Αφηρημένο

Forkhead κουτί M1 (FOXM1) ογκογόνο παράγοντα μεταγραφής αντιπροσωπεύει ένα ελκυστικό θεραπευτικό στόχο για την καταπολέμηση του καρκίνου, επειδή υπερεκφράζεται στην πλειονότητα των ανθρώπινων όγκων. Πρόσφατα, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα δοκιμασίας που βασίζεται σε κύτταρα εντοπίσαμε θειαζόλης αντιβιοτικό Siomycin Α ως αναστολέας της μεταγραφικής δραστικότητας FOXM1. Εδώ, αναφέρουμε ότι δομικά παρόμοιες θειαζόλη αντιβιοτικό, θειοστρεπτόνη επίσης αναστέλλει την μεταγραφική δραστικότητα του FOXM1. Επιπλέον, βρήκαμε ότι αυτά τα thiopeptides δεν αναστέλλει την μεταγραφική δραστικότητα άλλων μελών της οικογένειας Forkhead ή κάποια μη-σχετικών παραγόντων μεταγραφής. Περαιτέρω πειράματα αποκάλυψαν ότι θειαζόλης αντιβιοτικά αναστέλλουν επίσης την έκφραση FOXM1, αλλά όχι την έκφραση άλλων μελών της οικογένειας κουτί Forkhead. Επιπλέον, βρήκαμε ότι οι θειαζόλη αντιβιοτικά ανέστειλε αποτελεσματικά την ανάπτυξη και την επαγόμενη ισχυρός απόπτωση σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές διαφορετικής προέλευσης. Θειοπεπτιδίου απόπτωση συσχετίζεται με την καταστολή της έκφρασης FOXM1, ενώ η υπερέκφραση του FOXM1 μερικώς προστατευμένου καρκινικά κύτταρα από το θειαζόλιο κυτταρικό θάνατο αντιβιοτικό μεσολάβηση. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Siomycin Α και θειοστρεπτόνης μπορεί ειδικώς στοχεύουν FOXM1 να διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα και αναστολείς FOXM1 /θειαζόλης αντιβιοτικά θα μπορούσαν να αναπτυχθούν ενδεχομένως ως νέα αντικαρκινικά φάρμακα κατά της ανθρώπινης νεοπλασίας

Παράθεση:. Bhat UG, Halasi Μ, Gartel AL (2009) θειαζόλη Αντιβιοτικά Target FOXM1 και επάγουν απόπτωση σε κύτταρα ανθρώπινου Cancer. PLoS ONE 4 (5): e5592. doi: 10.1371 /journal.pone.0005592

Επιμέλεια: Μιχαήλ Β Blagosklonny, Ordway Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 Μάρτη του 2009? Αποδεκτές: 14η Απριλίου του 2009? Δημοσιεύθηκε: 18η Μαΐου, 2009

Copyright: © 2009 Bhat et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις NIH 1RO1CA1294414-01A1 και 1R21CA134615-01, και IDPH εισιτηρίων για τη θεραπεία Ερευνών Grant να ALG. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

κουτί Forkhead M1 (FOXM1) [1], ένας παράγοντας μεταγραφής της οικογένειας Forkhead [2] είναι ένα από τα βασικά θετικά ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου. Τόσο η έκφραση και η μεταγραφική δραστικότητα του FOXM1 συνδέεται με την πολλαπλασιαστική κατάσταση των κυττάρων [1]. Εκφράζεται σε όλους τους εμβρυϊκούς ιστούς και στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα επιθηλιακής και μεσεγχυματικής προέλευσης [3], [4]. FOXM1 παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος [5] και απαιτείται για hepatoblast διαφοροποίηση προς χολικά επιθηλιακά κυτταρικών γραμμών [6] και για την εμβρυϊκή ανάπτυξη του πνευμονικό αγγειακό σύστημα [7]. έκφραση FOXM1 επίσης επάγεται κατά την διάρκεια του πνεύμονα και του ήπατος αναγέννηση και επιδιόρθωση ιστών. Η μεταγραφική δραστικότητα του FOXM1 εξαρτάται από ογκογόνους Ras μονοπάτια-ΜΑΡΚ και Sonic Hedgehog [8], [9]. FOXM1 ρυθμίζει προς τα πάνω μεταγραφικά γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και είναι κρίσιμης σημασίας για G1 /S και G2 /M μετάπτωσης, και επίσης για την εκτέλεση της μιτωτικής πρόγραμμα επειδή FOXM1 εξαντλημένο κύτταρα αποτυγχάνουν να προχωρήσουν πέρα ​​από το πρόφαση στάδιο της μίτωσης [10] .

