκίνου των ωοθηκών: ορώδες, ενδομητριοειδές, σαφείς κυττάρων και βλεννώδες. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με τα προηγούμενα δεδομένα μικροσυστοιχιών [22], [26] και τα πειράματα IHC [27], [30] δείχνει ότι CLDN7 συνήθως υπερεκφράζεται σε επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών. Πράγματι, μια πρώιμη μελέτη έδειξε ότι κλαουδίνης-7 υπερεκφράζεται σε όλους τους υποτύπους επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών, αλλά δεν overexpresssed σε κορδόνι φύλο και στρωματικών όγκων [23]. Επιπλέον, μια λεπτομερής ανάλυση από Τάσι et al. [24] έδειξε ότι

CLDN7

είναι καθολικά επάνω ρυθμισμένη σε επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών και στα δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης. Η μελέτη μας δείχνει επίσης υπερέκφραση στις πιο κοινές επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών υποτύπους (ορώδης, σαφείς κυττάρων, ενδομητριοειδές, και βλεννώδες) τόσο στο mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας qRT-PCR, IHC, και ανοσοκηλίδωση. Η χρήση ανοσοκηλιδώσεως και qRT-PCR μας επιτρέπει να αποδειχθεί ότι τα επίπεδα mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης δεν είναι πάντα συσχετίζονται, υποδηλώνοντας μετα-μεταφραστική ρύθμιση του κλαουδίνης-7 στον καρκίνο των ωοθηκών.

Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ βρήκαμε ότι οι περισσότεροι κλαουδίνης -7 χρώση ήταν εντοπισμένη στην μεμβράνη, διάφορα δείγματα καρκίνου των ωοθηκών εμφάνισε ισχυρή κυτταροπλασματική χρώση (Σχήμα 1 D). Το γεγονός ότι κλαουδίνης πρωτεΐνες μπορούν να βρεθούν στο κυτταρόπλασμα έχει αναφερθεί και ειδικότερα, στικτή κυτταροπλασματική χρώση κλαουδίνης-7 έχει παρατηρηθεί σε καρκίνο των ωοθηκών [24]. Οι μηχανισμοί και οι αιτίες της κλαουδίνης κυτταροπλασματική εντόπιση παραμένουν ασαφείς, αλλά αρκετές σειρές αποδείξεων υποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση της claudins μπορεί να επηρεάσει τον εντοπισμό τους. Για παράδειγμα, η μετάλλαξη ενός θέση φωσφορυλίωσης ΡΚΑ σε κλαουδίνης-3 έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε αυξημένο κυτταροπλασματικό εντοπισμό σε καρκίνο των ωοθηκών [32]. Ομοίως, κλαουδίνης-4 βρέθηκε να φωσφορυλιωθεί από κινάση πρωτεΐνης C και αυτή η φωσφορυλίωση βρέθηκε να οδηγεί στην μετατόπιση της κλαουδίνης-4 από τη μεμβράνη στο κυτταρόπλασμα και σε μείωση TJ λειτουργία [32]. Κλαουδίνης πρωτεΐνες είναι επίσης γνωστό ότι ρυθμίζονται από παλμιτοϋλίωση, ως κλαουδίνης-14 παλμιτοϋλίωσης έχει δειχθεί ότι είναι κρίσιμη για τη σωστή εντοπισμό του [33]. Προς το παρόν είναι ασαφές κατά πόσον κλαουδίνης-7 μπορεί να τροποποιηθεί και κατά πόσον οι τροποποιήσεις μπορούν να επηρεάσουν τον εντοπισμό του.

Η υπερέκφραση του claudins στον καρκίνο υποδηλώνει ότι claudins θα μπορούσε να έχει λειτουργικό ρόλο στην ογκογένεση. Αρκετές ομάδες έχουν μελετήσει τις πιθανές ρόλους των κλαουδίνης-7 στον καρκίνο. Κλαουδίνης-7 έχει προταθεί ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) [34], πιθανόν μέσω αλληλεπίδρασης με συνδετικό μόριο προσκόλλησης Α (JAM-Α) [35]. Κλαουδίνης-7 έχει επίσης αναφερθεί για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο με EpCAM-τετρασπανίνη που παρεμβαίνει με ιδιότητες προσκόλλησης κυττάρου EpCAM μεσολάβηση και αυξάνει την αντοχή σε απόπτωση [36] – [38]. Πράγματι, σε ορθοκολικό καρκίνωμα, EpCAM και κλαουδίνης-7 βρίσκονται σε σύνδεση με το τετρασπανίνη CD9 ή /και CO-029 και την προαγωγή του σχηματισμού μετάστασης [37]. Επιπλέον, EpCAM-

CLDN7

συγκρότημα προτάθηκε να έχουν ρόλο στη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό, την αντίσταση της απόπτωσης, μετάσταση, και ογκογενετικότητας [37], [39].

