Αφηρημένο

Ιστορικό

λεβαμισόλη, ένα ιμιδαζο (2,1-b) θειαζολίου , έχει αναφερθεί ότι είναι ένας πιθανός παράγων κατά του όγκου. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε το μηχανισμό δράσης ενός από τα πρόσφατα προσδιοριστεί ανάλογα, 4α (2-βενζυλο-6- (4′-φθοροφαινυλο) -5-θειοκυανατο-ιμιδαζο [2,1-b] [1] , [3], [4] θειαδιαζολο).

Υλικά και Μέθοδοι

παραγωγή και έκφραση διαφόρων αποπτωτικών πρωτεϊνών ROS μετρήθηκαν μετά τη θεραπεία 4α σε κυτταρικές σειρές λευχαιμίας. Όγκου ζωικά μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η επίδραση της 4a σε σύγκριση με Λεβαμισόλη στην εξέλιξη της αδενοκαρκινώματος του μαστού και την επιβίωση. Ανοσοϊστοχημεία και κηλίδωση Western έγιναν μελέτες για την κατανόηση του μηχανισμού δράσης 4α και

ex vivo

και

in vivo

.

Αποτελέσματα

Έχουμε προσδιορίσει το IC

50 αξία της 4a σε πολλές λευχαιμικών και του καρκίνου του μαστού και κυτταρικές σειρές που βρέθηκαν κύτταρα CEM πιο ευαίσθητα (IC

50 5 μΜ). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία 4α οδηγεί στη συσσώρευση των ROS. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε αυξητική ρύθμιση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών t-BID και ΒΑΧ, κατά την κατεργασία με 4α. Εκτός αυτού, δοσο-εξαρτώμενη ενεργοποίηση της ρ53 μαζί με FAS, Fas-L, και διάσπαση της κασπάσης-8 δείχνουν ότι επάγει τον υποδοχέα θανάτου που προκαλείται αποπτωτικό μονοπάτι σε κύτταρα CEM. Το πιο σημαντικό, παρατηρήσαμε μια μείωση στην ανάπτυξη του όγκου και σημαντική αύξηση στην επιβίωση κατά τη στοματική χορήγηση της 4a (20 mg /kg, έξι δόσεις) σε ποντικούς. Σε σύγκριση, 4α βρέθηκε να είναι πιο ισχυρή από τη γονική ανάλογο της Λεβαμισόλη βασίζεται τόσο

ex vivo

και

in vivo

μελέτες. Περαιτέρω, ανοσοϊστοχημεία και στύπωμα Western μελέτες δείχνουν ότι η θεραπεία 4α οδήγησε στην κατάργηση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και την ενεργοποίηση της απόπτωσης από την εξωγενή οδό ακόμη και σε ζωικά μοντέλα.

Συμπέρασμα

Έτσι, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι 4α θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα ισχυρό χημειοθεραπευτικό παράγοντα

Παράθεση:. Hegde Μ, Karki SS, Thomas Ε, Kumar S, Panjamurthy Κ, Ranganatha SR, et al. (2012) Νέα Λεβαμισόλη Παράγωγα επάγει εξωγενή οδό απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα και αναστέλλει την εξέλιξη του όγκου σε ποντίκια. PLoS ONE 7 (9): e43632. doi: 10.1371 /journal.pone.0043632

Επιμέλεια: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, Μεξικό

Ελήφθη: 13 Φλεβάρη του 2012? Αποδεκτές: 23 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 Σεπτεμβρίου 2012 |

Copyright: © Hegde et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση από Lady Tata Memorial Trust, Ηνωμένο Βασίλειο, και Ινδικό Ινστιτούτο Επιστημών εκκίνηση επιχορήγησης για SCR. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχει ανταγωνιστικό ενδιαφέρον

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια δύσκολη ασθένεια για τη θεραπεία, και μόνο πολύ λίγα αποτελεσματικά φάρμακα είναι διαθέσιμα. Η ανάπτυξη νέων, αποτελεσματικών, επιλεκτική και λιγότερο τοξικές καρκίνος θεραπευτικών μορίων υπήρξε ένα δύσκολο στόχο. Η κατανόηση του μοριακού μηχανισμού που εμπλέκονται σε καρκίνους θα οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων αντικαρκινικών παραγόντων. Οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης του RNA και πρωτεϊνών λόγω διαφορετικών μεταλλάξεις έχουν μελετηθεί σε πολλούς καρκίνους, συμπεριλαμβανομένης της λευχαιμίας και του λεμφώματος [1] – [4]. Πρόσφατα, έχουν υπάρξει εκτενείς προσπάθειες για το χαρακτηρισμό του μηχανισμού της χρωμοσωμικές μεταθέσεις και διαγραφές καταλήγοντας σε λευχαιμία και λέμφωμα [5], [6]. Πολλές συντήξεις γονιδίου έχουν επίσης ταυτοποιηθεί σε καρκίνους του προστάτη και του καρκίνου του μαστού [7]. Τα πιο συζητημένα πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για τη λευχαιμία και λέμφωμα στο πρόσφατο παρελθόν είναι τα γονίδια ανασυνδυασμού ενεργοποίησης (κουρέλια, το ένζυμο που είναι υπεύθυνο για τη διαφορετικότητα αντισώματος) [5], [6] και της ενεργοποίησης που προκαλείται από απαμινάση (AID, το ένζυμο που είναι υπεύθυνο για τη σωματική υπερμετάλλαξη και την τάξη διακόπτη ανασυνδυασμός) [5], [8]. Ωστόσο, τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη των γονιδίων συγχωνεύσεις δεν έχουν ακόμη προσδιοριστεί.