Ενώ FOXM1 είναι ένα από τα πιο υπερεκφρασμένης γονίδια στο ανθρώπινο συμπαγείς όγκους (που επισκοπείται στο [11], [12]), η έκφραση του είναι απενεργοποιημένος σε τερματικά διαφοροποιημένους, μη διαιρούμενα κύτταρα [1]. FOXM1 υπερεκφράζεται σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [13], παγκρεατικό καρκίνωμα [14], καρκίνους του μαστού [15], [16], μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [17], αναπλαστικό αστροκυτώματα και γλοιοβλαστώματα [18], καρκινωμάτων των βασικών κυττάρων [9] και ενδοηπατική χολαγγειωμάτων [19]. Δεδομένου ότι η λειτουργία του FOXM1 αναστέλλεται από διάφορους καταστολείς όγκου, όπως ρ19-ARF, pRb, ρ16 και ρ53 και ενεργοποιούνται από πολλαπλές οδούς ογκογόνο σηματοδότηση, FOXM1 μπορεί να ταξινομηθεί ως πρωτο-ογκογονίδιο. Η αναστολή της έκφρασης FOXM1 από μικρά παρεμβαλλόμενα RNA [20], [21] ή από ένα πεπτίδιο που περιέχει αμινοξέα 24-46 του ρ19

ARF [22], [23] μειωμένη ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων in vitro και καθυστερεί όγκο ήπατος ανάπτυξη σε ποντικούς. Παρομοίως, η καταστολή της FOXM1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα με παρεμβολή RNA οδήγησε στην αναστολή του μεταστατικού δυναμικού τους [24]. Αυτές οι μελέτες έχουν δείξει ότι η FOXM1 είναι απαραίτητα για τη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων και η αναστολή της μπορεί να εμποδίσει την ανάπτυξη του καρκίνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η στόχευση FOXM1 με μικρά μόρια μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα στρατηγική για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων [25], [26], [27] , [28].

Προηγουμένως, χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ελέγχου που βασίζεται σε κύτταρα που αναπτύχθηκε από το εργαστήριο μας, εντοπίσαμε ένα θειοπεπτιδίου, Siomycin Α (NSC-285116) ως ένας ισχυρός αναστολέας της FOXM1 [25]. Επιπλέον, δείξαμε ότι Siomycin Α και ένα άλλο παρόμοιο θειαζόλη αντιβιοτικό, θειοστρεπτόνη, η οποία έχει ήδη εγκριθεί από την FDA για χρήση σε ζώα, αναστέλλουν FOXM1 και επάγουν απόπτωση σε κύτταρα μελανώματος [26], [29]. Εδώ, αποδείξαμε ότι θειαζόλης αντιβιοτικά, Siomycin Α και θειοστρεπτόνης αναστέλλουν FOXM1 μεταγραφική δραστικότητα και έκφραση. Βρήκαμε επίσης άμεση συσχέτιση μεταξύ της καταστολή της έκφρασης FOXM1 και διέγερση απόπτωσης από τους thiopeptides σε διαφορετικές ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι FOXM1 θα μπορούσε να προστατεύσει έναντι κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από τις θειαζόλη αντιβιοτικά, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα φάρμακα μπορεί να ασκήσει μερικώς αντικαρκινική δράση τους μέσω της καταστολής της FOXM1.

