Αφηρημένο

Αναδιοργάνωση κυτταροσκελετού μέσω αναδιαμόρφωσης της ακτίνης είναι ένα βασικό βήμα της κυτταρικής μετακίνησης. Αν κύτταρο μετανάστευση των φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων μπορεί να διεγερθεί από μια ποικιλία ενδο- και εξω-κυτταρικών παραγόντων, όλες οι διαδρομές τελικός σχετικά με τη ρύθμιση της δραστικότητας κοφιλίνη. Κοφιλίνη είναι μια μικρή πρωτεΐνη δεσμεύσεως της ακτίνης μπορούν να δεσμεύουν και τις δύο μορφές του ακτίνης, σφαιρικά και νημάτων, και ρυθμίζεται από φωσφορυλίωση σε σερίνη 3. Μετά τη φωσφορυλίωση σε σερίνη 3 κοφιλίνη είναι ανενεργή, ως εκ τούτου, δεν μπορεί να δεσμεύσει τα μόρια ακτίνης και κυτταροσκελετό αναδιαμόρφωση βλάπτεται. Η ΕΖΗ2 ιστόνης μεθυλοτρανσφεράση είναι συχνά υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος (CRC). ΕΖΗ2 πάνω δραστηριότητα, η οποία οδηγεί σε επιγενετικές γονίδιο-σίγησης, έχει συνδεθεί με πολλές ιδιότητες όγκου συμπεριλαμβανομένης της εισβολής, της αγγειογένεσης και της μετάστασης, αλλά λίγα είναι γνωστά για τις κάτω μοριακούς μηχανισμούς. Εδώ, αναφέρουμε ότι ΕΖΗ2 είναι σε θέση να ελέγχει κοφιλίνη δραστηριότητα και, κατά συνέπεια, τη μετακίνηση των κυττάρων των κυτταρικών γραμμών CRC μέσω μιας μη συμβατικής νέα άξονα που περιλαμβάνει σηματοδότηση ιντεγκρίνης. Πράγματι, έχουμε δείξει πώς η γενετική και φαρμακολογική αναστολή (DZNep και GSK343) της ΕΖΗ2 λειτουργία παράγει υπερ φωσφορυλίωση κοφιλίνη και μειώνει την κυτταρική μετανάστευση. Έχουμε προηγουμένως αποδεικνύεται από χρωματίνη ανοσο-καταβύθιση που Ιντεγκρίνης άλφα 2 (ITGα2) η έκφραση ρυθμίζεται από ΕΖΗ2. Στην παρούσα μελέτη παρέχει στοιχεία που αποδεικνύουν ότι στα κύτταρα ΕΖΗ2-σιγήσει η δραστηριότητα σηματοδότησης του de-απωθημένο ITGα2 είναι σε θέση να αυξήσει κοφιλίνη φωσφορυλίωση, η οποία με τη σειρά της μειώνει την κυτταρική μετανάστευση. Αυτή η μελέτη προτείνει επίσης νέους μηχανισμούς που θα μπορούσαν να παρέχουν νέες αντι-μεταστατική στρατηγικές για τη θεραπεία CRC με βάση την αναστολή του παράγοντα επιγενετικές ΕΖΗ2 και /ή του γονιδίου-στόχου του

Παράθεση:. Ferraro Α, Boni Τ, Πίντζας Α ( 2014) ΕΖΗ2 Ρυθμίζει κοφιλίνη δραστηριότητα και τον καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων η μετανάστευση από Στόχευση ITGA2 Gene. PLoS ONE 9 (12): e115276. doi: 10.1371 /journal.pone.0115276

Επιμέλεια: Jörg Δ Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Γερμανία

Ελήφθη: 6, Αύγ του 2014? Αποδεκτές: 20 Νοέμβρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 30 Δεκ 2014

Copyright: © 2014 Ferraro et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τη χορήγηση FP7-241783 EpiDiaCan στο AP

Αντικρουόμενα συμφέροντα του 7ου ΠΠ της ΕΕ:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

μετανάστευση όγκου των κυττάρων είναι απαραίτητη για τη μεταστατική απόκτηση ικανότητας [1], [2]. αρμοδιότητα της μετανάστευσης απαιτεί ενεργοποίηση των οδών που συγκλίνουν σε πολυμερισμό της ακτίνης και της de-πολυμερισμού που καθοδηγούν τη συγκρότηση της ειδικής κυτταρικής μεμβράνης προεξοχές, όπως ελασματοπόδια, invadopodia και filopodia σηματοδότησης. δυναμική ακτίνη ρυθμίζεται από πολυάριθμες πρωτεΐνες πρόσδεσης ακτίνης, μεταξύ των οποίων ακτίνη αποπολυμερισμό παράγοντα (ADF), κοφιλίνη-1 (τύπος μη-μυ) και κοφιλίνη-2 (τύπος μυός) είναι αυτές που επιτρέπουν τη μετακίνηση των κυττάρων μέσω της ανωτέρω περιγραφείσα μεμβράνη δομές [3], [4]. Από την κοφιλίνη-1 είναι η πλέον πανταχού παρούσα μορφή πρωτεϊνών δεσμεύσεως της ακτίνης, στην παρούσα μελέτη αναλύσαμε μόνο αυτό το είδος, και εδώ αναφερόμαστε σε αυτήν ως κοφιλίνη. Κοφιλίνη ενεργοποίησης είναι ένα βασικό βήμα για τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων [5], [6], αν και, κατά πάσα πιθανότητα, είναι η συνολική δραστηριότητα των οδών κοφιλίνη ρύθμισης που οδηγούν την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων [4]. Αρκετοί μηχανισμοί ρύθμισης κοφιλίνη είναι γνωστές [3], [4]. Το καλύτερο που χαρακτηρίζεται είναι μέσω φωσφορυλίωσης σε σερίνη 3 (ρ-κοφιλίνη) με LIM κινάση 1 και 2 (LIMK1, LIMK2) [7], με όρχεων πρωτεϊνική κινάση 1 και 2 (TESK1, TESK2) [8], και με απο-φωσφορυλίωσης σε σερίνη 3 με σφεντόνα φωσφατάση (SSH) και chronophin [9], [10]. Η φωσφορυλίωση σε σερίνη 3 αδρανοποιεί κοφιλίνη, εμποδίζοντας του δέσμευση στην κυριότερη υποστρώματα σφαιρικά-ακτίνη (G-ακτίνη) και νήμα-ακτίνη (Ρ-ακτίνη) [11], ενώ απο φωσφορυλίωση σε σερίνη 3 επιτρέπει σύνδεσης υποστρώματος και F-ακτίνης αποκοπής . Αρκετοί μηχανισμοί σηματοδότησης έλεγχο κοφιλίνη λειτουργίες και, κατά συνέπεια, των κυττάρων-σχήμα και -locomotion. Κυμαίνονται από την οικογένεια Rho μικρές ΘΤΡάσες ενεργεί για LIMKs, να ιντεγκρίνη μεσολάβηση σηματοδότησης που ενεργεί για TESK1 /2 [12]. SSH φωσφατάση μπορεί να ενεργοποιηθεί με F-ακτίνη, πρωτεΐνες 14-3-3, PKDs και από PLCβ /ΡΙ3Κγ-GSK3 οδού [12] σηματοδότησης.