Οι τελευταίες δύο δεκαετίες έχουν δει μια δραματική αλλαγή στον παραδείγματα θεραπεία του καρκίνου. Για παράδειγμα, imatinib (Gleevac), ένα φάρμακο που αναπτύχθηκε ειδικά έναντι της ενεργοποιημένης κινάσης της τυροσίνης σε χρόνια μυελογενή λευχαιμία, είναι ένα από τέτοια μεγάλες προόδους [9]. Επιπλέον, πολλές άλλες ενώσεις έχουν επίσης ταυτοποιηθεί και κλινικά ελεγμένα. Παρά το γεγονός ότι, η επιτυχία των κλινικών δοκιμών στον προσδιορισμό νέων μέσων και τρόπων θεραπείας υπήρξε σημαντική, οι τρέχουσες θεραπείες έχουν πολλούς περιορισμούς. Αυτό περιλαμβάνει παρενεργειών που προκαλούνται από τα ναρκωτικά και επίκτητη αντίσταση φαρμάκου [10]. Έτσι, η ανάγκη για την ανάπτυξη αποτελεσματικών αντι-καρκινικών θεραπευτικών παραγόντων με καλά καθορισμένα φαρμακοκινητικές ιδιότητες είναι μεγάλης σημασίας.

Επί του παρόντος, υπάρχουν διάφοροι τρόποι με τους οποίους ένα φάρμακο δοκιμάζεται για την αποτελεσματικότητά της ως αντικαρκινικός παράγοντας . Από αυτή την άποψη, διάφορες αποπτωτικά μονοπάτια έχουν μελετηθεί εκτενώς για πολλές ενώσεις να κατανοήσει τη λειτουργία τους της κυτταροτοξικότητας [11]. σημεία κυττάρων ελέγχου κύκλου που προκαλείται από μικρά μόρια έχουν επίσης ερευνηθεί [12], [13].

Λεβαμισόλη αποτελεί ανοσοποίησης σε διαφορετικά καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου, του καρκίνου του μαστού, μελάνωμα, και λευχαιμία [14]. Προηγουμένως, έχει δειχθεί ότι επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε διάφορους καρκίνους [15] και διαμορφώνει τη φωσφορυλίωση αφορούν τόσο την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αντι- ελμινθικές μολύνσεις και διάφορες αυτοάνοσες νόσους [16], [17]. Εκτός αυτού, έχει αποδειχθεί ότι η λεβαμισόλη έχει αντικαρκινική δράση σε συνδυασμό με φθοριοουρακίλη (5-FU) ως επικουρική θεραπεία για όγκους κόμβου-μετάσταση (TNM) III καρκίνωμα του παχέος εντέρου σταδίου (C κατά Dukes) [18].

Ο ιμιδαζο (2,1-b) θειαζολίου παράγωγα Λεβαμισόλη έχουν αναφερθεί ως πιθανοί παράγοντες κατά του όγκου [19]. Αργότερα, κατά του όγκου δραστικότητα του 5-φορμυλ-6-arylimidazo- [2,1-b] -1,3,4-θειαδιαζολο σουλφοναμίδια επίσης αναφερθεί [20]. Με βάση αυτά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα, συνθέσαμε μια σειρά αναλόγων που περιέχουν φθόριο στη θέση 4 από 6-φαινυλ σε ιμιδαζο- [2,1-b] -1,3,4-θειαδιαζολίου και προσδιορίζονται 4α ως επικεφαλής ένωση [21]. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο επάγεται κυτταροτοξικότητα δεν ήταν γνωστή. Άλλωστε, δεν ήταν ποτέ δοκιμαστεί σε ζωικά μοντέλα για τις επιπτώσεις του στην εξέλιξη των όγκων. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι 4α ασκεί την επίδρασή του επί κυττάρων όγκου με την ενεργοποίηση της εξωγενούς οδού της απόπτωσης. Βρήκαμε επίσης ότι 4α αναστέλλει την εξέλιξη του όγκου σε ποντίκια αποτελεσματικά και αυξάνει σημαντικά τη διάρκεια ζωής.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντιδραστήρια

Όλες οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη ήταν αναλυτικής ποιότητας και αγοράσθηκαν από την Sigma-Aldrich, USA. Αντισώματα αποκτήθηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, USA.

Σύνθεση 4α

Σύνθεση και χαρακτηρισμός των 2-βενζυλο-6- (4′-φθοροφαινυλο) -5-θειοκυανατο-ιμιδαζο [2, 1-b] [1], [3], [4] θειαδιαζόλιο, 4α έχει περιγραφεί παλαιότερα [21]. Λεβαμισόλη (υδροχλωρική Τετραμισόλη, Cat Νο. L9756) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich, USA.

Κυτταρική καλλιέργεια

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου, CEM (λευχαιμία Τ-κυττάρων), Κ562 (χρόνια μυελογενής λευχαιμία) REH (λευχαιμία Β-κυττάρων) και Nalm6 (λευχαιμία Β-κυττάρων), καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 (Sera Lab, UK) που περιέχει 10% FBS (Gibco BRL, Η.Π.Α.), 100 U πενικιλλίνης G /ml και 100 μg του στρεπτομυκίνη /ml (Sigma-Aldrich, USA) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. EAC (καρκίνος του μαστού) κυτταρική γραμμή αγοράστηκε από το Εθνικό Κέντρο για την επιστήμη Cell, Pune και αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιείχε 10% FBS όπως περιγράφεται παραπάνω.

