Αφηρημένο

Μυελοβλάστωμα (MB) είναι η πιο συχνή κακοήθης παιδιατρικών όγκων του εγκεφάλου. Ενώ τα μονοπάτια που έχουν απελευθερωθεί σε MB παραμένουν να χαρακτηρίζεται πλήρως, ενίσχυση και /ή υπερέκφραση του

MYCN

γονίδιο, το οποίο είναι έχει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη της παρεγκεφαλίδας ως ρυθμιστή νευρικών προγονικών κυττάρων μοίρα, υπήρξε εντοπίστηκαν σε αρκετές MB υποομάδες. Φαινοτυπικά, παρεκκλίνουσα έκφραση MYCN συνδέεται με τον /αναπλαστικό MB παραλλαγή μεγάλων κυττάρων, η οποία αντιπροσωπεύει το 5-15% των περιπτώσεων και συνδέεται με επιθετική νόσο και κακή κλινική έκβαση. Για την καλύτερη κατανόηση του ρόλου των MYCN σε ΜΒ

in vitro

και

in vivo

και να βοηθήσει την ανάπτυξη θεραπευτικών MYCN στοχευμένες ιδρύσαμε που προέρχονται από όγκους νευρόσφαιρα κυτταρικές σειρές από το GTML (

Glt1-ΙΤΑ /TRE-MYCN-Luc

) γενετικά μοντέλο ποντικού. Ένα κλάσμα του GTML νευροσφαιρών βρέθηκαν να είναι αυξητικός παράγοντας ανεξάρτητος, που εκφράζεται CD133 (δείκτης των νευρικών βλαστικών κυττάρων), απέτυχαν να διαφοροποιηθούν με την απόσυρση MYCN και ήταν εξαιρετικά ογκογόνα όταν ορθοτοπικά εμφυτεύεται στην παρεγκεφαλίδα. Κύριο συστατικό αναλύσεις χρησιμοποιώντας τα στοιχεία προσδιορισμού μόνο κύτταρο RNA πρότεινε ότι η κλινική υποψήφιος Aurora-Α αναστολέας της κινάσης MLN8237 μετατρέπει GTML νευροσφαιρίδια να μοιάζουν μη MYCN εκφραστές. Συσχετίζοντας με αυτό, MLN8237 επεκταθεί σημαντικά την επιβίωση των ποντικών που φέρουν αλλομοσχεύματα GTML MB. Εν ολίγοις, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι MYCN διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και την επιβίωση των επιθετικών κυττάρων MB-πολλαπλασιασμού, και να δημιουργήσουν GTML νευροσφαιρίδια ως ένα σημαντικό πόρο για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών

Παράθεση:. Ahmad Ζ, Jasnos L, Gil V, Howell L, Hallsworth Α, Petrie K, et al. (2015) Μοριακή και

In Vivo

Χαρακτηρισμός του Καρκίνου-πολλαπλασιαστικών κυττάρων που προέρχονται από MYCN-Εξαρτημένων Μυελοβλάστωμα. PLoS ONE 10 (3): e0119834. doi: 10.1371 /journal.pone.0119834

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 11 Ιούλ 2014? Αποδεκτές: 16 Ιανουαρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 18 Μάρτη του 2015

Copyright: © 2015 Ahmad et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από πόρους του Ινστιτούτου Έρευνας για τον Καρκίνο, αμερικανικό Ινστιτούτο Έρευνας για τον Καρκίνο (11-0301), Cancer Research του Ηνωμένου Βασιλείου (C34648 /A12054 ), και εγκεφαλικός όγκος φιλανθρωπία (SDBTT 6/88). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

στα παιδιά, μυελοβλάστωμα (MB) είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενες όγκου πρωτόγονη νευροεξωδερματικά (ΡΝΕΤ) καταγωγής στον εγκέφαλο και έχει ταξινομηθεί σε τέσσερις μεγάλες υποκατηγορίες με βάση τα προφίλ διακύμανση και η μεταγραφή αριθμός αντιγράφων: MB

WNT , ΜΒ

ΕΛΕΡΠΕ (ηχητική σκαντζόχοιρος), ΜΒ

Group3 και ΜΒ

Group4 [1,2]. Παρά τις προόδους που έχουν σημειωθεί σε MB μοριακή ταξινόμηση, στην πλειονότητα των παιδιατρικών MB (με την εξαίρεση της ανώμαλης ΕΛΕΡΠΕ και WNT μονοπάτια) ογκογόνο οδών σηματοδότησης που είναι θεραπευτικά στόχευσης, μένει να προσδιοριστεί. Πρόσφατη έρευνα έχει, ωστόσο, έδειξαν ότι MB φιλοξενούν ενίσχυση MYCN και /ή υπερέκφραση μπορεί επίσης να στοχεύονται [3]. Ενίσχυση των

MYCN

γονιδίου σχετίζεται με κακή πρόγνωση [4,5], παρατηρείται σε MB

ΕΛΕΡΠΕ, ΜΒ

Group3 και ΜΒ

Group4 υποτύπους [6-10] και εκφράζεται μη φυσιολογικά στην πλειονότητα των ανθρώπινων MB [11]. Παρά την αυξανόμενη σημασία της MYCN ως θεραπευτικός στόχος σε MB, ωστόσο, εξακολουθούμε να έχουμε μια φτωχή κατανόηση του πώς ανώμαλης

MYCN

έκφρασης μεταμορφώνει νευρικών βλαστικών /προγονικών κυττάρων σε όγκους. Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ένα γενετικά μοντέλο ποντικού (GEMM) της MYCN γνώμονα MB (GTML:

G

LT1-ΙΤΑ /

T

RE-

Μ

YCN-

L

UC

) στα οποία η έκφραση MYCN ελέγχεται από δοξυκυκλίνη (DOX) (Tet-off). Χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα δείξαμε ότι στοχευμένη έκφραση MYCN προκαλεί τόσο κλασικό και μεγάλες αναπλαστικό των κυττάρων (LCA) παθολογία ανεξάρτητα από ΕΛΕΡΠΕ [11]. ταξινόμηση με βάση την υποομάδα προφίλ γονιδιακής έκφρασης που προέρχεται από ανθρώπινα δείγματα μυελοβλάστωμα σε σύγκριση με διαγονιδιακά ποντίκια πρότεινε ότι GTML και GTML /Trp53