Enhancer της Zeste ομόλογο 2 (ΕΖΗ2) ανήκει στην ομάδα Polycomb οικογένειας [13] και είναι η καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου ιστόνης μεθυλοτρανσφεράση ονομάζεται Polycomb Κατασταλτικά συγκρότημα 2 (PRC2). PRC2 δεσμεύεται να στοχεύσετε υποκινητές γονιδίων για την επιγενετική καταστολή μέσω δι- ή trimethylation ιστόνης Η3 σε λυσίνη 27 καταλοίπων (H3K27me2-3). ΕΖΗ2 υπερέκφραση συνδέεται, σε πολλές επιθετικούς όγκους [14], [15], με κακή πρόγνωση [16] και της παρουσίας μακρινών μεταστάσεων σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) [17]. ΕΖΗ2 ρύθμιση προς τα κάτω μπορεί να μειώσει την ανάπτυξη διηθητικού καρκίνου του μαστού [18], η αγγειογένεση του όγκου [19] και

in vitro

κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή των κυτταρικών σειρών CRC [17].

Το καλά καθορισμένη αρχιτεκτονική επιθηλιακών ιστών, όπως του βλεννογόνου του παχέος εντέρου, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την έκφραση ειδικών μορίων προσκόλλησης κυτταρικής επιφάνειας, όπως ιντεγκρίνες, που αλληλεπιδρούν με εξωκυττάρια μήτρα (ECM) και γειτονικά κύτταρα. Τα γονιδιώματα θηλαστικών κωδικοποιούν 18 α- και 8 β-ιντεγκρίνης υπομονάδες, που σε συνδυασμό παράγουν 24 διαφορετικές ιντεγκρίνη (α-β-) ετεροδιμερή χωρίς περιττές λειτουργίες που κυμαίνονται από εξωκυτταρικούς υποδοχείς κολλαγόνου για να σηματοδοτήσει μεσολαβητές μεταγωγής [20]. Αλλαγές στην έκφραση ιντεγκρίνης συμβεί σε πολλούς τύπους καρκίνου και αν ιντεγκρίνες ενεργεί μόνο ως ενισχυτές του όγκου ή καταστολείς όγκων συζητείται ακόμα. ITGα2 σχηματίζει ετεροδιμερή με ITGβ1 -α2β1- και αλληλεπιδρά με τις ίνες κολλαγόνου ECM [20]. Έχει αναφερθεί ότι ιντεγκρίνης α2β1 είναι σε θέση να εμποδίσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [21] – [23] και για την καταστολή της μετάστασης σε ποντίκια και ανθρώπους [24]. Στον καρκίνο του προστάτη, ITGα2 κάτω ρύθμιση έχει προταθεί ως πιθανοί δείκτη όγκου [25]. Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι ΕΖΗ2 καταστέλλει επιγενετικώς έκφραση ITGα2 [17]. Είναι ενδιαφέρον ότι, κατά τη διάρκεια του χαρακτηρισμού του νεοσύστατου ΕΖΗ2-σιγήσει κυτταρική γραμμή (που ονομάζεται ΗΟΤ-shEZ-2), μια αξιόλογη υπερ-φωσφορυλίωση της κοφιλίνη σε HCT-shEZ-2 σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα HCT116 ανιχνεύθηκε.

Αν και η λειτουργία κοφιλίνη έχει περιγραφεί στο κύτταρο όγκου βιολογία, ρυθμιστικά δίκτυα που ενσωματώνουν επιγενετικών παραγόντων, απορρύθμιση των μονοπατιών μεταγωγής σήματος και δραστικότητα κοφιλίνη περιγράφονται ανεπαρκώς. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι οι έλεγχοι των ιστονών μεθυλοτρανσφεράση ΕΖΗ2 κοφιλίνη φωσφορυλίωσης, και κατά συνέπεια τη μετακίνηση των κυττάρων, μέσω μιας νέας πορείας που περιλαμβάνει ITGα2 και μεταγωγής σήματος της δραστηριότητα.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Caco-2, DLD-1, ΗΤ-29, κυτταρικές σειρές HCT116 και RKO διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM, που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 1Χ πενικιλλίνη, 1Χ στρεπτομυκίνη, και 2 mM L-γλουταμίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στη μελέτη έχουν αγοραστεί από την American Type Culture Collection (ATCC). Η διαδικασία κλωνοποίησης για HCT-shEZ-2 κυτταρική γραμμή που περιγράφεται στο Ferraro et. al. [17].

κηλίδος Western και αντισώματα

Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται με 60 μι RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως και κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα. Οι κηλίδες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα κατάλληλα πρωτογενή αντισώματα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν: ΕΖΗ2 BD Bioscience, κώδικας των ΗΠΑ 612.667? από Millipore, USA κωδικό H3K27me3 07-449? RAC-1 Κωδικός 05-389? από Santa Cruz, Γερμανία: H3 συνολική κωδικό SC-8654? Κωδικός τουμπουλίνης SC-8035? Κωδικός ITGα2 SC-74466? Κωδικός RhoA SC-418? Κωδικός ROCK1 SC-17794? Κωδικός Cdc42 sc-87? p-κοφιλίνη (Σερίνη 3) κωδικός sc-12912-R? κοφιλίνη SC-33779? Κωδικός TESK1 SC-366681 (για να αυξηθεί η ειδικότητα του TESK1 αντισώματος στο WB προσδιορισμούς νιτροκυτταρίνης κηλίδωση μεμβράνες κόπηκαν οριζοντίως μεταξύ -60 και -80 kDa). Εκχυλίσματα πρωτεΐνης παρασκευάζονται από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα και κηλίδες επαναλήφθηκαν τουλάχιστον δύο φορές.