Στην προσπάθεια να συγκεντρωθούν πρόσθετα στοιχεία σχετικά με

CLDN7

λειτουργία στον καρκίνο των ωοθηκών, μελετήσαμε μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης μετά από

CLDN7

νοκ ντάουν. Υποθέσαμε ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των

CLDN7

μπορεί να επηρεάσει τα κατάντη οδούς που πλήττονται από αυτήν την πρωτεΐνη και τελικά να οδηγήσει σε αλλαγές της έκφρασης των γονιδίων που ρυθμίζονται από αυτά τα μονοπάτια. Μεταξύ των δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών που μελετήθηκαν, εντοπίσαμε συνολικά 1296 γονιδίων που έχουν μεταβληθεί σημαντικά μετά από

CLDN7

νοκ ντάουν. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, 297 ταυτοχρόνως βρέθηκαν εκφράζονται διαφορικά σε αμφότερες τις γραμμές. Η ανάλυση αυτών των γονιδίων χρησιμοποιώντας Ingenuity Pathway Analysis, οδήγησε στην ταυτοποίηση διαφόρων δικτύων γονιδίου που περιέχει γονίδια που σχετίζονται με τις λειτουργικές κατηγορίες «καρκίνος», «κυτταρικού κύκλου» «κυτταρικό θάνατο», «διακίνηση RNA», «κυτταρική ανάπτυξη», «κύτταρο σηματοδότηση »,« κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό «, και» κυτταρική κίνηση «. Από την Εγκυκλοπαίδεια του Κιότο των γονιδίων και ανάλυση μονοπατιού Γονιδιώματα (KEGG), επιλέξαμε το top 5 μονοπάτια που άλλαξαν σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές OVCAR-2 και OVCA420 και δημιουργείται ένα χάρτη δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης για αυτές τις πορείες. Χρησιμοποιώντας πορεία Studio, βρήκαμε άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των 33 σημαντικά ρυθμίζεται προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένη γονίδια (Πίνακας S6). Το δίκτυο αλληλεπίδραση έδειξε έναν αριθμό γονιδίων που έχουν ογκογόνο ή όγκου ρόλους καταστολέα. Για παράδειγμα, RRAS2, που κωδικοποιούν ένα Ras που συνδέονται με τον μετασχηματισμό ΟΤΡάσης δυναμικό παρόμοιο με Η-, Κ- και N-Ras, είναι ένα πολύ γνωστό ογκογονίδιο και έχει ενοχοποιηθεί στην παθογένεση του καρκίνου στον άνθρωπο. Τα μονοπάτια που διαμεσολαβούν RRAS2 πρόκλησης ογκογένεσης δεν είναι καλά εδραιωμένη, αλλά έχουν φωσφοϊνοσιτίδη 3-κινάσης, p38 MAPK και mTOR οδοί έχουν ενοχοποιηθεί [40]. Ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, RRAS2 και RRAS έχουν δειχθεί ότι προάγει εισβολή μέσω σηματοδότησης ιντεγκρίνης σε επιθηλιακά κύτταρα του μαστού [41].

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι ωοθηκών επιθηλιακά κύτταρα που εκφράζουν κλαουδίνης-3 και -4 δείχνουν αυξημένη διεισδυτικότητα

in vitro

[42], η οποία προκαλείται μέσω της ΜΜΡ-2 υπερέκφραση. Ομοίως, σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, κλαουδίνης-10 έκφραση προωθείται η επιβίωση των κυττάρων, την κινητικότητα και διεισδυτικότητα, ενώ μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης 2 (ΜΜΡ2) ήταν ρυθμισμένη [43]. Ωστόσο claudins έχουν επίσης αποδειχθεί ότι μειώνουν εισβολή ως κλαουδίνης-4 έκφραση συσχετίστηκε με μείωση της ικανότητας εισβολής σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [44]. Μειωμένη έκφραση του κλαουδίνης-7 έχει συσχετιστεί με εισβολή και μετάσταση όγκου σε πλακώδες καρκίνωμα του οισοφάγου και σε καρκίνο του παχέος εντέρου [13], [45]. Σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε ότι

CLDN7

knockdown οδήγησε σε αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με διάφορες λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της μετανάστευσης /εισβολής. Ειδικότερα, σε συνέχεια των αποτελεσμάτων ανάλυσης μονοπατιού, δείξαμε ότι Raf-1, ένα γονίδιο προηγουμένως εμπλέκεται στην κυτταρική μετανάστευση [46], [47], ήταν επάνω ρυθμισμένη εξής

CLDN7

knockdown (Σχήμα 6) . Erk-1 δεν βρέθηκε σημαντικά αυξημένη σε αυτές τις συνθήκες, γεγονός που υποδηλώνει ότι Raf-1 μπορεί να σηματοδοτήσει μέσω άλλων οδών κατάντη σε απάντηση

CLDN7

νοκ ντάουν.