Trypan μπλε χρωστική αποκλεισμού δοκιμασία

Η επίδραση του 4α στη βιωσιμότητα των λευχαιμικών (CEM, Κ562, REH, Nalm6) και κύτταρα καρκίνου του μαστού (EAC) προσδιορίστηκαν με δοκιμασία αποκλεισμού μπλε χρωστικής Trypan [22]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν (0,75 × 10

5 κύτταρα /ml) για 24 ώρες και η ένωση προστέθηκε στο εύρος 1-100 μΜ για να προσδιοριστεί η IC

50 τιμή. κύτταρα κατεργασμένα DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του οχήματος. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε διαστήματα 24 ωρών για πέντε ημέρες και ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκε μετά βαφή κυανούν τρυπανίου. Για λεβαμισόλη, χρησιμοποιήθηκε νερό ως έκδοχο αναφοράς. Σε περίπτωση ΑΗΚ, προσκολλημένη κυτταρική γραμμή, η βιωσιμότητα μετρήθηκε στα 48 και 72 ώρες μετά την αγωγή της 4α. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές και οι ράβδοι σφάλματος υπολογίστηκαν και σχεδιάστηκαν.

ΜΤΤ δοκιμασία

Η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. CEM, Κ562, REH ή Nalm6 κύτταρα (0,75 χ 10

5 κύτταρα /ml) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4α (για CEM και REH κύτταρα 1, 5, 10 και 20 μΜ? Για Κ562 1, 5, 10, 20, 40 και 100 μΜ? για Nalm6, 1,5,10, 20, 40 μΜ), επωάστηκαν για 48 και 72 ώρες και υποβάλλεται σε δοκιμασία ΜΤΤ. Κύτταρα κατεργασμένα με DMSO ή νερό χρησιμοποιήθηκε ως χειριστήρια του οχήματος για 4α, αντίστοιχα. Πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες φορές, υποδεικνύονται καθένα με διπλές αντιδράσεις και τις ράβδους σφάλματος.

απελευθέρωσης LDH δοκιμασία

απελευθέρωση LDH σε μέσο μετά από αγωγή 4α (1, 5, 10 και 20 μΜ) σε κύτταρα CEM μετά από 48 και 72 ώρες αγωγής μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τυποποιημένο πρωτόκολλο [24]. Το ποσοστό της απελευθέρωσης LDH υπολογίστηκε ως:. Απελευθέρωση LDH σε μέσα μαζικής ενημέρωσης /(απελευθέρωση LDH στα μέσα ενημέρωσης + ενδοκυτταρική απελευθέρωση LDH) × 100%

Ανίχνευση ενδοκυτταρική παραγωγή ROS με κυτταρομετρία ροής

Το επίπεδο της συνολικής παραγωγής ενδοκυτταρικής ROS μετρήθηκε με τη χρήση των κυττάρων διαπερατό φθορίζοντα ανιχνευτή 2,7-dichlorodihydro διοξεική φλουορεσκεϊνη (H

2DCFDA) σε κύτταρα CEM και REH [25]. CEM κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 και 10 μΜ 4α και κυττάρων REH με 10 μΜ για 5, 10, 15, 30 και 60 λεπτά, συλλέχθηκαν, πλύθηκαν και η ένταση φθορισμού αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Κύτταρα κατεργασμένα με H

2O

2 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος για την αποζημίωση των πειραματικών δειγμάτων.

Western ανάλυση κηλίδος

λύμα κυττάρων παρασκευάστηκε μετά από κατεργασία με 4α για CEM (0 , 0,5, 1, και 5 μΜ για 48 ώρες). Κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, ~ 40 μα δείγματος πρωτεΐνης ηλεκτροφορήθηκαν σε 8-12% SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη PVDF (Millipore, USA) και ανιχνεύθηκαν με τα αντίστοιχα πρωτογενή και δευτερογενή βιοτινυλιωμένα αντισώματα. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν BCL2, BCL-XL, ΒΑΧ, t-BID, p53, π-p53 [Ser 392], PUMA, ΑΚΤ, ρΑΚΤ [Ser 473], FAS, FAS-L, FADD, SMAC /DIABLO, κασπάσης -3, κασπάσης-8 και κυτόχρωμα C. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας χημειοφωταύγειας αντιδραστήρια (Immobilon ™ δυτική, Millipore, Ινδία) και σαρώνεται από το σύστημα τεκμηρίωσης γέλης (LAS 3000, Fuji, Japan). Οι κηλίδες είχαν αφαιρεθεί στη συνέχεια, ακολουθώντας το σύνηθες πρωτόκολλο και εκ νέου ανιχνεύθηκαν με αντίσωμα αντι-τουμπουλίνης [23].

Διαχωρισμός των μιτοχονδρίων και κυτοσολίων κλάσματα από 4α επεξεργασμένα κύτταρα CEM

κύτταρα CEM υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 5 μΜ 4α για 48 ώρες, συλλέγονται και χρησιμοποιούνται για την απομόνωση του μιτοχονδριακού και κυτοσολικά κλάσματα χρησιμοποιώντας μιτοχονδριακή κιτ εκχύλισης (Imgenex, USA, Cat. Νο 10082k) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα κατεργασμένα DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Τα προκύπτοντα κλάσματα χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος western έναντι αντι-κυτοχρώματος C. ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

In vivo πειράματα

Δήλωση Ηθικής.