συνεστιακή μικροσκοπία

Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για δοκιμασίες ανοσοφθορισμού σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα μεθανόλης /ακετόνης (8:01), πλένεται, διαπερατά με 0,3% Triton-X-100 και δεσμεύτηκαν με 5% BSA πριν από την επώαση με πρωτογενή αντισώματα ή με Alexa φθόριο 546 φαλλοϊδίνη (Invitrogen ΗΠΑ, κωδικός A22283). Οι πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με τη Hoechst.

Αναστολείς και siRNA διαμόλυνση

αναστολέας ROCK-1 (Υ-27632 Sigma, USA κωδικός Y0503-1MG) χρησιμοποιήθηκε σε τελική συγκέντρωση 30 μΜ για 24 ώρες . αναστολείς ΕΖΗ2 (3-Deazaneplanocin A (DZNep) Santa Cruz, Γερμανία κωδικός SC-351856? GSK-343 Active Biochemicals, το Χονγκ Κονγκ κώδικας A-1416) χρησιμοποιήθηκαν σε τελική συγκέντρωση 1, 3 και 5 μΜ για 48-72 ώρες . Για siITGα2 επιμόλυνση, τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και επιμολύνθηκαν με Lipofectamnine 2000, siEZH2_4 και siEZH2_7 (Quiagen, Γερμανία κωδικούς SI00063973, SI02665166) siITGα2 (Quiagen, κώδικες Γερμανία SI02664081, SI02664088) και siRhoA (Dharmacon, κωδικός USA L-003.860 -00-0005) έχουν χρησιμοποιηθεί σε μία τελική συγκέντρωση 50 μΜ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

τρισδιάστατο καλλιέργεια

για χρησιμοποιήθηκε τρισδιάστατη καλλιέργεια Matrigel (BD, Bioscience) . Πολυ-λυσίνη προ-επικαλυμμένων καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων. Matrigel αραιώθηκε με ψυχρό πλήρες μέσο ϋΜΕΜ σε τελική συγκέντρωση 50%, 200 μΙ αποτέθηκαν σε κάθε φρεάτιο που περιέχει καλυπτρίδες και η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C για 15 ‘. 0,5 × 10

3 κυττάρων αραιώθηκε σε 100 μΙ ψυχρού DMEM και αναμίχθηκαν με 100 μΙ 100% Matrigel. Τα προκύπτοντα 200 μΙ προστέθηκαν στα φρεάτια με προθερμασμένο Matrigel. Πλάκα επωάστηκε σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° με 5% CO

2 για 3 ημέρες.

δοκιμασία Μετανάστευση

Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με μέσο που περιέχει 1% FBS, και μετρήθηκαν . 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ανώτερο θάλαμο μιας μm πόρου Transwell φίλτρο 8 (Corning), τοποθετημένα σε ένα πιάτο 24 φρεατίων που περιέχει 10% FBS μέσου. Τα φίλτρα προ-επικαλυμμένη με ινονεκτίνη. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν στους 37 ° C, 5% CO

2 για 36-40 ώρες, σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με 0,1% w /v κρυσταλλικό ιώδες. Κάτω πλευρά των φίλτρων παρατηρήθηκε με 40Χ αντικειμενικό και μεταναστευτικά κύτταρα προσδιορίστηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις διπλούν και επαναλαμβάνονται δύο φορές. Για δοκιμασία μετανάστευσης σε συνδυασμό με siITGα2 επιμόλυνση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, σπάρθηκαν επί transwell και επωάστηκαν στους 37 ° C για άλλες 24 ώρες. Για δοκιμασία μετανάστευσης σε συνδυασμό με αναστολέα ROCK1, τα κύτταρα σπάρθηκαν επί transwell με την παρουσία του αναστολέα και επωάστηκαν στους 37 ° C για άλλες 24 ώρες.

Σφαιρικό (G-) και πυρακτώσεως δοκιμασία ακτίνης (F-)

80-85% συρρέοντα κύτταρα πλύθηκαν απευθείας επί 15 cm τρυβλία Petri δύο φορές με PBS σε θερμοκρασία δωματίου, αποξέστηκαν σε PBS και σφαιροποιήθηκαν. Τα κυτταρικά ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 800 μΙ 37 ° C ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (1 mM ΑΤΡ, 50 mM PIPES ρΗ 6.9, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 5% ο /ο γλυκερόλη και 0,1% όγκο /όγκο για: Nonidet Ρ-40, Tween 20, και Triton Χ-100) συμπληρωμένο με αναστολείς πρωτεάσης. Τα κύτταρα ομογενοποιήθηκαν με ήπια σιφωνισμό 10 φορές πάνω και κάτω και επωάζονται στους 37 ° C για 30 λεπτά. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 16.000 g για 75 λεπτά στους 22-25 ° C. Τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν για τον προσδιορισμό της G-ακτίνης. Σφαιρίδια που περιέχουν Ρ-ακτίνη αναμίχθηκαν με 800 μΐ ρυθμιστικό RIPA και κατεργασία με υπερήχους σε πάγο για 5 λεπτά (30 sec. ON /OFF 30 sec, μέγιστη ισχύς) χρησιμοποιώντας Bioruptor υπερήχων (Diagenode, Βέλγιο) για την διάλυση αυτών. Είκοσι μικρολίτρα από κάθε κλάσμα αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα SDS-φόρτωσης, μετουσιώθηκαν για 8 λεπτά στους 95 ° C και φορτώθηκαν επί πηκτής πολυακρυλαμιδίου. ανίχνευση ακτίνης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αντι-ακτίνης μονοκλωνικό αντίσωμα (κωδικός sc-8432) αγοράστηκαν από την Santa Cruz, Γερμανία.

RNA Extraction /Αντίστροφη Μεταγραφή και Real Time-PCR

Σύνολο απομόνωση RNA από καλλιεργημένα κύτταρα εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Karlsruhe, Germany). Αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε από 3,0 μg καθαρισμένου RNA χρησιμοποιώντας το SuperScript ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή.