Αποτελέσματα

Πρόσφατα, λάβαμε απόδειξη ότι μια άλλη θειαζόλη αντιβιοτικό, θειοστρεπτόνη, η οποία διαφέρει δομικά από Siomycin Α μόνο κατά 2 υπολείμματα (Εικ. 1Α) διαθέτει αντικαρκινική [30] και τις ιδιότητες αντι-FOXM1 [29] που είναι παρόμοια με Siomycin A. για να αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της θειοστρεπτόνη επί FOXM1 μεταγραφική δραστικότητα και επίσης να μελετήσει πώς οι θειαζόλη αντιβιοτικά επηρεάζουν την μεταγραφική δραστικότητα των άλλων μελών της οικογένειας Forkhead, αναπτύξαμε την κυτταρική γραμμή C3-Luc2.3-FoxO1. κύτταρα C3-Luc2.3-FoxO1 είναι ένα παράγωγο του κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS με δοξυκυκλίνη επαγώγιμο πρωτεΐνη FOXM1-GFP σύντηξη [25], ένα ταμοξιφένη επαγόμενο ουσιαστικά δραστική FoxO1 (ΑΑΑ) -er πρωτεΐνης σύντηξης και ένα FOXM1 /FoxO1 εξαρτώμενη λουσιφεράσης πυγολαμπίδα. Σε αυτό το σύστημα, ήμασταν σε θέση να επάγει επιλεκτικά είτε FOXM1 μεταγραφική δραστηριότητα με την προσθήκη ντοξυκυκλίνης ή μεταγραφικής δραστηριότητας FoxO1 με την προσθήκη της ταμοξιφαίνης. Πρώτον, για να δοκιμάσει πόσο θειοστρεπτόνη επηρεάζει FOXM1 μεταγραφική δραστικότητα σε σύγκριση με Siomycin Α, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα συνδυασμό δοξυκυκλίνη και τα θειαζολίου αντιβιοτικά και 16 ώρες αργότερα η δράση της λουσιφεράσης μετρήθηκε. Βρήκαμε ότι η καταστολή της μεταγραφικής δραστικότητας FOXM1 με θειοστρεπτόνη είναι συγκρίσιμη με εκείνη του Siomycin Α (σχ. 1Β), υποδεικνύοντας ότι και οι δύο θειαζόλη αντιβιοτικά αναστέλλουν FOXM1 μεταγραφική δραστικότητα. Στη συνέχεια, για να προσδιοριστεί κατά πόσον οι θειαζόλη αντιβιοτικά αναστέλλουν την μεταγραφική δραστικότητα άλλων μελών της οικογένειας Forkhead όπως FoxO1 [31], υποβάλλαμε σε αγωγή της κυτταρικής γραμμής C3-Luc2.3-FoxO1 με ένα συνδυασμό της ταμοξιφαίνης και των thiopeptides. Βρήκαμε ότι η προσθήκη της ταμοξιφαίνης οδήγησε στην επαγωγή της δραστικότητας λουσιφεράσης FoxO1-εξαρτώμενη, αλλά η θεραπεία με τα αντιβιοτικά θειαζόλης δεν μείωσε την τιμή αυτή (Εικ. 1Β). Δεδομένου ότι όλα τα μέλη του μετοχικού της οικογένειας Forkhead συντηρημένη Forkhead /φτερωτό-έλικα περιοχή δέσμευσης DNA που είναι υπεύθυνη για τη σύνδεση με τη συναίνεση sites, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι οι thiopeptides δεν στοχεύουν αυτόν τον τομέα και μπορούν να ρυθμίζουν αρνητικά μόνο FOXM1, αλλά όχι άλλες Forkhead μέλη της οικογένειας

(Α) Η χημική δομή της θειαζόλης αντιβιοτικό, θειοστρεπτόνη που διαφέρει από Siomycin Α με μόνο δύο υπολείμματα (θειοστρεπτόνη-R1-R2:. Ισολευκίνη-αλανίνης? Siomycin- R1-R2: βαλίνη δεϋδροαλανίνη). (Β) Luciferase δοκιμασίες μετά την επεξεργασία της κυτταρικής σειράς C3-Luc2.3-FoxO1 με τον συνδυασμό είτε 1 μg /mL δοξυκυκλίνη (Doxy) ή 300 ταμοξιφένη ηΜ (Tam) και 3 μΜ Siomycin Α (Sio) ή θειοστρεπτόνη ( Tio), αντίστοιχα αποκάλυψε ότι θειοστρεπτόνη είναι επίσης ένας αρνητικός ρυθμιστής του FOXM1 μεταγραφικής δραστικότητας και θειαζόλη αντιβιοτικά αναστέλλουν FOXM1 μεταγραφική δραστηριότητα μεταξύ των μελών της οικογένειας Forkhead. (C) θειαζόλη αντιβιοτικά μειωτικά επίπεδα πρωτεΐνης FOXM1, αλλά όχι τα επίπεδα FoxA1, FoxO1 και FOXO3a όπως ανιχνεύθηκε με ανοσοστύπωμα. (Δ) Η κυτταρική σειρά HCT116-p53RE-Luc, τα οποία εκφράζουν σταθερά λουσιφεράση πυγολαμπίδας υπό τον έλεγχο των πολλαπλών στοιχείων απόκρισης της ρ53 σε επεξεργασία με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση του Siomycin Α ή θειοστρεπτόνη. Μετά από ολονύκτια κατεργασία μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης. (Ε) SW480 του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά καρκίνου διαμολύνθηκε παροδικά με ΕΣΦ /Lef εξαρτώμενη TOPFlash και τον έλεγχο FOPFlash κατασκευάσματα. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ Siomycin Α ή θειοστρεπτόνη. Την επόμενη ημέρα μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης. (F) του καρκίνου του πνεύμονα Α549 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το GLI-εξαρτώμενη GLIBS-Luc, ο έλεγχος miniTK κατασκευάσματα ανταποκριτή και του πλασμιδίου έκφρασης GLI. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υποδεικνυόμενη συγκέντρωση των thiopeptides 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και η δράση της λουσιφεράσης μετρήθηκε την επόμενη ημέρα. Μπαρ στο Β, D-F είναι αντιπροσωπευτικές μέσες τιμές των πειραμάτων εις τριπλούν +/- SD.