Τα ποντίκια διατηρήθηκαν ως σύμφωνα με τις αρχές και τις κατευθυντήριες γραμμές της επιτροπής δεοντολογίας για τη φροντίδα των ζώων Ινδικό Ινστιτούτο Επιστημών, σύμφωνα με το Ινδικό Εθνικό Δίκαιο για τη φροντίδα των ζώων και τη χρήση. Ο πειραματικός σχεδιασμός της παρούσας μελέτης εγκρίθηκε από θεσμική Επιτροπή Δεοντολογίας Ζώων (Σχετ. CAF /Ηθική /125/2007/560), Ινδικό Ινστιτούτο Επιστημών, Μπανγκαλόρ, Ινδία

.

Ζώα

Swiss albino ποντίκια, ηλικίας 6-8 εβδομάδων, βάρους 18-22 g αγοράστηκαν από την εγκατάσταση κεντρικής ζώων, Ινδικό Ινστιτούτο Επιστημών (IISc), Μπανγκαλόρ, Ινδία και διατηρήθηκε στο σπίτι ζώο, Τμήμα Βιοχημείας, IISc. Τα ζώα στεγάζονται σε κλωβούς πολυπροπυλενίου και υπό την προϋπόθεση τυπική δίαιτα σφαιρίδιο (Agro Corporation Pvt. Ltd., Ινδία) και νερό κατά βούληση. Η τυπική δίαιτα ίζημα που αποτελείται από 21% πρωτεΐνη, 5% λιπίδια, 4% ακατέργαστες ίνες, 8% τέφρα, 1% ασβέστιο, 0,6% φώσφορο, 3,4% γλυκόζη, 2% της βιταμίνης, και 55% εκχύλισμα ελεύθερου αζώτου (υδατάνθρακες). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας με σκότους /12 ωρών φωτός.

Προετοιμασία του Ehrlich ασκίτης καρκίνωμα (ΑΗΚ) κύτταρα.

ΑΗΚ κύτταρα συλλέχθηκαν από την περιτοναϊκή κοιλότητα των ποντικών δότη που φέρει τον όγκο των 20-22 g σωματικού βάρους και εναιωρήθηκε σε στείρο αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS). Ένας σταθερός αριθμός των βιώσιμων κυττάρων (1 χ 10

6 κύτταρα /22 g β. Κβ) εμφυτεύθηκαν στην περιτοναϊκή κοιλότητα του κάθε ποντικού-δέκτη και αφέθηκαν να πολλαπλασιαστούν. Τα κύτταρα όγκου αποσύρθηκαν, αραιωμένο σε φυσιολογικό ορό, μετρήθηκαν και επανα-εγχέονται (1 × 10

6 κύτταρα /ζώο) για να δεξιό μηρό ιστό των πειραματόζωων για την ανάπτυξη συμπαγούς όγκου.

Αξιολόγηση της αντικαρκινικής δραστικότητας 4α σε

ποντίκι

Για να μελετηθεί και να συγκριθεί η αντικαρκινική δράση του 4α, 32 ελβετικά ποντίκια albino χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, (δύο παρτίδες 16 ζώα η κάθε μία). Από 16 ποντικούς, τέσσερα χρησιμοποιήθηκαν ως μη επεξεργασμένα (κανονικός) έλεγχος. Υπόλοιπο των ποντικών ενέθηκαν με EAC για την επαγωγή συμπαγή όγκο, και διαιρέθηκαν σε τρεις ομάδες, κάθε μία περιέχει τέσσερα ζώα για τον έλεγχο του όγκου (ομάδα δύο), Λεβαμισόλη αγωγή (ομάδα τρία) και 4α αγωγή (ομάδα τεσσάρων). Ομάδα δύο έλαβαν νερό ως έκδοχο ελέγχου, η ομάδα τρία έλαβε από του στόματος χορήγηση του Λεβαμισόλη (20 mg /kg, β. Βάρος) και την ομάδα τέσσερα έλαβαν από του στόματος χορήγηση του 4α (6 δόσεις των 20 mg /kg) σε κάθε εναλλακτική ημέρα χρησιμοποιώντας γαστρικό gavages ξεκινώντας από 12

ης ημέρας της ένεσης των κυττάρων του όγκου.

Οι διάμετροι των αναπτυσσόμενων όγκων μετρήθηκαν στην περίπτωση της ομάδας δύο, τρία και τέσσερα ζώα χρησιμοποιώντας παχύμετρο άπαξ σε πέντε ημέρες. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο V = 0.5ab

2, όπου «α» και «β» δηλώνουν μείζονα και ελάσσονα διάμετρο, αντίστοιχα [26]. Στο τέλος του 25

ου και 45

ης ημέρας της πειραματικής περιόδου, ένα ζώο από κάθε ομάδα θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση και τους ιστούς από φυσιολογικά (μία ομάδα), όγκου (ομάδα δύο), Λεβαμισόλη αγωγή (ομάδα τρία ) και 4α θεραπεία (ομάδα τεσσάρων) ζώα συλλέγονται και αποθηκεύονται.

Για να ελέγξετε τη μακροζωία που προκαλείται από 4α σε ποντίκια όγκου, 24 ζώα μελετήθηκαν, δύο παρτίδες που περιέχουν 12 η κάθε μία. Από τις 12, έξι χρησίμευσε ως έλεγχος όγκου και άλλοι υπέστησαν αγωγή με 4α όπως εξηγήθηκε προηγουμένως. Το ποσοστό της αύξησης της διάρκειας της ζωής υπολογίστηκε και συγκρίθηκε με εκείνη των ζώων ελέγχου. Το μοτίβο θανάτου για τους ελέγχους και ζώα υπό θεραπεία 4α καταγράφηκε και% αύξηση στην διάρκεια ζωής υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο [(T-C) /C] χ 100, όπου «Τ» υποδηλώνει τον αριθμό των ημερών επιβίωσης των ζώων υπό θεραπεία 4α και «C «δηλώνει τον αριθμό των ημερών ζώων όγκου επιβίωσαν [26] – [28].