ΚΙ /ΚΙ ποντίκια επέδειξαν έκφραση προφίλ χαρακτηριστικό της ανθρώπινης ΜΒ

Group3 [3]. Νευρόσφαιρα γραμμές ιδρύθηκε από ποντίκια GTML πολλαπλασιάζονται σθεναρά, εκφράζουν νευρωνικές δείκτες, και οι όγκοι σχηματίζονται όταν ορθοτοπικώς εμφυτεύονται σε εγκεφάλους ποντικιών [12]. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι πολιτισμοί GTML νευροσφαιρών περιέχουν καρκινικά κύτταρα-πολλαπλασιασμού, καθιστώντας το ένα δυνητικά χρήσιμο σύστημα με το οποίο θα μπορούσε να διευκρινιστεί η μετασχηματιστική ρόλο της MYCN σε ΜΒ γένεση.

Σε αυτό το πλαίσιο, πραγματοποιήσαμε μια σειρά μοριακών και κυτταρολογικές μελέτες για να χαρακτηρίσει καλλιέργειες νευροσφαιρών ιδρύθηκε από ποντίκια GTML. ανάλυση απλών κυττάρων αποκάλυψε ότι η επέκταση ενός ομογενούς πληθυσμού κυττάρων εξαρτάται από την MYCN έκφρασης για την επιβίωση. Αυτά τα σφαιροειδή είναι ανθεκτικά σε διαφοροποίηση, και να έχουν χαρακτηριστικά χαρακτηριστικό μερικώς δεσμευτεί νευρικών βλαστικών και των προγονικών κυττάρων με την έκφραση MYCN, συμπεριλαμβανομένων προς τα πάνω ρύθμιση νεστίνη, CD133, Otx2, και Musashi, των οποίων η έκφραση είναι συνδεδεμένες με τη συντήρηση μια αδιαφοροποίητη κατάσταση, και τυπικά του MB-βλαστικών /προγονικών κυττάρων. Παρεγκεφαλίδας εμφύτευση GTML νευροσφαιρών υποπληθυσμών έδειξε ότι ο όγκος του πολλαπλασιαστικού δυναμικού κατοικούσε στο CD133 + αλλά δεν CD15 + ή κύτταρα CD15-. Επιπλέον, η θεραπεία των όγκων με MLN8237, μια aurora-ένας αναστολέας κινάσης που επάγει MYCN ογκοπρωτείνης αποδόμησης [13], επεκτάθηκε αποτελεσματικά το ποσοστό επιβίωσης των ποντικών GTML με επιθετικά ΜΒ. Αυτά τα αποτελέσματα αποσαφήνιση του ρόλου της MYCN στον κυτταρικό μετασχηματισμό και την εξέλιξη της ΜΒ, ενισχύοντας την υπόθεση ότι MYCN οδηγεί την επέκταση και εμπλουτισμό των καρκινικών κυττάρων-πολλαπλασιαστικό CD133 + ικανή να παράγει επιθετική MB.

Υλικά και Μέθοδοι

ποντίκι εκτροφής

Το μοντέλο ποντικού GTML έχει περιγραφεί στο παρελθόν [11]. Όλες οι διαδικασίες ποντίκι εγκρίθηκαν από το Ινστιτούτο Ηθικής Επιτροπής Cancer Research UK ακόλουθες κατευθυντήριες γραμμές του Υπουργείου Εσωτερικών (Έργο Αριθμός Αδείας: 70/7945). Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις διεξήχθη κάτω από αναισθησία isoflurothane, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία.

απομόνωση Νευροσφαιρών και τον πολιτισμό

Ο ιστός απομονώθηκε από όγκους GTML ή στη μεταγεννητική P5, P8, P21 παρεγκεφαλίδας και του μεσεγκεφάλου και μεταφέρθηκε σε κρύο HBSS (Invitrogen). Οι ιστοί στη συνέχεια κόβονται σε 2-3mm

2 τεμάχια και ενζυματικά διαχωρίστηκαν στους 37 ° C χρησιμοποιώντας Liberase Blendzyme 1 (0,62 μονάδες Wunsch /ml, Roche) σε PBS για 15-45 λεπτά. Η ενζυμική αντίδραση σταμάτησε χρησιμοποιώντας 10% του όγκου του ορού εμβρύου βοός (FCS, ΡΑΑ) προτού τα κύτταρα κονιορτοποιήθηκε εντός DMEM /F12 μέσο που περιέχει Β27 και διηθείται διαμέσου ενός πλέγματος 70 μm. Ακολούθως τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 μέσο (Invitrogen) συμπληρωμένου με 2% συμπλήρωμα Β27 (Invitrogen), 20 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF, Sigma), 20 ng /ml αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (bFGF-βασική, Invitrogen) και 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη.

Για να εξεταστεί ποσοστά κυτταρικής διαίρεσης, νευροσφαίρες διαχωρίστηκαν με σιφώνιο, και τα κύτταρα βάφτηκαν με κυανούν του τρυπανίου μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας αιμοκυτόμετρο. Εναλλακτικά, τα κύτταρα μετρήθηκαν με τη χρήση του οργάνου γκουάβα PCA-96 μετά από χρώση με αντιδραστήριο γκουάβα ViaCount Flex (1:50, Millipore), σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών.