Η

Σε προηγούμενες εκθέσεις μας βρήκαμε απροσδόκητα ότι Siomycin Ένα όχι μόνο μειωτικά μεταγραφική δραστηριότητα FOXM1, αλλά μείωσε επίσης το mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης FOXM1 [25], [29]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι ρυθμίζει προς τα κάτω θειοστρεπτόνη επίσης τα επίπεδα πρωτεΐνης FOXM1 σε παρόμοιο βαθμό να Siomycin Α (Εικ. 1 C). Επιπλέον, βρήκαμε ότι οι θειαζόλη αντιβιοτικά δεν μειώνουν τα επίπεδα πρωτεΐνης των άλλων μελών της οικογένειας Forkhead όπως FoxA1, FoxO1 και FOXO3a (Εικ. 1C), υποστηρίζοντας περαιτέρω την ιδέα ότι θειαζόλη αντιβιοτικό Siomycin Α και θειοστρεπτόνης είναι ειδικοί αναστολείς του FOXM1. Για να διερευνηθεί περαιτέρω το δυναμικό εξειδίκευση των αντιβιοτικών για FOXM1 εξαρτώμενη μεταγραφή, δοκιμάσαμε πώς Siomycin Α και θειοστρεπτόνης επηρεάζουν την μεταγραφική δραστικότητα άλλων παραγόντων μεταγραφής όπως ρ53, Tcf /Lef και GLI. Για το σκοπό αυτό, η κυτταρική σειρά HCT116-p53RE-Luc (με άγριου τύπου ρ53 και πολλαπλά στοιχεία απόκρισης ρ53 ανοδικά του γονιδίου της λουσιφεράσης), κυτταρική σειρά καρκίνου SW480 του παχέος εντέρου (παροδικά επιμολυσμένα με ΕΣΦ /Lef εξαρτώμενη TOPFlash κατασκεύασμα [32] ? Ένα δώρο από τον Dr. Randall Σελήνη) και Α549 πνεύμονα καρκινικά κύτταρα (παροδικά επιμολυσμένα με τα GLI-εξαρτώμενη GLIBS-Luc κατασκεύασμα ανταποκριτή και του πλασμιδίου έκφρασης GLI? δώρα από τον Dr. David Robbins) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Siomycin Α ή θειοστρεπτόνης και λουσιφεράσης δραστικότητα μετρήθηκε 16 ώρες μετά τη θεραπεία. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με αντιβιοτικά δεν μείωσε p53, Tcf /Lef ή GLI- εξαρτώμενη μεταγραφή (σχ. 1D-F). Ωστόσο, περαιτέρω πειράματα μας έδειξαν ότι οι θειαζόλιο αντιβιοτικά επηρεάζουν επίσης δραστικότητα ΝΡ-κΒ, αλλά όχι τη δραστικότητα άλλων παραγόντων μεταγραφής που μελετήθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για την αξιολόγηση της αντικαρκινικής δυναμικό των θειαζόλης αντιβιοτικών αναλύσαμε τους αποτελέσματα επί ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών διαφορετικής προέλευσης που έπρεπε αυξημένο επίπεδο έκφρασης FOXM1. Πρώτον, ερευνήσαμε εάν η εξωγενής ή ενδογενής οδός αποπτωτικά εμπλέκεται στην θειοπεπτιδίου επαγόμενη απόπτωση. Εμείς αγωγή κασπάσης-8 με ανεπάρκεια και ανασυσταθεί κυτταρικές σειρές νευροβλαστώματος NB7 με αντιβιοτικά για 24 ώρες (Εικ. 2Α). Βρήκαμε ότι οι κασπάσης-8 με ανεπάρκεια NB7 κύτταρα που δεν μπορούν να υποστούν απόπτωση εξωγενή ήταν σχεδόν τόσο ευαίσθητοι στις thiopeptides ως ανασυσταθεί κύτταρα NB7 με ενεργό κασπάση-8, υποδηλώνοντας ότι η θειοπεπτιδίου επαγόμενη απόπτωση περιλαμβάνει κυρίως την εγγενή αποπτωτική παθολογική οδό.

(Α) Κατεργασία της κασπάσης-8 με ανεπάρκεια και ανασυσταθεί NB7 νευροβλαστώματος κυτταρικές σειρές με τις θειαζόλης αντιβιοτικά αποκάλυψε ότι θειοπεπτιδίου επαγόμενη απόπτωση συνίσταται κυρίως στη ενδογενούς οδού αποπτωτικά. (Β) καρκινικές κυτταρικές σειρές λευχαιμίας CEM [IC

50 /μΜ: Sio-0,73 (0,08)? Θειο-1.47 (0.1)], HL60 [IC

50 /μΜ: Sio-0,68 (0,06)? Θειο-1.78 (0,4)] και 937 [IC

50 /μΜ: Sio-0,53 (0,1)? Θειο-0,73 (0,3)], και κυτταρικές σειρές καρκίνου του ήπατος Hep-3Β [IC

50 /μΜ: Sio-3,6 (1,3)? Θειο-2.3 (0.8)], Huh7 [IC

50 /μΜ: Sio-2,3 (0,5)? Θειο-1,8 (0,2)], και SK-Hep [IC

50 /μΜ: Sio-3,7 (0,4)? Θειο-6,0 (1,4)], έδειξαν ευαισθησία σε χαμηλό εύρος micromolar στους θειαζολίου αντιβιοτικά όπως προσδιορίζεται από αναλύσεις αναστολής της ανάπτυξης. (C-D) Siomycin Α και θειοστρεπτόνης αναστέλλουν την έκφραση FOXM1 και επάγουν ισχυρή απόπτωση σε λευχαιμία και καρκίνο του ήπατος κύτταρα.