σε πραγματικό χρόνο ποσοτικοποίησης στο επίπεδο του mRNA διεξήχθη σε 96-φρεατίων PCR πλάκες χρησιμοποιώντας ένα Bio-Rad iCycler και σε πραγματικό χρόνο σύστημα ανίχνευσης iQ5 Πολύχρωμο PCR (Bio-Rad, Hercules CA, USA). Κάθε αντίδραση περιείχε 1 × iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules CA, USA) και 150 nmol /L του κάθε εκκινητή. Όλα τα γονίδια δοκιμάστηκαν εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με το λογισμικό iCycler. Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής (GAPDH): GAAGGTGAAGGTCGGAGT (Fw) και CATGGGTGGAATCATATTGGAA (Rv)? TESK1:. GCCCTGACACACAATCAG (Fw) και AAGAGGTCTGACCGGCTTC (Rv)

GST pull-down δοκιμασία

Για Rac1-GTP και δοκιμασία pull-down CDC42-GTP GST, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 10 εκατοστά πιάτα και κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με ρυθμιστικό λύσης που χρησιμοποιείται για western αποτύπωση. 50 μg του πανομοιότυπου εκχυλίσματος πρωτεΐνης επωάζονται με GST-ΡΑΚ (ρ21-ενεργοποιημένη κινάση) με σφαιρίδια αγαρόζης γλουταθειόνης για 1 ώρα με περιστροφή στους 4 ° C και τα σφαιρίδια πλύθηκαν 4 φορές σε ρυθμιστικό πλύσης (50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.4 ), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1% (ν /ν) Triton Χ-100, 1 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT), 10 μg /ml απροτινίνη, 10 μg /ml λευπεπτίνη και 0,2 mM PMSF).

Αποτελέσματα

κοφιλίνη φωσφορυλίωση αυξήσεις σε γενετικούς αποσιώπηση και φαρμακολογική αναστολή της ΕΖΗ2 σε κυτταρικές σειρές CRC

Έχουμε ήδη επιμολυσμένα κύτταρα καρκινώματος κόλου HCT116 με μια σύντομη φουρκέτα RNA (shRNA) φορέας που φέρει ένα στέλεχος βρόχο ολιγονουκλεοτίδιο έναντι ΕΖΗ2 mRNA. Οι σταθεροί κλώνοι shEZH2 (HCTshEZ-2) απεικόνιση πολύ χαμηλή ποσότητα πρωτεΐνης ΕΖΗ2 καθώς και χαμηλά trimethylation στη λυσίνη 27 ιστόνης Η3 (H3K27me3), το ΕΖΗ2-ειδικό υπόστρωμα (Εικ. 1Α). Έχουμε αναφερθεί ότι τα κύτταρα HCTshEZ-2 δείχνουν μειωμένη μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητα σε σχέση με τη γονική και ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (HCTshpSUP) HCT116 [17]. Να εντοπίσει πιθανούς παράγοντες που θα μπορούσαν να ελέγχουν τη μετακίνηση των κυττάρων των κυττάρων HCTshEZ-2, η ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης των παραγόντων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της δυναμικής του κυτταροσκελετού όπως RhoA, CDC42, ROCK1, RAC1, κοφιλίνη και π-κοφιλίνη (κατάντη δράστες της Rho ΟΤΡάσης οδού) έχουν αναλυθεί με Western blot (WB). Όπως αναφέρεται στο σχ. 1Β, σίγηση του ΕΖΗ2 δεν επηρέασε τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης από κανένας από τους παράγοντες που αναλύθηκαν ακτίνης διαμόρφωσης. Αντιστρόφως, ένα αξιοσημείωτο υπερ-φωσφορυλίωση σε σερίνη 3 της μικρής πρόσδεσης ακτίνης πρωτεΐνη κοφιλίνη ανιχνεύθηκε (Εικ. 1Β). Επιπλέον, σε HCTshEZ-2 κύτταρα αποσιώπηση του ΕΖΗ2 δεν άλλαξε την δραστικότητα ΟΤΡάσης της CDC42 και RAC1 που αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας GST-PAK τραβήξει κάτω δοκιμασίας (S1 Εικ.). Πρέπει επίσης να διερευνηθεί έμμεσα τη δυνατότητα ενεργοποίησης του RhoA στα κύτταρα HCTshEZ-2. Με φίμωση RhoA με την τεχνολογία siRNA βρήκαμε ότι το επίπεδο p-κοφιλίνη παρέμεινε το ίδιο σε όλες τις κυτταρικές σειρές (HCT116, HCTshpSUP και HCTshEZ-2). Ως εκ τούτου, η εξάντληση της έκφρασης ΕΖΗ2 δεν επηρέασε δραστηριότητα RhoA και, κατά συνέπεια, κοφιλίνη φωσφορυλίωση (S2A Εικ.). Για να αποδειχθεί ότι η παρατηρούμενη υπερ-φωσφορυλίωση της κοφιλίνη δεν είναι ένα αποτέλεσμα εκτός στόχου της διαδικασίας κλωνοποίησης, ΕΖΗ2 παροδικά εξαντληθεί με δύο διαφορετικά siRNAs oligos σε HCT116 και RKO κύτταρα και 48 ώρες μετά τα επίπεδα ρ-κοφιλίνη αναλύθηκαν με WB. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1C για HCT116 και S2B Εικ. για RKO, παροδική ΕΖΗ2 σίγηση οδήγησε σε σημαντική αύξηση του ρ-κοφιλίνη καθώς και των επιπέδων ITGα2 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.

A. έκφραση της πρωτεΐνης και την παγκόσμια δραστηριότητα μεθυλοτρανσφεράσης της ΕΖΗ2 σε HCT116 και HCTshEZ-2 σταθερούς κλώνους καθώς και σε HCTshpSUP mock κύτταρα ελέγχου αναλύθηκαν με WB. Β ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης της οικογένειας συστατικά Rho ΟΤΡάσης και ITGα2 σε HCT116, HCTshEZ-2 και HCTshSUP κύτταρα. Γ Παροδική μείωση των ΕΖΗ2 με δύο διαφορετικά ολιγονουκλεοτίδια siRNA αυξάνει φωσφορυλίωση κοφιλίνη παρόμοια με σταθερή αποσιώπηση. Δ Φάση εικόνες μικροσκοπίας αντίθεσης HCT116, HCTshEZ-2 και HCTshSUP κυττάρων-φαινοτύπων, γραμμή κλίμακας 150 μm. Ε Εκπρόσωπος φωτογραφίες από ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού σε HCT116 και τα κύτταρα HCTshEZ-2 όπου p-κοφιλίνη βάφτηκε (πράσινο). Οι πυρήνες έχουν αντίθετα με τη Hoechst (μπλε). μπαρ κλίμακα μεγέθους 150 μm. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης F. ΕΖΗ2 σύγκριση με τα επίπεδα κοφιλίνη και π-κοφιλίνη σε 7 κυτταρικές γραμμές CRC. Οι αριθμοί κάτω από κηλίδες δείχνουν ποσοτικοποίηση μπάντα που πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό λογισμικό και έκφραση τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης αναφοράς. Όλα τα WB πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές, οι αντιπροσωπευτικές κηλίδες και ποσοτικοποιήσεις παρουσιάζονται.