Αξιολόγηση της τοξικότητας των 4α σε φυσιολογικά ποντίκια

ποντίκια Swiss Albino υποβλήθηκαν σε αγωγή με 4α και Λεβαμισόλη (6 δόσεις, σε κάθε αναπληρωτή ημέρα) και ανεπιθύμητες ενέργειες αξιολογήθηκαν σε δύο διαφορετικά χρονικά σημεία (20

ου και 50

ης ημέρας). Από 36 ποντίκια, 18 το καθένα χρησιμοποιήθηκαν σε 20

ου και 50

ης ημέρας. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, 6 ζώα χρησίμευσαν ως έλεγχος, ενώ 6 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με λεβαμισόλη (20 mg /kg) ή 4a (20 mg /kg). Το σωματικό βάρος του κάθε ζώου παρακολουθήθηκε τη διάρκεια του πειράματος και το μέσο βάρος υπολογίζεται σε 20

ου και 50

ης ημέρας για τον έλεγχο, 4α και Λεβαμισόλη ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε και απεικονίσθηκαν με ράβδους σφάλματος. Προκειμένου να αξιολογηθεί η επίδραση των 4α και Λεβαμισόλη στις φυσιολογικές λειτουργίες, αίμα συλλέχθηκε σε 20

ου και 50

ης ημέρας, όπως περιγράφεται παραπάνω [29]. Ο ορός διαχωρίστηκε και δοκιμών λειτουργίας ήπατος και των νεφρών πραγματοποιήθηκαν για κάθε ζώο, ο προσδιορισμός των επιπέδων αλκαλικής φωσφατάσης (ALP), κρεατινίνη, ουρία και γενική αίματος διεξήχθη χρησιμοποιώντας πλάσμα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM.

ανάλυση στυπώματος Western για 4α επεξεργασία στερεών και υγρών κυττάρων όγκου

Στερεά όγκου αναπτύχθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Μετά 6 δόσεις 4α, όγκο συλλέχθηκε και εκχύλισμα παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικό μέθοδο [23]. Το υγρό όγκος αναπτύχθηκε με ένεση ΑΗΚ κύτταρα (2 χ 10

6 κύτταρα) από ποντίκια δότη σε περιτοναϊκή κοιλότητα των πειραματόζωων. Μετά EAC ένεση (5

ης ημέρας), τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 4α (20 mg /kg? 4 δόσεις ανά ημέρα εναλλακτική) και τα κύτταρα ΑΗΚ απομονώθηκαν από την περιτοναϊκή κοιλότητα. Τα μακροφάγα κύτταρα γράμμωσης διαχωρίστηκαν από τα μη προσκολλημένα EAC κύτταρα με ελαφρά αναρρόφηση, και πλένονται με 1 χ PBS. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας trypan blue δοκιμασία χρωστικής αποκλεισμού και 92% κύτταρα βρέθηκαν να είναι ζωντανοί και στις δύο πειραματικές ομάδες και ελέγχει. κύτταρα ΑΗΚ λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA, εκχύλισμα παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30] και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση στυπώματος western.

Ιστολογική αξιολόγηση

Tumor και το ήπαρ ιστούς των φυσιολογικών και πειραματικών ποντικών συλλέχθηκαν και επεξεργασία σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα. Εν συντομία, οι ιστοί εγκλείστηκαν σε παραφίνη κερί, χωρισμένο σε 5-10 μm σε ένα περιστροφικό μικροτόμο (Leica Biosystems, Germany) και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη [31], [32]. ιστούς του εγκεφάλου συλλέχθηκαν, επεξεργασία και βάφονται με Luxol Fast Blue για να μελετήσει απομυελίνωση. Κάθε τμήμα αξιολογήθηκε με μικροσκοπία φωτός και οι εικόνες συλλήφθηκαν (Zeiss, Germany).

Ανοσοϊστοχημική (IHC) ανάλυση

χρώση αντισώματος διεξήχθη επί σταθεροποιημένων με φορμαλίνη, ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστούς, τα οποία κόπηκαν σε ένα πάχος 5 μm. Τα σλάϊντς-παραφινοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3% Η

2O

2 σε PBS. Το αντιγόνο ανάκτηση έγινε χρησιμοποιώντας 0.01% ρυθμιστικό κιτρικό-νάτριο και ακολούθησε αποκλεισμός σε PBST που περιέχει 0.1% BSA και 10% FBS. Πρωτοβάθμια επώασης αντισώματος (Ki67, BID ή 53BP1) πραγματοποιήθηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα πλακίδια πλύθηκαν και επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα (1 ώρα). Τα σλάϊντς στη συνέχεια πλένονται, επωάζονται σε στρεπταβιδίνη-ΗΚΡ (1:1000). Τα πλακίδια πλύθηκαν και πάλι (PBS που περιέχει 0.1% Tween 20) και το χρώμα αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας DAB + Η

2O

2, βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη και συναρμολογείται σε DPX (Sigma-Aldrich, USA). Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο (Zeiss, Γερμανία). Μεταβολή ένταση της χρώσης αντισώματος μετά τη θεραπεία 4α προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ [33].