Η

Για να εκτιμηθεί ποσοτικά ο βαθμός ευαισθησίας των διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών στους θειαζόλη αντιβιοτικά Siomycin Α και θειοστρεπτόνης πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς αναστολής της ανάπτυξης σε διάφορες λευχαιμίας (CEM, HL60, U937) και ήπατος (Hep-3Β, Huh7, SK-Hep) καρκινικά κύτταρα. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με διαφορετικές συγκεντρώσεις των αντιβιοτικών για 48 ώρες και την έκταση της αναστολής της ανάπτυξης προσδιορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των ζωντανών κυττάρων (Σχ. 2Β). Όλες οι κυτταρικές γραμμές που εμφανίζονται IC

’50 στη χαμηλή μικρομοριακή περιοχή, υποδηλώνοντας ότι αυτά τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα είναι αρκετά ευαίσθητα στις thiopeptides. Επιπλέον, αξιολογήσαμε την αποπτωτική απόκριση σε Siomycin Α και θειοστρεπτόνης σε αυτά τα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με ανοσοκηλίδωση για διασπασμένης κασπάσης-3. Βρήκαμε ότι τόσο Siomycin Α και θειοστρεπτόνης καταστέλλουν έκφραση πρωτεΐνης FOXM1, και διεγείρει απόπτωση σε αυτά λευχαιμία και καρκίνο του ήπατος κύτταρα (Σχ. 2C, D). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω συμπέρασμα μας είναι ότι θειαζόλη αντιβιοτικά, όχι μόνο ανταγωνίζεται την ικανότητα διενεργοποίηση της FOXM1, αλλά επίσης αναστέλλουν την έκφραση του, λόγω της FOXM1 θετικής ανάδρασης [33]. Επιπλέον, παρατηρήσαμε άμεσος συσχετισμός μεταξύ καταστολής FOXM1 και διάσπαση της κασπάσης-3 (σήμα κατατεθέν της απόπτωσης) μετά από θεραπεία με τις ενώσεις αυτές. Η στενή σχέση μεταξύ FOXM1 καταστολή και διέγερση απόπτωσης υποδηλώνει ότι οι thiopeptides μπορούν να ασκήσουν προ-αποπτωτικών δράση τους τουλάχιστον εν μέρει μέσω της αναστολής της FOXM1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα.

Για να ερευνηθεί ο πιθανός ρόλος του FOXM1 στην θειοπεπτιδίου μεσολάβηση απόπτωση, υποβάλλαμε σε αγωγή U2OS κύτταρα οστεοσαρκώματος με 10 μΜ Siomycin Α και συλλέχθηκαν τα κύτταρα σε διαφορετικά χρονικά σημεία (Εικ. 3Α). Βρήκαμε σημαντική μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης FOXM1 συντομότερο 18 ώρες, η οποία συσχετίζεται με την εμφάνιση ισχυρών διασπασμένη κασπάση 3 ζώνες. Παρατηρήσαμε επίσης συσχέτιση μεταξύ ισχυρότερη μειορρύθμιση του FOXM1 και πιο έντονη απόπτωση μετά από αγωγή 24 ώρες με θειοστρεπτόνη παρουσία του κυκλοεξαμίδιο γνωστό αναστολέα μεταφράσεως (Chx) σε σύγκριση με ατομική αγωγή με τα φάρμακα, υποδεικνύοντας και πάλι ότι η καταστολή του FOXM1 μπορεί να απαιτείται για την θειοπεπτιδίου επαγόμενη απόπτωση (Σχ. 3Β). Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο της FOXM1 στην θειοπεπτιδίου-απόπτωση χρησιμοποιήσαμε το C3 γραμμή κυττάρων [25]. έκφραση FOXM1 προκλήθηκε με την προσθήκη της δοξυκυκλίνης και την επόμενη ημέρα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θειοστρεπτόνη και κυκλοεξαμίδιο για 24 ώρες (Σχ. 3C). Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση του ενδογενούς FOXM1 μειώθηκε σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο μετά την αγωγή, ενώ δεν επηρεάζεται το επίπεδο του εξωγενούς FOXM1 (Σχ. 3C). Βρήκαμε επίσης ότι η υπερέκφραση του FOXM1 προστατεύονται έναντι κυτταρικού θανάτου που επάγεται από θειοστρεπτόνη όπως ανιχνεύεται με ανοσοαποτύπωση για διασπασμένης κασπάσης-3 (Σχ. 3C). Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι μειορύθμιση FOXM1 μπορεί να συμβάλει στην θειοπεπτιδίου απόπτωση. Ομοίως, βρήκαμε ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν C3 FOXM1 ήταν ανθεκτικά στη θεραπεία με Siomycin Α όπως αναλύθηκε με ανοσοστύπωση για διασπασμένη κασπάση-3 (Σχ. 3D). Επιπλέον πειράματα αποκάλυψαν ότι η υπερέκφραση του FOXM1 προστατεύει επίσης έναντι Siomycin Α-επαγόμενη απόπτωση υπό την παρουσία κυκλοεξαμίδιο (Σχ. 3Ε). Στο σύνολό τους, όλα αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι μπορεί να απαιτείται ρύθμιση προς τα κάτω του FOXM1 από Siomycin Α και θειοστρεπτόνης για την θειοπεπτιδίου επαγόμενη απόπτωση.