Η

Η επίδραση της αδρανοποίησης κοφιλίνη επί φαινότυπο και την ανάπτυξη ιδιοτήτων των κυττάρων HCTshEZ-2 είναι καλά εμφανές σε πρότυπο δύο διαστάσεων Πολιτισμός. Πράγματι, σε HCTshEZ-2 κύτταρα, ο αριθμός των κυτταρικών μεμβράνης προεξοχές είναι κακή, λιγότερο σημαντικό και το επίμηκες σχήμα των κυττάρων HCT116 απώλειας του ελέγχου, όντας HCTshEZ-2 κύτταρα πιο στρογγυλά και επίπεδα (Σχ. 1D). Χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο και ανοσοδοκιμή φθορισμού να λεκές ρ-κοφιλίνη, επιβεβαιώσαμε ότι ανενεργές ρ-κοφιλίνη αυξάνεται σε κύτταρα HCTshEZ-2 σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα HCT116 και ότι ρ-κοφιλίνη εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα του HCT116, ενώ σε HCTshEZ- 2 κύτταρα ρ-κοφιλίνη εντοπίζεται τόσο στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 1 Ε).

Για να εξακριβωθεί αν η σχέση μεταξύ ΕΖΗ2 και ρ-κοφιλίνη είναι ένα γενικό χαρακτηριστικό των κυτταρικών σειρών CRC, αναλύσαμε κοφιλίνη , τα επίπεδα ρ-κοφιλίνη και έκφραση ΕΖΗ2 σε 7 κυτταρικές γραμμές CRC. Σε αυτές τις 7 κυτταρικές γραμμές CRC μια προηγούμενη σύγκριση μεταξύ της πρωτεΐνης ΕΖΗ2 και παγκόσμιο επίπεδο του υποστρώματος του H3K27me3 έδειξαν ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν ΕΖΗ2 (HCT116, RKO και SW620) επίσης παρούσα υψηλά επίπεδα H3K27me3 (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα, βλέπε ref. [17] ). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι κυτταρικές γραμμές με τα επίπεδα πρωτεΐνης υψηλής ΕΖΗ2 έδειξαν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη (HCT116) ή χαμηλή (SW620 και RKO) ρ-κοφιλίνη σε σύγκριση με τα άλλα μελετήθηκαν κυτταρικές γραμμές, με την εξαίρεση των Caco-2 ενδιάμεσου αδενώματος κυτταρική γραμμή (Σχ. 1F ). Αντίθετα, τα επίπεδα της πρωτεΐνης κοφιλίνη (σύνολο-κοφιλίνη) ήταν ουσιαστικά οι ίδιες σε ολόκληρη την 7 κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Για να ποσοτικοποιηθεί η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ΕΖΗ2 και φωσφορυλίωση κοφιλίνη σε όλες τις κυτταρικές σειρές CRC, με την εξαίρεση του Caco2, η απόλυτη ένταση του ΕΖΗ2 WB ζωνών της Εικ. 1F έχει συναρτήσει του απόλυτη ένταση του π-κοφιλίνη WB ζώνες χρησιμοποιώντας ένα διάγραμμα διασποράς. Ένα σημαντικό αρνητικό συντελεστή συσχέτισης (

R

= -0,7532) της ευθείας γραμμής που προκύπτει με τα δεδομένα σημεία δείχνουν ότι τα επίπεδα π-κοφιλίνη είναι αντιστρόφως ανάλογα σε σχέση με τα επίπεδα ΕΖΗ2 σε 6 από τους 7 κυτταρικές σειρές CRC ( S3 Εικ.).

για να επικυρώσετε περαιτέρω στοιχεία κηλίδα western π-κοφιλίνη και επιβεβαιώστε ότι η p-κοφιλίνη δεν συμβάλλει στη μετανάστευση των κυττάρων όταν εντοπίζεται στον πυρήνα, HCT116, HCTsh-EZ-2, ΗΤ29 (υψηλότερη WB επίπεδο p-κοφιλίνη) και κυτταρικές σειρές RKO (χαμηλό WB επίπεδο p-κοφιλίνη) αναλύθηκαν με συνεστιακό μικροσκόπιο με συν-χρώση p-κοφιλίνη με G-ακτίνη και ξεχωριστά με συνολικό-κοφιλίνη. Σύκο. 2Α δείχνει ότι σε κύτταρα ΗΤ29 χρώση ρ-κοφιλίνη είναι υψηλή σε σύγκριση με HCT116, HCT-shEZ-2 και RKO, επιβεβαιώνοντας WB δεδομένων. Επιπλέον, ρ-κοφιλίνη σε κύτταρα ΗΤ29 ανιχνεύθηκε αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα σε αντίθεση HCT116, HCTshEZ-2 και RKO κυτταρικές σειρές. Σε ΗΤ29, το ίδιο μοτίβο κυτταροπλασματική ανιχνεύθηκε επίσης για το σύνολο-κοφιλίνη (ΗΤ29 ενιαίο επίπεδο εικόνας στο Σχ. 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε HCT116, HCT-shEZ-2 και RKO κύτταρα σύνολο κοφιλίνη εντοπίστηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα σε αντίθεση με ρ-κοφιλίνη (Σχ. 1Ε και 2Β). Όσον αφορά G-ακτίνης, τα πειράματα συν-χρώση τονιστεί ότι το G-ακτίνης εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα, καθώς και στον πυρήνα όλων των κυτταρικών σειρών. Παρατηρήσαμε ότι η πυρηνική ρ-κοφιλίνη σπανίως συν-εντοπίζονται με G-ακτίνης σε HCT116 και RKO κύτταρα, αποδεικνύοντας ότι η Ρ-κοφιλίνη δεν είναι σε θέση να δεσμεύσει G-ακτίνης στον πυρήνα. Επιπλέον, αν και τα κύτταρα ΗΟΤ-2 shEZ προερχόμενο από HCT116 παρουσιάζουν ρ-κοφιλίνη επίσης στο κυτταρόπλασμα παρομοίως να ΗΤ29 κύτταρα που χαρακτηρίζονται από χαμηλή μεταναστευτικά χωρητικότητα (Εικ. 2Α).