Για την αξιολόγηση των δυνατοτήτων διαφοροποίησης, τα κύτταρα απλώθηκαν σε καλυπτρίδες επικαλυμμένα με πολυ-ϋ-λυσίνη (0,1 Μ, Sigma), 0,1% ζελατίνη ή λαμινίνη (0,5 μg-2.0μg /ml, Invitrogen) και αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες διαφοροποίησης για μέχρι 14 ημέρες. μέσο διαφοροποίησης αποτελείται μέσου /F12 ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FCS, Β27 με ή χωρίς 1 μg /ml ρετινοϊκό οξύ (Sigma Aldrich). Μπορούμε επίσης επιχρυσωμένο πρόσφατα ταξινομημένα κύτταρα GTML παρουσία 0.5-1.0mg /ml κολλαγόνου (Invitrogen? A1048301). Στην προ-διαφοροποίηση των μέσων ενημέρωσης Neurobasal με ορό

ορθοτοπική εμφύτευση

Για να εξετάσει ο ογκογόνο δυναμικό, τα κύτταρα που λαμβάνονται απευθείας από πρωτοπαθείς όγκους, GTML σφαίρες, ή τα παράγωγά τους επαναιωρήθηκαν σε μέσα νευροσφαιρών και εγχέεται στο παρεγκεφαλίδα του FVB /N θηλυκοί ποντικοί: ακόλουθους αριθμούς κυττάρων εμφυτεύθηκαν: πρωτογενείς όγκους (25 ή 100 κύτταρα /θέση ), κύτταρα M10519 (χωρία 10-27, 25 έως 10.000 κύτταρα /θέση) ή πρόσφατα ταξινομημένα κύτταρα (10 κύτταρα /θέση).

Ποντίκια ηλικίας 6-8 εβδομάδων αναισθητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την εισπνοή του αναισθητικού isoflurothane. Μια τομή (1cm

2) έγινε στη μέση γραμμή του τριχωτού της κεφαλής πάνω από την παρεγκεφαλίδα, και μια μικρή τρύπα με διάμετρο 1 mm έγινε στο κρανίο με οδοντικό τρυπάνι σε μια θέση ενός χιλιοστού πλευρικά από τη μεσαία γραμμή και μεταξύ 1 και 2 mm πίσω από τη lambdoidal ράμμα αποφεύγοντας τυχόν εμφανή αιμοφόρα αγγεία. Τα κύτταρα εγχύθηκαν σε ένα βάθος 2 mm χρησιμοποιώντας μία σύριγγα 10 μΐ Hamilton σε ένα στερεοταξικό πλαίσιο. Η βελόνα αφέθηκε στη θέση του για ακόμη 2 λεπτά για να αποφευχθεί αναρροή. Η βελόνα αφαιρέθηκε προσεκτικά για να αποφεύγεται η αποκόλληση των καρκινικών κυττάρων. Το κρανίο στη συνέχεια σφραγίστηκε χρησιμοποιώντας χειρουργική κόλλα. Μετά την εμφύτευση της προόδου των όγκων παρακολουθήθηκε εβδομαδιαία χρησιμοποιώντας το Σύστημα εικόνας IVIS Living (δαγκάνας Life Sciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. απεικόνισης λουσιφεράσης πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11] εκτός του ότι D-λουσιφερίνη άλας καλίου (Parkin Elmer) σε PBS χρησιμοποιήθηκε σε 15 mg /kg.

θεραπεία δοξυκυκλίνη διεξήχθη όπως περιγράφεται στο προηγούμενο έγγραφο μας [11] . Εν συντομία, οι ποντικοί με όγκους προοδευμένη μετριέται με ένα σήμα από 1×10

9 φωτόνια /s τράφηκαν με τροφή (TestDiet) που περιέχει δοξυκυκλίνη στα 200 mg /kg να παρέχει μία ημερήσια δόση των περίπου 32 mg /kg. Tumor φορτίο προσδιορίστηκε με βιοφωταύγεια.

Ανοσοϊστοχημεία και ανοσοκυτταροχημεία

Για νευρόσφαιρες ανοσοκυτταροχημεία εγκλείστηκαν σε OCT τοποθέτησης μέσα (BDH) και αργά καταψύχονται χρήση ισοπροπανόλης ψύχθηκε σε υγρό άζωτο. Στη συνέχεια, 4 μm πάχους κρυοτομές τοποθετήθηκαν επί επικαλυμμένων διαφάνειες πολυ-λυσίνη (VWR) και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA, Sigma) σε PBS για 10 λεπτά. Μετά από επακόλουθη πλύσεις με TBS Οι τομές στη συνέχεια αποκλείστηκαν με αλβουμίνη 10% βόειου ορού (BSA, Sigma), 15 mM γλυκίνη (Sigma) και 0,02% Triton Χ100 (Sigma) σε TBS επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Για αντισώματα ποντικού τομές φράχθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ αποκλεισμού MOM (Vector Laboratories) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι τομές επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα όλη τη νύχτα σε διάλυμα αποκλεισμού (0,1% BSA-PBS) σε θερμοκρασία δωματίου και μετά από επακόλουθη πλύσεις με TBS πλακίδια σημάνθηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με Alexa Fluor (1: 500, Molecular Probes). Τα πλακίδια επιχρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (Sigma) και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν με Fluoromount G (Southern Biotech).

Για ανοσοϊστοχημεία, δείγματα όγκου μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 24 ώρες για να 7 ημέρες. Δείγματα απασβεστωμένες με 0.3Μ EDTA και στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία με τη χρήση του επεξεργαστή ιστού Leica ASP300S να δημιουργήσει ένα μπλοκ κερί παραφίνης. Κόπηκαν τομές στα 4μΜ για χρώση αιματοξυλίνης και ηωσίνης και ανοσοϊστοχημική διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]

Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία και ανοσοκυτταροχημεία ήταν:. MYCN (OP-13, Calbiochem), Ki67 (556003, Βϋ Pharmingen ), GFAP (Z0334, DAKO), CD15 (332778, BD Bioscience), Tuj 1 (BAM1195, R & amp?. Δ), διασπασμένη κασπάση 3 (9664, Cell Signaling)

ανοσοκηλίδας ανάλυση

νευροσφαιρία καλλιεργήθηκαν υπό κανονικές και διαφοροποίηση συνθήκες παρουσία ή απουσία 1 μg /ml δοξυκυκλίνης. Σφαίρες συλλέχθηκαν, και στη συνέχεια εναιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρου (Cell Signaling Technology) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση διεξήχθη όπως περιγράφεται [14]. Μετά αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: MYCN (OP-13, Calbiochem), c-MYC (SC-40, Santa Cruz), νεστίνη (ab5968, Abcam), βήτα-ακτίνη (4967, Cell Signaling Technology) και GAPDH (2118, Cell Signaling Technology).