(Α) ανάλυση ανοσοστυπώματος μετά από θεραπεία με Siomycin Α αποκάλυψε στενή συσχέτιση μεταξύ μειορρύθμιση του FOXM1 και επαγωγή της απόπτωσης. (Β) Μετά την αγωγή με θειοστρεπτόνη, θειοπεπτιδίου επαγόμενη απόπτωση και αναστολή της έκφρασης πρωτεΐνης FOXM1 είναι περισσότερο εμφανές στην παρουσία του κυκλοεξαμίδιο (Chx) όπως απεικονίζεται με ανοσοκηλίδωση για FOXM1 και διασπασμένη κασπάση-3. (Γ) Η έκφραση του ενδογενούς FOXM1 μειώθηκε σε ένα εξαρτώμενο από το χρόνο τρόπο παρουσία θειοστρεπτόνης και Chx, ενώ δεν επηρεάζεται το επίπεδο του εξωγενούς FOXM1. Η υπερέκφραση του FOXM1 προστατεύονται έναντι κυτταρικού θανάτου που επάγεται από θειοστρεπτόνη όπως ανιχνεύεται με ανοσοαποτύπωση για διασπασμένης κασπάσης-3. (D) FOXM1 κύτταρα που υπερεκφράζουν ήταν ανθεκτικά στη θεραπεία με αυξανόμενη ποσότητα Siomycin Α όπως αναλύθηκε με ανοσοστύπωση για διασπασμένης κασπάσης-3. (Ε) Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως απεκάλυψε ότι η υπερέκφραση του FOXM1 προστατεύονται επίσης έναντι Siomycin Α-επαγόμενη απόπτωση υπό την παρουσία Chx.

Η

Συζήτηση

Προηγουμένως, αναφέραμε ότι θειαζόλης αντιβιοτικά Siomycin A [ ,,,0],25] και θειοστρεπτόνη [29] αναστέλλουν FOXM1 και διεγείρουν απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι οι θειαζόλη αντιβιοτικά αναστέλλουν FOXM1 μεταγραφική δραστικότητα, μπορούν επίσης να ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση FOXM1 και προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε νευροβλάστωμα, λευχαιμία και καρκίνο του ήπατος κύτταρα. Είναι γνωστό ότι οι θειαζόλη αντιβιοτικά διεξάγουν αντιβακτηριακή δράση τους με αναστολή βακτηριακής μετάφραση μέσω αλληλεπίδρασης με το ριβοσωμικό RNA 23S, αλλά δεν αποκλείουν τη σύνθεση ευκαρυωτικής πρωτεΐνης [34]. Ο ακριβής μηχανισμός αναστολής της μεταγραφικής δραστικότητας FOXM1 μένει να διευκρινιστεί, αλλά δεν σχετίζεται με την ικανότητά τους να αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε επίσης ότι θειαζόλης αντιβιοτικά καταστέλλουν όχι μόνο τη μεταγραφική δραστηριότητα, αλλά και την έκφραση του FOXM1 (Εικ. 1, 2), γεγονός που υποδηλώνει ότι FOXM1 μπορεί θετικά ρυθμίζουν οι ίδιοι την μεταγραφή του [33].

Εδώ, βρήκαμε ότι θειαζολο αντιβιοτικό επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα διαφορετικής προέλευσης συσχετίστηκε με τη μειορρύθμιση του FOXM1 (Εικ. 2, 3). Οι thiopeptides ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων με παρόμοιες IC