Στατιστική ανάλυση

Οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM για τον έλεγχο και πειραματικά δείγματα και στατιστική ανάλυση διεξήχθη χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από δοκιμή Dunnett και κάθε τιμή συγκρίθηκε με τον έλεγχο και τη σημασία αναφέρεται. Για την ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε λογισμικό GraphPad Prism 5.1. Οι τιμές θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές, εάν η τιμή ρ ήταν ίση ή μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

4α επάγει κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα

Προηγουμένως, ενώ διαλογής μια σειρά παραγώγων λεβαμισόλη, εντοπίσαμε 4α ως μόλυβδος ένωση (Εικ. 1Α) [21]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μία ποικιλία λευχαιμικών κυτταρικών σειρών (CEM, Κ562, REH και Nalm6) και ενός καρκίνου κυτταρική γραμμή ποντίκια μαστού, Ehrlich ασκίτης καρκίνωμα (EAC) για να αξιολογήσει το δυναμικό του να επάγει κυτταροτοξικότητα. Πρώτον, IC

50 της 4a σε κύτταρα CEM, Κ562, Nalm6 και REH προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας trypan blue και ΜΤΤ δοκιμασίες (Εικ. 1). Κύτταρα κατεργασμένα με DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του οχήματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία 4α επηρεάζεται σημαντικά η βιωσιμότητα των κυττάρων σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις σε CEM, Nalm6 και REH (Σχ. 1Β, C). Είναι ενδιαφέρον ότι, Κ562 κύτταρα έδειξαν τουλάχιστον ευαισθησία προς θεραπεία 4α (Σχ. 1Β, C). Με βάση τις δύο trypan blue και ΜΤΤ δοκιμασίες, το IC

50 αξία υπολογίζεται να είναι περίπου 5, 70, 10 και 8 μΜ σε κύτταρα CEM, Κ562, Nalm6 και REH, αντίστοιχα μετά από 48 ώρες θεραπείας 4α. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε σύγκριση με 4α, η θεραπεία Λεβαμισόλη σε κύτταρα CEM έδειξε λιγότερη ευαισθησία (Σχ. 2Α, Β). 4α εμφάνισαν σημαντική κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα ΑΗΚ (IC

50, 33 μΜ), ενώ τα κύτταρα ήταν μη ευαίσθητα σε λεβαμισόλη, στο εύρος συγκεντρώσεων που δοκιμάστηκε (Σχ. 2C, D). Περαιτέρω, προσδιορισμός LDH διεξήχθη σε κυτταρική βλάβη που επάγεται από δοκιμασία 4α σε κύτταρα CEM. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 4α για 48 και 72 ώρες, αντίστοιχα, συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε μέτρηση της LDH. Τα αποτελέσματα έδειξαν μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην απελευθέρωση της LDH (Εικ. S1).

A. Η δομή του 4α. B. 4α επαγόμενη κυτταροτοξικότητα όπως καθορίστηκε με trypan blue δοκιμασίας. CEM, Κ562, Nalm6 και REH κύτταρα καλλιεργήθηκαν (0,75 × 10

5 κύτταρα /ml) και κυτταροτοξικότητα μετρήθηκε μετά την προσθήκη της αύξησης της συγκέντρωσης του 4α όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα μετρήθηκαν σε διαστήματα 24 ώρες έως ότου τα κύτταρα επιτευχθεί στατική φάση και απεικονίσθηκαν. κύτταρα κατεργασμένα DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του οχήματος. Τυπικό σφάλμα υπολογίστηκε με βάση τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα. C. Προσδιορισμός του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με χρήση του προσδιορισμού ΜΤΤ μετά την προσθήκη του 4α έως CEM, Κ562, Nalm6 και κύτταρα REH (48 και 72 ώρες). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι από ένα ελάχιστο δύο ανεξάρτητα πειράματα, κάθε έγινε εις διπλούν και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως% του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Σε όλους τους πίνακες «C» σημαίνει για τον έλεγχο θεραπεία με όχημα DMSO.

Η

Α. Η δομή του λεβαμισόλη, η γονική ένωση του 4α. B. Προσδιορισμός του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με χρήση του προσδιορισμού ΜΤΤ σε κύτταρα CEM σε επεξεργασία με Λεβαμισόλη ή 4α. Σε περίπτωση λεβαμισόλη, οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 1, 5, 10 και 20 μΜ, ενώ ήταν 10 μΜ για 4α. Τυπικό σφάλμα υπολογίστηκε βασίζεται σε δύο ανεξάρτητα πειράματα. C, D. Η κυτταροτοξικότητα του 4α και Λεβαμισόλη επί EAC κυττάρων όπως μετράται με trypan blue δοκιμασίας. κύτταρα καλλιεργήθηκαν ΑΗΚ (0,75 × 10

5 κύτταρα /ml) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1, 5, 10, 20 και 40 μΜ 4α ή λεβαμισόλη. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με trypan μπλε δοκιμασία στις 48 και 72 ώρες. Τυπικό σφάλμα υπολογίστηκε με βάση τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

4α επάγει ενδοκυτταρική αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)

Υπερπαραγωγή ROS μετά την προσθήκη μιας ένωσης είναι ένας δείκτης της κυτταρικής απόκρισης οδηγεί σε βλάβη του DNA και την απόπτωση. Βρήκαμε ότι η θεραπεία 4α επαγόμενη παραγωγή ROS σε περίπτωση CEM (5 και 10 μΜ), καθώς και REH (10 μΜ) κύτταρα σε 10 και 15 λεπτά (Σχ. 3 Α, Β, Σχ. S2). Περαιτέρω, η αύξηση του χρόνου επώασης δεν ενισχυθεί το επίπεδο ROS. Κύτταρα κατεργασμένα με H

2O

2 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος, ενώ DMSO επεξεργασμένα κύτταρα χρησίμευσαν ως έλεγχος οχήματος (Εικ. 3). Έτσι, τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η παραγωγή ROS είναι ένα ενδιάμεσο βήμα που εμπλέκονται στην 4α επαγόμενη κυτταροτοξικότητα.