κυτταρομετρία ροής και με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογή

Για τις αναλύσεις του κυτταρικού κύκλου, GTML σφαίρες υπέστησαν επεξεργασία με 1 μg /ml δοξυκυκλίνης και ελήφθησαν δείγματα στις 0, 2, 4, 6, 8, 24, και 48 ώρες. Τα δείγματα σταθεροποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 70% παγωμένης αιθανόλης, και στη συνέχεια φυλάχθηκαν στους 4 ° C για τουλάχιστον 30 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (40μg /ml, Invitrogen) στους 37 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια φυλάχθηκαν στους 4 ° C για 24 ώρες. προφίλ κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αναλυτή φθορισμού κυττάρου που ενεργοποιείται Becton Dickinson LSR II.

Για την απομόνωση του CD15 + και CD15- των πληθυσμών ή CD133 + και CD133-, M10519 GTML νευροσφαίρες διαχωρίστηκαν σε απλά κύτταρα, και στη συνέχεια βάφτηκαν με αντι-CD15 συζευγμένο με FITC (1: 100, Millipore) ή αντι-CD133 συζευγμένο με ΡΕ (1: 100, Miltenyi Biotec) για 30 λεπτά επί πάγου, πλύθηκαν με PBS που περιέχει 0.3% αλβουμίνη βόειου ορού με αντιβιοτικά. Τα κύτταρα στη συνέχεια βάφτηκαν αντίθετα με 0.5μg /ml του ϋΑΡΙ σε PBS και ταξινομούνται μέσω ενός Becton Dickinson FACS Aria. Κύτταρα ταξινομήθηκαν σε DMEM media /F12 που περιέχει αυξητικούς παράγοντες και Β27. Η καθαρότητα του κάθε πληθυσμού εκτιμήθηκε στο τέλος κάθε είδους χρησιμοποιώντας την ίδια συσκευή.

Καθαρισμός του CD133 κύτταρα

+/- χρήση μαγνητικών σφαιριδίων

M10519 GTML νευρόσφαιρες διαχωρίστηκαν σε μεμονωμένα κύτταρα με τη χρήση του Νευροσφαιρών κιτ διαχωρισμού P (Miltenyi Biotec) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά την διάσπαση, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 500xg για 10 λεπτά και στη συνέχεια σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 1 ml PBS συμπληρωμένο με 2% FBS και 1 mM EDTA (διαλογή ρυθμιστικό). Απομόνωση CD133 + και των πληθυσμών CD133- αρχικά πραγματοποιείται μέσω μαγνητικού διαχωρισμού (Easysep, StemCell Technologies), που ακολουθείται από ένα τελικό στάδιο καθαρισμού με τη χρήση του FACS ARIA (BD Biosciences). Το κυτταρικό εναιώρημα (0,5 ml, 2×10

7 κύτταρα) επωάστηκαν με 50 μΙ αντι-CD133 (προμινίνη-1) ΡΕ-συζευγμένο αντίσωμα (Miltenyi Biotec) ή αντι-IgG

1 συζευγμένο με ΡΕ (Miltenyi Biotec) για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με διαλογή ρυθμιστικό διάλυμα και επωάστηκαν με 100 μΐ κοκτέιλ ΡΕ-επιλογής (kit επιλογή EasySep ΡΕ, StemCell Technologies) ανά 1 ml του διαλογής ρυθμιστικό για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου μετά την προσθήκη των νανοσωματιδίων EasySep 50 μΙ ανά 1 ml του κυτταρικού εναιωρήματος προ της μαγνητικής διαχωρισμός. Για να βελτιωθεί η καθαρότητα, η διαδικασία μαγνητικού διαχωρισμού επαναλήφθηκε σύνολο τρεις φορές. Η καθαρότητα του σφαιριδίου-δεσμευμένου ή -unbound κλάσματα εκτιμήθηκε με τη χρήση του αναλυτή LSRII FACS (BD Biosciences). Αμφότερα τα κλάσματα CD133 + και CD133- καθαρίστηκαν περαιτέρω από δεσμευμένο σε σφαιρίδια και μη συνδεδεμένο με κλάσματα, αντίστοιχα, με τη χρήση του FACS ARIA (BD Biosciences). 7ΑΑΌ (Beckman Coulter) χρησιμοποιήθηκε για να αποκλείσει τα νεκρά κύτταρα σε αναλύσεις FACS. Τα ζωντανά κύτταρα μετρήθηκαν με βαφή κυανούν τρυπανίου πριν από την ορθοτοπική εμφύτευση (10 κύτταρα ανά θέση).

περιορισμένης αραίωσης ανάλυση

Τα κύτταρα M10519 (100, 10, και 1 κύτταρο (α) ανά 100 μλ Neurobasal μέσα παρουσία αυξητικών παραγόντων) τοποθετήθηκαν σε τρυβλίο 96 φρεατίων για παρατεταμένη καλλιέργεια. Τα κύτταρα παρακολουθούνται δύο φορές την εβδομάδα για την αξιολόγηση του σχηματισμού σφαίρα, και στη συνέχεια η τελική εκτίμηση έγινε περίπου 4 εβδομάδες μετά τη σπορά.

Εκκινητές για δοκιμασίες απλού κυττάρου

Για τη μελέτη αυτή, μπορούμε αρχικά σχεδιασμένο 48 εκκινητές για (i) παράγοντες που εκφράζονται σε τρεις διακριτές MB υποτύπους [5,15-17], (ii) είναι γνωστές σημειωτές νευρικών βλαστικών κυττάρων, (iii) δείκτες γνωστές καρκίνο και (iv) στόχων MYCN. Εξετάσαμε αυτά μαζί με 93 εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ποντικού σε προηγούμενες μελέτες μας [18,19] για την επικύρωση αστάρι χρησιμοποιώντας cDNA από GTML και τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα ποντικού. Από 141 εκκινητών, επιλέξαμε 96 εκκινητές που πέρασαν την επικύρωση εκκινητή, η διαδικασία της οποίας έχει περιγραφεί προηγουμένως [18].