Με βάση τα δεδομένα της έκφρασης μας, στη συνέχεια, διερευνήθηκε οι πιθανοί ρόλοι του

CLDN7

και βρέθηκαν αποτελέσματα για εισβολή και τη μετανάστευση

in vitro

. Πράγματι, η ικανότητα εισβολής ήταν σημαντικά μειωμένη μετά από

CLDN7

νοκ ντάουν και, αντιστρόφως, διαπιστώθηκε αυξημένη μετά από υπερέκφραση του

CLDN7

. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μετανάστευση βρέθηκε να αυξάνεται μετά από

CLDN7

νοκ ντάουν (πιθανώς επειδή η αύξηση της Raf-1), και αυτές οι φαινομενικά αντιφατικές διαπιστώσεις (εισβολή εναντίον της μετανάστευσης) μπορεί να εξηγήσει τις προηγούμενες παρατηρήσεις στον τομέα. Πράγματι, οι ακριβείς ρόλοι των κλαουδίνης για την εισβολή έχουν παραμείνει αμφιλεγόμενη, καθώς ορισμένοι ερευνητές παρατηρούν θετικά αποτελέσματα της claudins στην εισβολή και άλλοι έχουν βρει το αντίθετο. Δεδομένου ότι οι κλαουδίνης πρωτεΐνες γνωστές για την ενεργοποίηση ΜΜΡ [42], [48], αλλά έχουν επίσης ρόλους στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου [9] και στη μετανάστευση (όπως φαίνεται εδώ), το καθαρό αποτέλεσμα που παρατηρείται μπορεί να αντιπροσωπεύει το αποτέλεσμα αυτών των αντίθετα αποτελέσματα επί εισβολή. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ενώ

CLDN7

υπερέκφραση μπορεί να μειώσει τη μετανάστευση, την αύξηση της εισβολής οφείλεται σε άλλους παράγοντες (όπως η αυξημένη ενεργοποίηση MMP) είναι κυρίαρχη και οδηγεί σε μια καθαρή θετική επίδραση στην κυτταρική εισβολή στο σύστημά μας. Οι ακριβείς μηχανισμοί της

CLDN7

ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή είναι υπό έρευνα, αλλά τα δεδομένα μας μπορεί να εξηγήσει ορισμένες από τις διαφορές στη βιβλιογραφία.

Εν κατακλείδι, διαπιστώνουμε ότι

CLDN7

ανυψώνεται στη συντριπτική πλειονότητα των καρκίνων των ωοθηκών. Πραγματοποιήσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών να προσδιοριστούν οι αλλαγές στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με

CLDN7

νοκ ντάουν στον καρκίνο των ωοθηκών. Είναι ενδιαφέρον, διαπιστώσαμε ότι πολλά γονίδια και τα μονοπάτια που επηρεάζονται από

CLDN7

έκφραση εμπλέκονται στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, την ανάπτυξη, και εισβολή. δοκιμασίες εισβολή και τη μετανάστευση απέδειξε σαφή αποτελέσματα της κλαουδίνης-7 στην επεμβατική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. ανάλυση μικροσυστοιχιών μας παρέχει αρκετές πιθανές μηχανισμοί με τους οποίους κλαουδίνης-7 μπορεί να επηρεάσει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, και αυτές οι διαφορετικοί μηχανισμοί βρίσκονται στο στάδιο της έρευνας. Εκτός από την σφιχτή λειτουργία διασταύρωση τους, κλαουδίνης-7 μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο σε έναν αριθμό οδών σηματοδότησης που εμπλέκονται στον καρκίνο, κυτταρική ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, και του κυτταρικού κύκλου. Με δεδομένο το σημαντικό της ρόλο στην ωοθηκών καρκινογένεση,

CLDN7

μπορεί να έχει σημαντικές δυνατότητες σε διαγνωστικές και θεραπευτικές εφαρμογές.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ανθρώπινα ιστοί συλλέχθηκαν μέσω IRB εγκεκριμένο πρωτόκολλο (Medstar Research Institute IRB # 2003-103). Οι ιστοί συλλέχθηκαν ανώνυμα και αυτό το πρωτόκολλο εξαιρούνται από την απαίτηση συναίνεσης.

Γραμμές κυττάρων και δείγματα ιστών

ωοθηκών γραμμές καρκίνου που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, BG-1, UCI-101, HEY, OV90, OVCA420, OVCA432, OVCA433, OVCAR-2, OVCAR-3, OVCAR και-5 έχουν δημοσιευθεί [49] – [51]. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.