A. HCT116, RKO, ΗΟΤ-shEZ-2 και ΗΤ29 έχουν συν-χρώση με ρ-κοφιλίνη (πράσινο) και G-ακτίνης (κόκκινο), προκειμένου να μελετηθεί η ενδοκυτταρική εντόπιση των δύο πρωτεϊνών. Πυρήνες είναι αντίθετα με τη Hoechst (μπλε). Η συγχώνευση των τριών χρωμάτων εμφανίζεται επίσης (συγχωνεύονται). Ράβδοι κλίμακας 10 μm. Β κοφιλίνη (πράσινο) χρώση στα κύτταρα CRC. Μόνο ΗΤ29 κύτταρα παρουσιάζονται σχεδόν αποκλειστικά κυτταροπλασματική εντόπιση όπως φαίνεται από single-αεροπλάνο εικόνα ομοεστιακό. Ράβδοι κλίμακας 50 μm. C. Φαρμακολογικά διάσπαση του ΕΖΗ2 πρωτεΐνης με DZNep σε CRC κυτταρικές σειρές με υψηλή έκφραση της πρωτεΐνης ΕΖΗ2. D. Η φαρμακολογική αναστολή της ενζυματικής δραστικότητας ΕΖΗ2 με GSK343. Τα χαμηλά επίπεδα H3K27me3 στα επεξεργασμένα κύτταρα δείχνουν ότι η δραστηριότητα GSK343 ​​αποτελεσματικά μπλοκ ΕΖΗ2. Ε TESK1 πρωτεΐνη (επάνω) και mRNA (κάτω) έκφραση αναλύσεις επί κυττάρων CRC με υψηλή (HCT116 και HCT-shpSUP) και σιγήσει (/b HCTsh-EZ-2α) Τα επίπεδα ΕΖΗ2 πρωτεΐνης. Οι F. siRNAs έναντι ITGα2 mRNA έχουν χρησιμοποιηθεί για τη μείωση της έκφρασης πρωτεΐνης ITGα2. Οι επιδράσεις της ITGα2 σιγαστήρα για κοφιλίνη και ρ-κοφιλίνη αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας WB. Οι αριθμοί κάτω από κηλίδες δείχνουν ποσοτικοποίηση μπάντα που πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ειδικό λογισμικό και έκφραση τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης αναφοράς. Για ρ-κοφιλίνη ποσοτικό προσδιορισμό σε HCT116 και HCT-κύτταρα shEZ-2 έχουν όλες οι τιμές έχουν κανονικοποιηθεί σε σχέση με την τιμή ρ-κοφιλίνη του μη επιμολυσμένα HCT116. Όλα τα WB πειράματα έχουν επαναληφθεί τουλάχιστον δύο φορές και οι αντιπροσωπευτικές κηλίδες εμφανίζονται.

Η

Η σχέση μεταξύ ΕΖΗ2 και p-κοφιλίνη μελετήθηκε επίσης αναστέλλοντας τη δραστηριότητα μεθυλ-τρανσφεράσης της ΕΖΗ2 με δύο αναστολείς ΕΖΗ2 3 -Deazaneplanocin Α (DZNep) και η GSK-343 [26], [27] σε κυτταρικές σειρές όπου ΕΖΗ2 εκφράζεται έντονα: HCT116, SW620 και RKO. θεραπεία DZNep διαταράσσεται ΕΖΗ2 πρωτεΐνη σε όλες τις κυτταρικές σειρές που προκύπτουν σε ρ-κοφιλίνη αύξηση χωρίς να επηρεάζεται το συνολικό έκφραση κοφιλίνη (Σχ. 2C). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με κατεργασία GSK-343, ότι μπλοκάρει αποτελεσματικά την ενζυματική λειτουργία του ΕΖΗ2, αφού παρατηρήθηκε μια αξιοσημείωτη συνολική μείωση του H3K27me3 σήματος σε επεξεργασμένα κύτταρα, χωρίς να επηρεάζει ΕΖΗ2 και έκφραση κοφιλίνη επίπεδα, παρά κοφιλίνη φωσφορυλίωσης (Εικ. 2D).

Τα ITGα2 ΕΖΗ2-στόχος-γονιδίων σε ελέγχους μέρος κοφιλίνη φωσφορυλίωσης /απο-φωσφορυλίωση σε κυτταρικές σειρές CRC

με χρωματίνης ανοσο-καθίζηση (Chip) που προηγουμένως αποδειχθεί [17] ότι ΕΖΗ2 υπερ- μεθυλιώνει την λυσίνη 27 ιστόνης Η3 στο γονίδιο υποκινητή ITGα2 προκαλώντας επιγενετικές γονίδιο-καταστολή (Εικ. 1Β). Είναι ενδιαφέρον, TESK1, μια κινάση σε θέση να φωσφορυλιώσει κοφιλίνη στη σερίνη 3 και με τον τρόπο αυτό είναι σε θέση να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα του, μπορούν να ενεργοποιηθούν με διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη σηματοδότηση [8], [28] η οποία προτείνει ITGα2 μονοπάτι ως υποψήφια για περαιτέρω διερεύνηση. Η δραστηριότητα σηματοδότησης de-απωθημένο της ITGα2 μέσω TESK1 μπορεί να είναι υπεύθυνη, τουλάχιστον εν μέρει, για την ενίσχυση της p-κοφιλίνη στα κύτταρα ΕΖΗ2-σιγήσει. Για να επαληθευτεί αυτή η υπόθεση, την πρώτη Real-Time PCR και WB αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν για την επαλήθευση της έκφρασης του TESK1 στο σύστημα κυτταρικής σειράς CRC που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη. Έχει αποδειχθεί (Σχ. 2Ε) ότι TESK1 εκφράστηκε σε κύτταρα HCT116 και ότι σίγηση του ΕΖΗ2 δεν επηρέασε την έκφραση του δεδομένου ότι καμία αλλαγή του TESK1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης έχουν ανιχνευθεί μεταξύ ελέγχου και των κυττάρων ΕΖΗ2-silinced. Στη συνέχεια, για την αντιμετώπιση του ρόλου της ITGα2 επί οδού κοφιλίνη, μικρά παρεμβαλλόμενα RNA ολίγο έναντι ITGα2 (siITGα2) έχουν χρησιμοποιηθεί για να μειώσει την έκφραση ITGα2 σε HCTshEZ-2 και τον έλεγχο HCT116 κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης ITGα2 επηρεαστεί αρνητικά ρ-κοφιλίνη κυρίως σε HCTshEZ-2 κύτταρα (Σχ. 2Ε). Συγκρίσιμα αποτελέσματα ελήφθησαν επίσης μετά την επεξεργασία των κυττάρων με DLD1 siITGα2. DLD1 εκφράζουν υψηλά επίπεδα ITGα2 πρωτεΐνης σε σύγκριση με HCT116 (Σχ. 2Ε) [17].