διαλογή κυττάρων για δοκιμασίες απλού κυττάρου

Η ακρίβεια της διαδικασίας διαλογής προσδιορίστηκε ως εξής. Πρώτον, 2×10

5 κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας 0.4μL διοξική καρβοξυφθορεσκεϊνη Ν-ηλεκτριμιδυλ εστέρας (CFSE) φθορίζουσα χρωστική (Sigma Aldrich), και μονό κύτταρα ταξινομήθηκαν με χρήση διαλογέα κυττάρων Becton Dickinson σε διαφάνειες AG480F (Beckman Coulter). Στη συνέχεια, η παρουσία των επισημασμένων κυττάρων επιθεωρήθηκε κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού CKX41 (Olympus) για να επιβεβαιώσει ότι μόνο ένα κύτταρο επισημάνθηκε σε μία θέση αντίδρασης του κλείστρου. Εάν δύο κύτταρα βρέθηκαν σε ένα μόνο σημείο της αντίδρασης, τη βαθμονόμηση της μηχανής διαλογής ήταν επαναλαμβάνεται από την αρχή. Μόλις διαλογή ακρίβεια επιβεβαιώθηκε, τα κύτταρα του δείγματος σημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο, ταξινομημένα σε σωλήνες PCR, και στη συνέχεια καταψύχονται. Τα κύτταρα στη συνέχεια αποψύχθηκαν σε πάγο για τη διάρρηξη των κυτταρικών μεμβρανών.

αντίστροφη μεταγραφή και στόχου-ειδική ενίσχυση

Η πειραματική λεπτομέρεια περιγράφεται στο προηγούμενο έγγραφο μας [18]. Εν συντομία, ανάστροφη μεταγραφή και το cDNA ενίσχυση διεξήχθησαν ως ακολούθως. Η αντίδραση επωάστηκε στους 50 ° C για 15 λεπτά, 95 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενη από 18 κύκλους των 95 ° C για 15 δεύτερη και 60 ° C για 4 λεπτά. Τα μη ενσωματωμένα εναύσματα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν με κατεργασία με εξωνουκλεάση Ι (Εχο Ι, ΝΕΒ). Ένα μείγμα της αντίδρασης περιέχει 10 μΐ ενισχυμένου cDNA, 0.4μL 10 ρυθμιστικού x Εχο Ι, 0.8μl Εχο Ι ενζύμου (20U /μl), και 2.8μl του βαθμού νερό RT-PCR. Η αντίδραση διατηρήθηκε στους 37 ° C για 30 λεπτά, στη συνέχεια στους 80 ° C για 15 λεπτά για την απενεργοποίηση του Exo I. Τέλος, Αναστολή DNA Buffer (36μΙ) προστέθηκε σε κάθε δείγμα (σύνολο 50 μλ).

Αναλύσεις χρησιμοποιώντας το σύστημα BioMark

Πειραματικές λεπτομέρειες περιγράφονται στα προηγούμενα έγγραφα μας [19] [18], εκτός από το ότι χρησιμοποιείται 96×96 γονιδιακής έκφρασης πλάκες IFC Array (Fluidigm Corporation) σε αυτή τη μελέτη. Δείγμα και μίγματα εκκινητή φορτώθηκαν χωριστά για εισόδους που βρίσκονται και στις δύο πλευρές της συστοιχίας. Ένα μείγμα αντίδρασης BioMark qPCR αποτελείται από 2,5 μΙ του 2xTaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems), 0.25μl του αντιδραστηρίου Δείγμα Φόρτωση 20x DNA Binding Dye (Fluidigm Corporation), 0.25μl των 20x βαφής EvaGreen DNA δεσμευτική (Biotium) και 2μΙ Εχο Ι-επεξεργασμένο δείγμα cDNA. Ένας εκκινητής μίγμα της αντίδρασης που αποτελείται από 2,5 μΙ Αντιδραστηρίου 2xAssay Φόρτωση, 1.25μl του Αναστολή DNA Buffer, και 1.25μl ενός ζεύγους εκκινητή 20 μΜ. φόρτωση του δείγματος έγινε σύμφωνα με το εγχειρίδιο οδηγιών του συστήματος BioMark.

Δεδομένα επικύρωση

Για την αξιολόγηση του σχηματισμού μη ειδικών προϊόντων ενίσχυσης, λόγω διμερούς αρχικού τεμαχίου σχηματισμού ή μη-ειδική ανόπτηση, Διενεργήσαμε τήξης καμπύλη αναλύσεις για κάθε εκκινητή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18].

η στατιστική ανάλυση

Cq τιμές υψηλότερες από το όριο για αξιόπιστες τιμές Cq (Cq

κατώφλι, S1 πίνακα) ήταν παραλείπονται από τις στατιστικές αναλύσεις όπως περιγράφεται [18]. ανάλυση κύριο συστατικό και η ανάλυση ιεραρχικής ομαδοποίησης (μέθοδος του Ward) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας R. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι για τις αναλύσεις ομαδοποίηση και ανάλυση κύριο συστατικό, Cq τιμές υψηλότερες από ό, τι Cq

όριο αντιμετωπίστηκαν ως αναξιόπιστες τις τιμές, και έτσι ήταν όλα αντικατασταθεί με CQ

όριο + 1δ. Η δοκιμή Kolmogorov-Smirnov χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις διαφορές των διανομών συντελεστή συσχέτισης των συνόλων δεδομένων που προέρχονται από δύο παρτίδες δειγμάτων, λόγω της παρουσίας του ασυμμετρίας του αριθμού διανομής και άνιση παρατηρήσεων μεταξύ σύγκριση ομάδων, οι οποίες δεν ήταν κατάλληλα για τη διεξαγωγή ισχυρότερη δοκιμές. Η δοκιμασία log-rank χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η διαφορά των κατανομών επιβίωσης των δύο ομάδων του δείγματος.