50 και κυτταρικό θάνατο που επάγεται με συγκρίσιμες συγκεντρώσεις σε τόσο διαφορετικές τύπους κυττάρων όπως νευροβλάστωμα, λευχαιμία και ηπατώματος (Εικ. 2). Από τη στιγμή που έχουν ήδη αναφερθεί ότι η Siomycin Α και στόχος θειοστρεπτόνης FOXM1, αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυττάρων και επάγουν απόπτωση σε κύτταρα μελανώματος [29], τα δεδομένα αυτά επιβεβαιώνουν περαιτέρω ότι θειαζόλης αντιβιοτικά μπορεί να επηρεάσει μία ευρεία ποικιλία ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, δείξαμε ότι η υπερέκφραση του FOXM1 θα μπορούσαν να προστατεύσουν τα καρκινικά κύτταρα έναντι θειοπεπτιδίου-απόπτωση (Σχ. 3C, D, E). Δεδομένου ότι τα αντιβιοτικά θειαζόλη καταστέλλουν την έκφραση και τη δραστικότητα του FOXM1 και συγχρόνως FOXM1 υπερέκφραση προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα από Siomycin Α και τοξικότητα θειοστρεπτόνης, FOXM1 μπορεί να είναι ένας έγκυρος στόχος του θειαζολίου απόπτωσης αντιβιοτικού που προκαλείται. Πρόσφατα, Kwok et. al. έδειξε ότι θειοστρεπτόνης καταστέλλει έκφραση FOXM1 και επάγει την απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [35]. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω παρόντα αποτελέσματα μας και τα ευρήματα των προηγούμενων εκδόσεων μας ότι θειαζόλη αντιβιοτικά, Siomycin A [25], και θειοστρεπτόνη [29] επάγουν απόπτωση και να καταστέλλουν έκφραση FOXM1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, αυτή η ομάδα δεν συνδέουν καταστολή της έκφρασης FOXM1 στην αναστολή της μεταγραφικής δραστικότητας του από θειοστρεπτόνη [35]. Επιπλέον, ισχυρίζονται ότι μόνο ουσιαστικά δραστική, αλλά όχι άγριου τύπου FOXM1, μπορεί να αναστέλλει θειοστρεπτόνη αντιπολλαπλασιαστική δραστηριότητα [35]. Περαιτέρω πειράματα που απαιτούνται για την επίλυση αυτών των διαφορών.

Εν ολίγοις, έχουμε αποδείξει ότι θειαζόλης αντιβιοτικά Siomycin Α και θειοστρεπτόνης είναι ισχυροί αναστολείς της μεταγραφικής δραστηριότητας FOXM1 και της έκφρασης. Επιπλέον, επάγουν προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα διαφορετικής προελεύσεως. Ο βαθμός της απόπτωσης που προκαλείται από τα thiopeptides συσχετίζεται με την καταστολή της FOXM1, ενώ η υπερέκφραση του άγριου τύπου FOXM1 μερικώς προστατευμένο καρκινικά κύτταρα από θειοπεπτιδίου επαγόμενη απόπτωση. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι η αναστολή της FOXM1 από Siomycin Α και θειοστρεπτόνης σε κάποιο βαθμό είναι υπεύθυνη για τον θάνατο των κυττάρων που προκαλείται από τα θειαζόλη αντιβιοτικά. Τα πειράματα που περιγράφονται σε αυτό το χειρόγραφο υποστήριξη προηγούμενες εκθέσεις μας [25], [26], [27], [29] ότι FOXM1 είναι ένας κατάλληλος στόχος για αντικαρκινικά φάρμακα και ότι θειαζόλης αντιβιοτικά θα μπορούσαν να αποτελέσουν υποσχόμενες εναλλακτικές λύσεις για να χρησιμοποιείται σήμερα αντικαρκινικές θεραπείες.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές, τα μέσα ενημέρωσης και τις χημικές ενώσεις

U2OS κύτταρα οστεοσαρκώματος? κύτταρα C3 [22], ένα U2OS κλώνος C3 κυτταρική γραμμή με πρωτεΐνη σύντηξης FOXM1-GFP δοξυκυκλίνη διεγέρσιμο? U2OS προέρχεται C3-Luc2.3-FoxO1 οστεοσάρκωμα, που εκφράζουν σταθερά το δοξυκυκλίνη επαγόμενο FOXM1-GFP [25], η ταμοξιφένη επαγώγιμο FoxO1 (ΑΑΑ) -er πρωτεΐνη σύντηξης και λουσιφεράση πυγολαμπίδας υπό τον έλεγχο των πολλαπλών στοιχεία απόκρισης FOXM1 /FoxO1? HCT116-p53RE-Luc κόλου, που εκφράζουν σταθερά λουσιφεράση πυγολαμπίδας υπό τον έλεγχο ενός υποκινητή με πολλαπλά στοιχεία απόκρισης ρ53 (p53RE)? κυτταρικές σειρές καρκίνου του ήπατος Α549 πνεύμονα και Huh7, Hep3B και SK-Hep αναπτύχθηκαν σε μέσο DMEM (Invitrogen). SW480 του παχέος εντέρου, της κασπάσης-8 ανεπάρκεια και ανασυσταθεί νευροβλάστωμα NB7 (πλούσια δώρα από την Δρ Τζιλ Μ Λάχτι, Έρευνας Νοσοκομείο St. Jude Παιδική, Μέμφις), CEM, HL60 και U937 κυτταρικές σειρές καρκίνου λευχαιμίας αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) . Σε όλες τις περιπτώσεις τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Atlanta Biologicals) και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (GIBCO) και τις κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. Θειαζόλης αντιβιοτικά Siomycin Α (NCI) και θειοστρεπτόνη (Sigma) διαλύθηκαν σε DMSO (διμεθυλοσουλφοξείδιο), ταμοξιφένη (Sigma) σε αιθανόλη, δοξυκυκλίνη (Clontech) σε PBS και κυκλοεξαμίδιο (Sigma) σε DMSO.