Α, Β CEM (Α) και REH (Β) κύτταρα κατεργασμένα με 4α (5 μΜ και 10 μΜ, αντίστοιχα) για διάφορα χρονικά σημεία χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμή του σχηματισμού ενδοκυτταρικών ROS από ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Η συγκέντρωση που επιλέγεται για τη μελέτη βασίστηκε σε αντίστοιχες IC τους

50 τιμές. H

2O

2 κύτταρα που κατεργάζονται χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος ενώ μόνο κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος. κύτταρα κατεργασμένα DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του οχήματος. κυτταρικός πληθυσμός που δείχνει ROS δείχθηκε μαζί με πρότυπο μέσο σφάλμα (n = 2).

Η

4α ρυθμίζει την έκφραση των αποπτωτικών πρωτεϊνών

Για να μελετηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο 4α επάγει κυτταρικό θάνατο , μελετήσαμε τα επίπεδα έκφρασης των διαφορετικών αποπτωτικών πρωτεϊνών μετά τη θεραπεία 4α. CEM κύτταρα επιλέχθηκαν για τη μελέτη καθώς παρουσίασε τη μέγιστη ευαισθησία για 4α. CEM κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις του 4α (0.5, 1 και 5 μΜ, για 48 ώρες), προϊόν λύσης των κυττάρων παρασκευάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για μελέτες στυπώματος western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία 4α οδήγησε σε αξιοσημείωτη αύξηση των επιπέδων του ρ53, καθώς και φωσφο-ρ53 (Σχ. 4Α). Δεδομένου ότι το ρ53 είναι ένας γνωστός ενεργοποιητής της απόπτωσης, εξετάσαμε την έκφραση διαφόρων BCL2 οικογένειας πρωτεϊνών οι οποίες έχουν προ /αντιαποπτωτικό λειτουργίες (Εικ. 4Α, Β). Σύμφωνα με ανωτέρω αποτελέσματα μας, παρατηρήσαμε μια αύξηση στην έκφραση προαποπτωτικών πρωτεϊνών Puma, ΒΑΧ, και διάσπαση του BID (Σχ. 4Α, Β). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε επίσης την προς τα πάνω ρύθμιση του αντιαποπτωτικών πρωτεΐνες, BCL2 και BCL-XL, ιδιαίτερα σε 0.5 και 1 μΜ συγκεντρώσεις (Εικ. 4Β). Περαιτέρω, η θεραπεία 4α οδήγησε στην αύξηση της έκφρασης των πρωτεϊνών σηματοδότησης θανάτου-υποδοχέα, FAS, FAS-L και FADD, υποδεικνύοντας ότι η κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από 4α θα μπορούσε να προκαλείται μέσω της προκαλούμενη από υποδοχέα θανάτου απόπτωση (Σχ. 4C).

CEM υλικό κυτταρικής λύσεως παρασκευάσθηκε ακολουθώντας θεραπεία με 4α (0, 0,5, 1 και 5 μΜ για 48 ώρες). κύτταρα κατεργασμένα DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (0 μΜ). Western blotting μελέτες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ειδικά πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα για έκφραση (Α) Φωσφο ρ53, ρ53, Puma, φωσφο ΑΚΤ, ΑΚΤ (Β) BCL2, BCL-XL, ΒΑΧ και τ-BID? (Γ) FAS, Fas-L, FADD, και SMAC /DIABLO (D) κασπάσης-3, κασπάσης-8 και κυτόχρωμα C. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η ποσοτικοποίηση των ζωνών σε κάθε κηλίδα που φαίνεται στο αριστερό πλαίσιο απεικονίζεται ως διάγραμμα μπαρ με τυπικό σφάλμα βασίζεται σε δύο ανεξάρτητα πειράματα εξής ομαλοποίηση με τους αντίστοιχους τουμπουλίνης Ε απελευθέρωση του κυτοχρώματος C από μιτοχόνδρια μετά τη θεραπεία με 4α. Μιτοχονδριακή καθώς και κυτοσολικά κλάσματα διαχωρίζονται από τα κύτταρα CEM μετά από 48 ώρες αγωγής με 4α (5 μΜ), τα κύτταρα έλαβαν DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (C), κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-κυτοχρώματος C. ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης .

η

μονοπατιού PI3K /AKT είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται στην πλειοψηφία των Τ-ALL. Είναι επίσης γνωστό ότι παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στον έλεγχο επιβίωση και απόπτωση. Αύξηση σε π-ΑΚΤ μετατοπίζει τα κύτταρα προς επιβίωση παρεμβαίνοντας με τη μεσολάβηση ρ53 μονοπάτι της απόπτωσης. Ως εκ τούτου, ήμασταν ενδιαφέρονται για τον έλεγχο των επιπέδων της ΑΚΤ μετά την ένωση της θεραπείας. Τα αποτελέσματα έδειξαν προς τα πάνω ρύθμιση ΑΚΤ μετά την προσθήκη του 4α (Σχ. 4Α). Παρά αύξησης στα επίπεδα του p-ΑΚΤ, η προκαλούμενη από φάρμακο κυτταρικό θάνατο, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αναλογία των προαποπτωτικών και αντιαποπτωτικών σημάτων στο κύτταρο διακόπηκε.