Αποτελέσματα

Δημιουργία γραμμών νευρόσφαιρα GTML

Σε αυτή τη μελέτη με στόχο να εντοπίσει καρκινικά κύτταρα-πολλαπλασιαστικό σε MB, και να καθιερώσει ένα αποτελεσματικό σύστημα μελέτη προ-κλινική για να εξετάσει τις δυνατότητες των μικρών μορίων στην πρόληψη της ανάπτυξης του όγκου. Χρησιμοποιήσαμε το

Glt1-tTA /TRE-MYCN-λουσιφεράσης

(GTML) μοντέλο διαγονιδιακού ποντικού, στην οποία η καταστολή της ανθρώπινης MYCN και λουσιφεράσης είναι επιτεύξιμη σε ϋΟΧ-εξαρτώμενο τρόπο στον εγκεφαλικό ιστό [11,12] ( S1 Σχ.). Σε αυτό το σύστημα, η ανάπτυξη του όγκου είναι να προληφθεί με DOX και εξέλιξης του όγκου είναι ορατή χρησιμοποιώντας

in-vivo

bioluminescent απεικόνισης (S1 Σχ.)? τόσο το φορτίο του όγκου και

in vitro

κυτταρική ανάπτυξη είναι γραμμικά συσχετίζεται με την ένταση του σήματος της λουσιφεράσης (S1 Σχ.) [11].

Πρωτογενής ιστοί χειρουργικά απομονώνονται από αναπτυσσόμενους όγκους παρακολουθήθηκε με εβδομαδιαία απεικόνισης λουσιφεράσης ( Το Σχ. 1Α και S1 Εικ.). Οι όγκοι αποκόπηκαν διαχωρίστηκαν και καλλιεργήθηκαν σε μέσο Neurobasal χωρίς ορό που περιέχει EGF και bFGF [20], και καθορίστηκε νευροσφαίρες εντός 3-7 ημερών (Εικ. 1Α), σε αντίθεση με έκφυτα από μεσεγκεφάλου ή παρεγκεφαλίδα από ποντικούς άγριου τύπου (η οποία είχε μια περιορισμένη διάρκεια ζωής 7-10 περάσματα). Κύτταρα ιδρύθηκε από τουλάχιστον 6 διαφορετικές πρωτοπαθείς όγκους σε διάφορες ηλικίες ήταν αθάνατος και παρουσίασαν ένα χρόνο διπλασιασμού περίπου 24 ώρες. (S2 Πίνακας και S1 Εικ.). Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν την ύπαρξη ενός εξαιρετικά πολλαπλασιασμού, μετασχηματισμένες κυτταρικές πιθανότατα οδηγείται από την έκφραση MYCN διαγονιδίου.

(A) Καθιέρωση σφαίρες GTML στον πολιτισμό. Πρωτογενή κύτταρα απομονώθηκαν από GTML όγκους, οι οποίες ταυτοποιήθηκαν μέσω των σημάτων βιοφωταύγειας (άνω αριστερά) και τη μορφολογία, και στη συνέχεια διαχωρίστηκαν σε απλά κύτταρα. M10519 GTML νευρόσφαιρες καλλιεργηθούν μετά από 10 ημέρες εμφανίζονται επίσης. μπαρ κλίμακας: 100 μm. (Β) Επίδραση της απόσυρσης MYCN στην κυτταρική ανάπτυξη. M10519 GTML σφαίρες σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1×10

5 κύτταρα /ml παρουσία ή απουσία 1 μg /ml του DOX, και τον πολλαπλασιασμό των σφαιρών μετρήθηκαν με WST-1 προσδιορισμό μεταβολικών. Οι ράβδοι σφάλματος, ± SD. (C) Επίδραση της MYCN απόσυρσης για τον κυτταρικό κύκλο. M10519 GTML νευρόσφαιρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DOX πριν από τον κυτταρικό κύκλο αναλύσεις χρησιμοποιώντας FACS. (D) αναλύσεις Western. M10519 GTML σφαίρες καλλιεργήθηκαν με 1 μg /ml του DOX.

Η

Για να εξεταστεί ο ρόλος της MYCN στην ανάπτυξη των κυττάρων GTML, θα αντιμετωπίζονται νευροσφαίρες M10519 GTML (καθώς και επιπλέον κυτταρικές σειρές, δείτε S2 Εικ .) με DOX, και βρήκαν σαφείς ενδείξεις ότι η αύξηση εξαρτάται από MYCN (Εικ. 1Β). κυτταρικού κύκλου αναλύσεις χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής έδειξε σαφή συσσώρευση κυττάρων περιορισμένης ανάπτυξης στη φάση G1, μέσα σε 4 έως 6 ώρες θεραπείας (Εικ. 1C), της ανάπτυξης του συμπίπτει με την πλήρη καταστολή της MYCN, αλλά όχι πρωτεΐνη c-Myc (S1 Εικ . και S3 Εικ.), μειωμένα επίπεδα Κί67, ενός δείκτη πολλαπλασιασμού και νεστίνη, μια νευρικά βλαστικά ή /και δείκτη προγονικών, στις 48 ώρες μετά την απόσυρση του MYCN (Εικ. 1 D και S1 Εικ.). Είναι ενδιαφέρον ότι, σε αντίθεση με προηγουμένως καθιερωμένες γραμμές GTML μας με άγριου τύπου

Trp53

[12], συνελήφθη κύτταρα GTML επεκτάθηκε γρήγορα μετά την απομάκρυνση του DOX (S1 Σχ.), Γεγονός που υποδηλώνει ότι η απόσυρση MYCN είναι κυτταροστατική σε ένα κλάσμα του Αυτά τα κύτταρα και ότι διακοπή αύξησης είναι αναστρέψιμη. Η ασυνέπεια μεταξύ των κυττάρων GTML χρησιμοποιούνται στις δύο μελέτες μπορεί να οφείλεται, τουλάχιστον εν μέρει, στο γεγονός ότι το σύνολο των κυττάρων GTML εγκατεστημένος στην παρούσα μελέτη λιμάνι αυθόρμητες μεταλλάξεις στην περιοχή της

Trp53

γονίδιο που κωδικοποιεί η περιοχή ρ53 που δεσμεύεται με DNA [3]. Αναλάβαμε ανάλυση για να διαπιστωθεί κατά πόσον αντισταθμιστική αναρρύθμιση του c-myc πρωτεΐνη ποντικού εμπλέκεται στην απελευθέρωση από διακοπή του κυτταρικού κύκλου και βρήκαν ότι τα επίπεδα c-Myc ήταν σταθερή (S1 Σχ. Και. S3 Εικ), γεγονός που υποδηλώνει ότι τουλάχιστον σε καλλιέργειες νευροσφαιρών μας , c-Myc δεν αντισταθμίζει τη μείωση των MYCN (όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για να εμφανιστούν σε νευρωνικά προγονικά κύτταρα [21]). Κλωνογόνος δυναμικά κυττάρων M10519, μία από τις γραμμές GTML, εξετάστηκαν μέσω δοκιμασιών δευτερεύουσα σφαίρα, που δείχνουν ότι το 42% των μεμονωμένων κυττάρων M10519 ήταν ικανά να σχηματίζουν σφαίρες σε καλλιέργεια (S4 Σχήμα).