κατασκευάσματα και επιμολύνσεις

Η Super8xTOPFlash και του ελέγχου Super8xFOPFlash πλασμίδια αναφοράς ήταν πλούσια δώρα από τον Dr. Randall Τ Moon (University of Washington, Seattle, WA). Το πλασμίδιο έκφρασης SRαGLI1 και το GLI-BS-Luc, miniTK κατασκευάσματα δημοσιογράφος ήταν ευγενικό δώρα από τον Δρ David J. Robbins (Dartmouth Medical School, Ανόβερο, ΝΗ). Παροδικές διαμολύνσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

Τα καρκινικά κύτταρα διαφορετικής προέλευσης κατεργασία όπως ανεφέρθη συλλέχθηκαν και λύθηκαν με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος ΙΡ ( 20 mM HEPES, 1% Triton Χ-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM othrovanadate νάτριο, 0.2 mM PMSF συμπληρωμένο με δισκίο αναστολέα πρωτεάσης (Roche Applied Sciences)) . Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε από την Bio-Rad αντιδραστήριο Protein Assay (Bio-Rad). Απομονωμένα πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 8% ή 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Millipore). Η ανοσοκηλίδωση διεξήχθη όπως περιγράφεται στο 34, 35 με αντισώματα ειδικά για FOXM1 (ένα δώρο από τον Dr. εργαστήριο Costa του), FoxA1 (ένα δώρο από τον Dr. εργαστήριο Costa του), FoxO1 (Cell Signaling), FOXO3a (Upstate), που διασπάται caspase- 3 (Cell Signaling) και β-ακτίνης (Sigma).

δοκιμασίες λουσιφεράσης

κύτταρα C3-Luc2.3-FoxO1 αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία επί μία νύκτα με το συνδυασμό είτε 1 μg /mL δοξυκυκλίνη ή 300 ηΜ ταμοξιφένης και 3 μΜ Siomycin Α ή θειοστρεπτόνη. Επίσης, η κυτταρική σειρά HCT116-p53RE-Luc αναπτύχθηκε σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3 μΜ Siomycin Α ή θειοστρεπτόνη επί 16 ώρες. Επιπλέον, καρκίνου παχέος εντέρου SW480 γραμμή αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων παροδικά επιμολυσμένα με τον TOPFlash και ο FOPFlash κατασκευάσματα. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ Siomycin Α ή θειοστρεπτόνη. Την επόμενη μέρα η δραστικότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με την Bio-Rad αντιδραστήριο Protein Assay (Bio-Rad) χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση. Α549 καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα αναπτύσσονται σε πλάκες 6 φρεατίων συνδιαμολύνθηκαν παροδικά είτε με το GLI-εξαρτώμενη GLIBS-Luc ή του ελέγχου miniTK κατασκευάσματα ανταποκριτή, το πλασμίδιο έκφρασης GLI και pRL-null (Promega) που εκφράζει λουσιφεράση της Renilla. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ Siomycin Α ή θειοστρεπτόνη 24 ώρες μετά την επιμόλυνση και η δράση της λουσιφεράσης μετρήθηκε με το Σύστημα Dual-Luciferase Reporter Assay (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή της επόμενης ημέρας.

Ευχαριστίες

Αυτό το χειρόγραφο είναι αφιερωμένο στη μνήμη του Δρ Robert H. Κόστα. Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ Randall Moon (University of Washington, Seattle) για την TOPFlash και τα πλασμίδια FOPFlash, ο Δρ Ντέιβιντ Robbins (Dartmouth Medical School, Ανόβερο) για την παροχή των GLI τελεστή και δημοσιογράφος πλασμίδια. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Δρ Jill M. Lahti (Νοσοκομείο Έρευνας Αγίου Jude Παιδική, Μέμφις) για τις ελλιπείς και να ανασυσταθεί κυτταρικές σειρές NB7 νευροβλάστωμα κασπάσης-8. Ευχαριστούμε τον Δρ Angela Tyner (Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Σικάγο) και ο Δρ Senthil Radhakrishnan (Caltech, Pasadena) για την ανάγνωση του χειρογράφου και για τα πολύτιμα σχόλιά τους. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω τον Δρ Nissim Hay (Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Σικάγο) για την παροχή των αντισωμάτων FoxO1 και FOXO3a, καθώς και για χρήσιμες προτάσεις του.