θεραπεία κυττάρων με τους αναστολείς ΕΖΗ2 προβλέπονται περαιτέρω στοιχεία για την νέα προτεινόμενη επιγενετική μηχανισμός ρύθμισης ρ-κοφιλίνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C και 2D, DZNep και GSK-343 θεραπείες αποτελεσματικά απο-καταστέλλεται γονίδιο ITGα2 σε HCT116, RKO και τα κύτταρα SW620, που χαρακτηρίζονται από χαμηλή έκφραση ITGα2 [17]. Πράγματι, ΕΖΗ2 αναστολέα θεραπείες είχε ως αποτέλεσμα μια αξιοσημείωτη αύξηση του ρ-κοφιλίνη σε HCT116 και SW620 κύτταρα, και είχε λιγότερο, αλλά ακόμη σημαντική επίδραση στα επίπεδα ρ-κοφιλίνη σε κύτταρα RKO.

Τρισδιάστατο οργάνωση του κυτταροσκελετού και της μετανάστευσης ικανότητα των κυτταρικών σειρών CRC ελέγχονται με φωσφορυλίωση κοφιλίνη

οι μορφολογικές αλλαγές που συμβαίνουν όταν τα κύτταρα HCTshEZ-2 τοποθετήθηκαν επί του matrigel (τρισδιάστατη πολιτισμός, 3D) δείχνουν ότι η οδός κοφιλίνη μπορεί επίσης να είναι υπεύθυνο για τις ιδιότητες πρόσφυσης ζωτικής σημασίας για το μεταστατικό κύτταρο εξάπλωση. έχουν HCT116 και HCTshEZ-2 κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε 3D έχουν βάφονται με φαλλοϊδίνη, ότι δεσμεύει F-ακτίνη, συζευγμένο με μία φθορίζουσα χημική ένωση και αναλύθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού ομοεστιακό (Εικ. 3Α). Σε κύτταρα HCTshEZ-2 ανενεργή ρ-κοφιλίνη σταθεροποιεί δομές ακτίνης είναι αναγκαίες για την αλληλεπίδραση με την ECM. Στην πραγματικότητα, μετά από 3 ημέρες επί matrigel, τα κύτταρα HCTshEZ-2 έδειξε μια επίπεδη κύτταρο-σώμα, σαφώς ορατά πυρήνες και, το πιο σημαντικό, ένα μόνο κύτταρο μονοστοιβάδα με καλά ορατό νημάτια ακτίνης (βέλη στο Σχ. 3Α). Σε αντίθεση, τα κύτταρα HCT116 δεν δείχνουν υψηλά επίπεδα της F-ακτίνης και τα κύτταρα ήταν σε θέση να αναπτυχθεί ως μια σφαίρα όγκου.

Α. F-ακτίνης χρωματίστηκε με phalloin συζευγμένο με ένα φθορισμοφόρο (κόκκινο) σε HCT116 και HCTshEZ-2 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε matrigel. Αντιπροσωπευτικά εικόνες μικροσκοπία αντίθεσης φάσης των ίδιων καλλιεργειών παρουσιάζονται επίσης για κάθε κυτταρική γραμμή. Τα βέλη δείχνουν μακρά μόρια F-ακτίνης. μπαρ κλίμακα 20 μm. B. Ανάλυση της σχετικής ποσότητας του F- και G-ακτίνης στα κύτταρα CRC με υψηλή (HCT116 και HCT-shpSUP) και φιμώνονται (/β HCTsh-EZ-2α) επίπεδα ΕΖΗ2 πρωτεΐνης. Ένταση της WB ζώνες έχει ποσοτικοποιηθεί και η αναλογία υπολογίζεται σε αυθαίρετες μονάδες. Αντιπροσωπευτικά κηλίδα του F- και G-ακτίνης παρουσιάζεται επίσης για κάθε κυτταρική γραμμή. Student t-test χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η στατιστική σημαντικότητα (*** = ρ-τιμή & lt? 0,01) μεταξύ /b κυττάρων HCTsh-EZ-2α και κύτταρα HCT116. ικανότητα C. Η μετανάστευση των κυτταρικών σειρών CRC επιμολυσμένα με siITGα2. Δ WB ανάλυση των επιπέδων ρ-κοφιλίνη σε κύτταρα CRC με υψηλή (HCT116 και HCT-shpSUP) και σιγήσει πρωτεΐνη (HCTsh-EZ-2) ΕΖΗ2 αγωγή με αναστολέα ROCK1 (Y27632) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. ικανότητα Ε μετανάστευση των κυτταρικών σειρών CRC αγωγή με αναστολέα ROCK1 (Y27632) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Για να επαληθεύσετε καλύτερα την ανακατανομή του νημάτια ακτίνης στα κύτταρα HCTshEZ-2, G-ακτίνη και F- ακτίνης διαφορικά απομονώνεται από κύτταρα HCTshEZ-2 καθώς επίσης και από κύτταρα ελέγχου που αναπτύσσονται σε πρότυπο καλλιέργεια 2D. Όπως φαίνεται καθαρά στο Σχ. 3Β F-ακτίνης επίπεδα σε κύτταρα HCTshEZ-2 ήταν πολύ πιο άφθονα από ότι στα κύτταρα HCT116 ελέγχου. Πράγματι, ο μέσος λόγος F-ακτίνης /G-ακτίνη ήταν περίπου 3,5 φορές υψηλότερη σε κύτταρα HCTshEZ-2 σε σύγκριση με τους ελέγχους. Τέλος, για να αποδείξει ότι η παρεκκλίνουσα αδρανοποίηση του άξονα ITGα2-κοφιλίνη, με τη μεσολάβηση ΕΖΗ2, αυξάνει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων μετρήσαμε τη μεταναστευτική ικανότητα HCT116, HCTshSUP, HCTshEZ-2 και τα κύτταρα DLD1 μετά ITGα2 αποσιώπηση. Όπως έχει ήδη φαίνεται στο Σχ. 2D και συζητήθηκαν παραπάνω, siITGα2 μείωσε αποτελεσματικά την έκφραση των ITGα2 σε όλες τις κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν με επακόλουθη μείωση της φωσφορυλίωσης κοφιλίνη που επιδεινώνει το F-ακτίνης /G-ακτίνης κύκλου εργασιών. Αξιοσημείωτα, siITGα2 κυρίως σε HCTshEZ-2 και DLD1 κύτταρα αυξημένη ικανότητα μετανάστευσης κατά περίπου 25% και 12% αντίστοιχα, επιβεβαιώνοντας ότι η ΕΖΗ2-σιγήσει άξονας ITGα2-κοφιλίνη είναι σημαντική για καρκινικό κύτταρο μετακίνηση (Σχ. 3C). Τα συγκρίσιμα αποτελέσματα έχουν ληφθεί, επίσης, με την επούλωση των πληγών δοκιμασία (S4 Εικ.).