έκφραση MYCN οδηγεί επέκταση των κυττάρων εκφράζοντας δείκτες που είναι τυπικοί των νευρικών βλαστικών και /ή προγονικών κυττάρων και ΜΒ

Για να χαρακτηριστεί GTML νευροσφαιρών, εξετάσαμε την έκφραση των δεικτών νευρικών βλαστικών /προγονικών κυττάρων με ανοσοκυτταροχημεία. Βρήκαμε ότι νεστίνη, ένας δείκτης για νευρικά βλαστικά /προγονικά κύτταρα, και ο δείκτης πολλαπλασιασμού Ki67 εκφράστηκαν σε GTML νευρόσφαιρες σε ένα MYCN-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 2Α). Η έκφραση ενός νευρώνα-ειδική προγονικών δείκτης Tuj 1 [22] δεν ήταν ωστόσο εμφανώς μεταβληθεί από απόσυρση MYCN (Εικ. 2Α), υποδηλώνοντας ότι η εξάντληση των MYCN δεν επηρεάζει δραματικά το βαθμό διαφοροποίησης σε καλλιέργεια. Σε αντίθεση με προηγούμενες παρατηρήσεις μας σε ιστούς GTML [11], χωρίς εξέχοντα μείωση διασπασμένη κασπάση 3, έναν δείκτη της απόπτωσης, παρατηρήθηκε αμέσως μετά την απόσυρση MYCN (Σχ. 2Α και S3 Εικ.). Για να αποκτήσετε μια πιο λεπτομερή εικόνα της γονιδιακής έκφρασης στο επίπεδο του ενός κυττάρου, αναλύσαμε μια σειρά M10519 (βρήκαμε GTML γραμμές που καθορίζονται στην παρούσα μελέτη ήταν αξιοσημείωτα παρόμοια) χρησιμοποιώντας 96-plexed μόνο κύτταρο qRT-PCR (S5 Σχ. Και S6 Εικ .). Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι οι κοινές δείκτες για MB και νευρικών βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων NeuroD1 [23], CD133 (προμινίνη 1) [24-27], Otx2 [11,28], και Μουσάσι [29] ρυθμίστηκαν προς τα κάτω από την απόσυρση MYCN (Εικ. 2Β και S5 Εικ.). Η συχνότητα των κυττάρων που εκφράζουν δείκτες, συμπεριλαμβανομένων CD133 και Μουσάσι ήταν επίσης μειώθηκε κατά DOX, ενώ άλλοι δείκτες βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων Sox2 δεν επηρεάστηκαν από την απόσυρση MYCN (Σχ. 2C και S5 Εικ.). Έκφραση των δεικτών για αστροκυττάρων και επενδυματικά κύτταρα (GFAP) [30], αστροκύτταρα (S100b) [31], πρόγονοι κόκκος νευρώνα και γλοιώματος (Olig2) [32-34] ήταν μόλις ανιχνεύσιμη (S5 Εικ.) Ή σπάνια παρατηρούνται (S5 Εικ .) σε απλό κύτταρο αναλύσεις. Συσχετίζεται με την ταχεία ανάπτυξη στον πολιτισμό, MYCN έκφραση ρυθμίζεται προς τα πάνω ρυθμιστές πλοίαρχο για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, E2F1 και E2F2, δύο εκ των οποίων είναι MYCN στόχους [35] (S5 Εικ.). CD133, ένας δείκτης για S, G2 και Μ φάσεις των νευρικών βλαστικών κυττάρων [36] (Εικ. 2Β και 2C). MYCN, όπως αναμενόταν, ήταν μόλις ανιχνεύσιμη σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με M10519 DOX (Σχ. 2Β και 2C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα αποτελέσματα της έκφρασης MYCN στην επέκταση των κυττάρων με δείκτες που είναι τυπικοί των νευρικών βλαστικών κυττάρων και /ή προγονικά κύτταρα που σχετίζονται με ογκογένεση MB.

(Α) σφαίρες M10519 GTML υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς DOX για 17 ημέρες. Η ανάλυση ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε σε υποβλήθηκαν σε κρυοτομή σφαίρες με αντι-Κί67, αντι-νεστίνη, ή αντι-Tuj 1, αντι-GFAP, και αντι-c-κασπάσης 3 μαζί με αντι-MYCN. Πυρήνες αντίθετα με DAPI. Μπαρ, 50 μm. (Β) Ένας χάρτης θερμότητας για κατά μέσο όρο επίπεδα έκφρασης (τιμές Cq, n = 96), της 13ης νευρικών γονιδίων βλαστοκυττάρων εμφανίζονται. (γ) Τα ποσοστά των κυττάρων που εκφράζουν CD133, Musashi, Sox2, MYCN, και CD15 φαίνεται. Εξετάσαμε WT1 και Wt2 κύτταρα (βλέπε το κείμενο), χωρίς θεραπεία σφαίρες M10519 (M10519), M10519 σφαίρες που έλαβαν θεραπεία με DOX για 24 ώρες (Dox), ή σφαίρες M10519 αγωγή με MLN8237 για 24 ώρες (MLN8237).

Η

96-γονίδιο (βλέπε πίνακα S3 και Janos

et al

[19]) προφίλ έκφρασης για 96 μεμονωμένα κύτταρα M10519 εμφανίζεται ένα βαθμό ετερογένειας (S6 Εικ.). Τα δεδομένα έκφρασης HD μόνο κύτταρο BioMark παρουσιάζονται στον Πίνακα S3. Για να αξιολογηθεί η διαφορά των διανομών συντελεστή συσχέτισης των συνόλων δεδομένων που προέρχονται από δύο πληθυσμούς, χρησιμοποιώντας το τεστ Kolmogorov-Smirnov υπολογίσαμε κατά ζεύγη συντελεστές συσχετισμού των επιπέδων έκφρασης γονιδίων για 96 σε ένα δεδομένο κυτταρικό πληθυσμό. Ο συντελεστής συσχέτισης μέση (

R

) για M10519 νευροσφαιρίδια ήταν 0.77, και η διαφορά μεταξύ των κυττάρων M10519 και WT1 (

R

= 0,71, Ν

M10519 = 1081, Ν

WT1 = 990, D = 0.2662,

P

= 2.2×10

-16) ή Wt2 (

R

= 0,60, Ν

M10519 = 1081, Ν

Wt2 = 990 D = 0.57,

P

= 2.2×10

-16) κύτταρα ήταν στατιστικά σημαντική. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι ενώ τα προφίλ έκφρασης των μεμονωμένων κυττάρων στον πληθυσμό νευροσφαιρών M10519 δεν είναι πλήρως ομοιογενή χαρακτήρα, τα προφίλ μεταγραφής μεταξύ των κυττάρων σε WT1 και καλλιέργειες νευροσφαιρών Wt2 που προέρχονται από φυσιολογικό παρεγκεφαλίδα είναι σημαντικά πιο ετερογενής. Επιπλέον, MYCN απόσυρση ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση του δείκτη ετερογένειας (

R

= 0,69, Ν

M10519 = 1.081, N

M10519 + Dox = 990, D = 0,27,

P

= 2.2×10

-16). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση MYCN ανυψώνει το επίπεδο της κυτταρικής ομοιογένεια και επεκτείνει κυττάρων με νευρικούς δείκτες αρχέγονων και προγονικών.

δίσκους MYCN επέκταση των κυττάρων ανθεκτικών σε ερεθίσματα διαφοροποίηση σε καλλιέργεια

Είναι ενδιαφέρον, παρά την βλαστικών κυττάρων και /ή το προφίλ μεταγραφής προγονικά-όπως των αυξημένων κυττάρων σε καλλιέργειες νευροσφαιρών, τα κύτταρα GTML εκφράζουν MYCN εμφανίζεται μόνο περιορισμένη διαφοροποίηση δυναμικό

in vitro

. Μετά 8 ημέρες ανάπτυξης σε μέσα προ-διαφοροποίηση που περιέχει ορό, βρήκαμε ότι τρεις γραμμές GTML διατηρείται μορφολογικά χαρακτηριστικά τυπικά μη διαφοροποιημένων κυττάρων (S2 Σχ.), Αν και βρήκαμε ότι η νευρικών βλαστικών /προγονικών δείκτης νεστίνη ήταν μειωτικά μετά από 2 ημέρες MYCN απόσυρσης (Σχ. 1D). Αντίθετα, οι ίδιες συνθήκες που επάγεται διαφοροποίηση νευροσφαιρίων εγκατεστημένος από άγριου τύπου παρεγκεφαλίδα (S2 Εικ.). Η φαινομενική απώλεια του δυναμικού διαφοροποίησης σε κύτταρα GTML δείχνουν ότι η γενετική ή επιγενετική αλλαγή μπορεί να συμβεί μετά από παρατεταμένη ενεργοποίηση MYCN. Βρήκαμε επίσης ότι τα κύτταρα GTML απέτυχαν να διαφοροποιηθούν πλήρως κάτω από μια ποικιλία συνθηκών (π.χ. θεραπεία με ρετινοϊκό οξύ, ένας ισχυρός επαγωγέας διαφοροποίησης (S2 Σχ.), Ή καλλιέργεια σε μέσα που περιέχουν 0,5 mg-1 mg /ml κολλαγόνου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται )). Όταν τα κύτταρα M10519 αναπτύχθηκαν σε μέσα προ-διαφοροποίηση που περιέχει ορό και το ρετινοϊκό οξύ, ενώ παρατηρήσαμε την μειορύθμιση του MYCN, η οποία ελέγχεται από το

Glt1

υποκινητή που ενεργοποιείται σε προγονικά και νεστίνη σε 48-96 ώρες , παρατηρούμε κανένα σημαντικές αλλαγές στα επίπεδα των νευρωνικών δεικτών Synaptophysin και Tuj 1 και νευρογλοιακά GFAP δείκτη (S3 Εικ.). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι MYCN αποτελέσματα έκφραση στον εμπλουτισμό των κυττάρων με δείκτες που είναι τυπικοί των βλαστικών και /ή προγονικών κυττάρων, την επέκταση των άκρως πολλαπλασιαστικών κυττάρων ανθεκτικών σε ερεθίσματα διαφοροποίηση οδήγηση. Η φαινομενική απώλεια του δυναμικού διαφοροποίησης GTML σφαίρες είναι σε αντίθεση με νευροσφαιρίδια που προέρχονται από ανθρώπινο MB (για τα οποία

MYCN

καθεστώς δεν εξετάστηκε) [27] ή το

Ptc

– /- μοντέλο ποντικού [37], γεγονός που υποδηλώνει ότι η επίμονη έκφραση MYCN οδηγεί αμετάκλητη δέσμευση για την επέκταση των κυττάρων με νευρωνικά δείκτες βλαστικών και προγονικών.

MYCN γνώμονα νευροσφαιρίδια GTML διατηρούν τις ιδιότητες των πρωτογενών όγκων

in vivo

πρόσφατα έδειξε ότι νευροσφαιρών που προέρχονται από GTML ποντίκια είναι ικανά να σχηματίζουν όγκους σε MYCN τρόπο εξαρτώμενο όταν ορθοτοπικά εμφυτεύεται στο παρεγκεφαλίδα του μη διαγονιδιακά νεογνά [12]. Όπως ήταν αναμενόμενο, η προσθήκη DOX με δίαιτα μειωμένων ταχέως βιοφωταύγειας (Εικ. 3Α) και το φορτίο του όγκου (Σχ. 3Β) σε ποντικούς εμφυτεύθηκαν με κύτταρα M10519. Για την αξιολόγηση των επιπτώσεων της απόσυρσης MYCN

in vivo

, εξετάσαμε την έκφραση των βιοδεικτών σε ορθοτοπική όγκους.