Ο κεντρικός ρόλος του p-κοφιλίνη στη δυναμική ακτίνη και τη μετανάστευση των κυττάρων επιβεβαιώθηκε επίσης από μια φαρμακολογική αναστολή της δραστικότητας ROCK1, η οποία δεν συνεπάγεται χειραγώγηση της έκφρασης ITGα2. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε αναστολέα ROCK1 Υ-27632 για να εμποδίσει κοφιλίνη φωσφορυλίωση [29]. ROCK1 αναστολέα μειωμένη ρ-κοφιλίνη σε κυτταρικές γραμμές HCTshEZ-2 (Σχ. 3D) HCT116, HCTshpSUP και. Μείωση του ρ-κοφιλίνη ενισχυμένη το κλάσμα του δραστικού κοφιλίνη που μεταφράζεται σε κέρδος της ικανότητας μετανάστευσης κυρίως σε HCTshEZ-2 (Σχ. 3Ε). Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι στα κύτταρα CRC η αναλογία p-κοφιλίνη /κοφιλίνη είναι ζωτικής σημασίας για τον καρκίνο-κύτταρο εξάπλωση και ότι ITGα2 μπορεί να ρυθμίσει κοφιλίνη και μέσω οδών που περιλαμβάνουν ROCK1.

Συζήτηση

Διαφορετικοί μηχανισμοί έχουν έχουν περιγραφεί για να εξηγήσει την προ-μεταστατική δραστηριότητα της ιστόνης μεθυλτρανσφεράσης ΕΖΗ2 σε διάφορους τύπους καρκίνου [30] – [32], αλλά λίγα είναι γνωστά για το ρόλο του όσον αφορά CRC. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε αυτό το ζήτημα, χρησιμοποιώντας μια προσέγγιση απώλεια-του-λειτουργία για να αξιολογηθεί ο ρόλος της ιστόνης τροποποιητή ΕΖΗ2 στη μετανάστευση των κυττάρων CRC. Συγκεκριμένα, εκμεταλλεύτηκε τη δυνατότητα να χαρακτηρίσουν περαιτέρω μια κυτταρική γραμμή CRC (ΗΟΤ-shEZ-2), όπου ΕΖΗ2 μόνιμα σιωπήσει και μιας νέας ένωσης σε θέση να αναστέλλουν ειδικά μεθυλοτρανσφεράσης ΕΖΗ2, που ονομάζεται GSK-343, καθώς και μια ένωση είναι σε θέση να διαταράξει το συγκρότημα PRC2, που ονομάζεται DZNep. Έχει αποδειχθεί ότι σε αυτή την κυτταρική γραμμή ΕΖΗ2 ελέγχει επιγενετικώς κύτταρο μετακίνηση κρατώντας κοφιλίνη σταθερά ενεργό. Πράγματι, μετά από γενετική και φαρμακολογική αναστολή του ΕΖΗ2, κοφιλίνη φωσφορυλίωση σε σερίνη 3 αυξήθηκε. Η σερίνη-3-φωσφορυλιωμένη κοφιλίνη είναι ανενεργή. Ως συνέπεια της αδρανοποίησης κοφιλίνη, invadopodia συναρμολόγηση στην αιχμή του μεταναστευτικά κύτταρα, καθώς και την αποσυναρμολόγηση στην πλάτη-κύτταρο-πλευρά δεν μπορεί να διαμορφωθεί, με αποτέλεσμα τη μείωση της κυτταρικής μετακίνησης [3], [6]. Αυτό μπορεί να εξηγήσει την αξιοσημείωτη κινητικότητα κύτταρο μείωση του HCT-shEZ-2 σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα HCT116 [17]. αποκλείστηκε η άμεση δράση αποσιώπηση των ΕΖΗ2 σε ανάντη συστατικά της οδού κοφιλίνη. Πράγματι, δεν υπάρχουν αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης και της δραστηριότητας έχουν εντοπιστεί από WB, GST-PAK τραβήξτε προς τα κάτω και αναλύσεις siRNA για, CDC42, RAC1, RhoA, ROCK1 καθώς και της συνολικής κοφιλίνη στα κύτταρα HCT-shEZ-2 σε σχέση με τον έλεγχο των κυττάρων. Να επιβεβαιώνουν την υπόθεση ότι ΕΖΗ2 ρυθμίζει τη μετανάστευση των κυττάρων, μέσω μιας εναλλακτικής βιολογικών άξονα και όχι με καταστολή Rho ΟΤΡάσης της οικογένειας συστατικά, επιδιώξαμε να ερευνήσει σχετικά με το ρόλο των γονιδίων ITGα2. Στην πραγματικότητα, είναι άμεσα ITGα2 ρυθμίζεται από ΕΖΗ2 [17] και δυνητικά μπορεί να δράσει επί οδού κοφιλίνη. Συνεπώς, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι TESK1 είναι σε θέση να φωσφορυλιώσει κοφιλίνη στη σερίνη 3 και ιδίως TESK1 μπορεί να ενεργοποιηθεί με διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη σηματοδότηση [8], [28]. Ποσοτική PCR και ανάλυση WB αποκάλυψε ότι TESK1 εκφράζεται σε κυτταρική σειρά HCT116 και ότι σίγηση ΕΖΗ2 δεν αλλάξει επίπεδο έκφρασης TESK1. Επιπλέον, αποδείχθηκε ότι ITGα2 είναι ο κύριος ρυθμιστής της φωσφορυλίωσης κοφιλίνη με φίμωση ITGα2 πρωτεΐνης σε HCT116, HCT-shEZ-2 και σε κύτταρα DLD1. Τα Πράγματι, μετά ITGα2 φίμωση επίπεδα p-κοφιλίνη μειώνεται, αποδεικνύοντας μια άμεση σχέση μεταξύ ITGα2 και p-κοφιλίνη ενδεχομένως διαμεσολαβείται από TESK1, αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε τη συμμετοχή των άλλων κινασών στόχο ιντεγκρίνες. [35].