SMAC /DIABLO είναι ένα θηλαστικό μιτοχονδριακή πρωτεΐνη που λειτουργεί ως ένα ρυθμιστικό στοιχείο κατά την απόπτωση. Δοκιμάσαμε την έκφρασή του μετά κατεργασία 4α και τα αποτελέσματα έδειξαν μία ανοδική ρύθμιση της έκφρασης πρωτεϊνών (Εικ. 4C). Μία δοσοεξαρτώμενη αύξηση στο επίπεδο του κυτοχρώματος C παρατηρήθηκε επίσης (Σχ. 4D) [34]. Ελέγξαμε επίσης την απελευθέρωση του κυτοχρώματος C έως κυτταρόπλασμα και τα αποτελέσματα έδειξαν μια διακριτή αύξηση στο επίπεδο της κυτοσολικής κυτοχρώματος c κατά την κατεργασία με 4α (Εικ. 4Ε).

κασπάσης-8 είναι μια άλλη πρωτεΐνη ενεργοποιείται κατά τη διάρκεια της εξωγενή οδό της απόπτωσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν διάσπαση της κασπάσης-8 κατά την κατεργασία 4α (Σχ. 4D). Αυτό επιβεβαιώνει περαιτέρω την ενεργοποίηση της απόπτωσης που διαμεσολαβείται θάνατο-υποδοχέα. Ενεργοποιημένη κασπάση-8 επίσης διασπά procaspase-3 και συνεπές με αυτό βρίσκουμε ενεργοποίηση των procaspase-3 σε σύγκριση με τους ελέγχους, κατά την κατεργασία 4α, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4D).

αναστέλλει τη θεραπεία 4α εξέλιξης του όγκου σε ποντικούς

ΑΗΚ προέρχεται από αδενοκαρκίνωμα του μαστού είναι μια επιθετική και ταχέως αναπτυσσόμενη καρκίνωμα που χρησιμοποιούνται συνήθως για την αξιολόγηση της επίδρασης των νέων μικρών μορίων για την εξέλιξη του όγκου. Με βάση τις πιλοτικές μελέτες, 20 mg /kg σωματικού βάρους του 4a χρησιμοποιήθηκε για θεραπεία σε ζώα που έφεραν όγκους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μετά από 12

ου ημέρα της ένεσης ΑΗΚ (μικρό όγκο μεγέθους ήταν ορατή), τα ζώα που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με έξι δόσεις κάθε αναπληρωτή ημέρα. Βρήκαμε ότι η θεραπεία με 4α επί ζώων που φέρουν όγκου κατέληξε σε σημαντική μείωση του μεγέθους του όγκου σε σύγκριση με εκείνη των μη επεξεργασμένων, καθώς και ζώα υπό θεραπεία όγκων Λεβαμισόλη (20 mg /kg) (Εικ. 5Α). Βρήκαμε ότι το 80% των ποντικών επιβίωσε κατά την κατεργασία με 4α, ενώ το 50% των ποντικών χωρίς θεραπεία όγκων ήταν νεκροί μεταξύ 30 έως 40 ημέρες της ανάπτυξης των όγκων (Σχ. 5Α, Β και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η ακαθάριστη εμφάνιση του μηρού ιστού που περιέχει όγκου, το ήπαρ και τον σπλήνα του αρνητικού ελέγχου, χωρίς αγωγή έλεγχο του όγκου και οι ποντικοί έλαβαν 4α έδειξαν μία αναλογική μορφολογική διαφορά (Εικ. 5C και δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Στερεά όγκου προκλήθηκε σε ελβετικά αλμπίνο ποντίκια με ένεση ΑΗΚ κύτταρα. Έξι δόσεις 4α και Λεβαμισόλη (20 mg /kg) κάθε χορηγείται σε ποντικούς που φέρουν όγκο σε κάθε αναπληρωτή ημέρα από 12

ης ημέρας της ένεσης των κυττάρων ΑΗΚ. Α Επίδραση του 4α και Λεβαμισόλη για την εξέλιξη του όγκου σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Τα δεδομένα που εμφανίζονται βασίζεται σε δύο ανεξάρτητα πειράματα παρτίδες που περιέχουν τέσσερα ζώα η κάθε μία. Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν SD από ανεξάρτητα πειράματα. καμπύλες επιβίωσης Kaplan Β-Meier των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με 4α. Από 24 του όγκου που προκαλείται Swiss Albino ζώα, 12 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 4α (20 mg /kg) και γράφημα επιβίωση χαράσσεται, Log-rank στατιστική δοκιμή έδειξε P & lt? 0.005 (**). Στην περίπτωση ελέγχου, μέσος χρόνος επιβίωσης βρέθηκε να είναι 59 ημέρες και σε περίπτωση 4α αγωγή δεν προσδιορίζεται (τιμή έδειξε μέχρι 250 ημέρες). Γ Gross εμφάνιση των ποντικών 4α επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων όγκου και επιλέγονται τα όργανά τους σε 25

ης ημέρας της θεραπείας. ένα. ποντίκι χωρίς όγκο, b. ποντίκι που φέρει όγκο, c. που φέρουν όγκο ποντικών μετά από θεραπεία με 4α, d. μηρό ιστού κανονικών ποντικού, π. όγκου, στ. μηρό ιστού ενός αντιμετωπίζεται το ποντίκι, g. ήπαρ από φυσιολογικό ποντίκι, h. ήπαρ ενός ποντικού όγκου, i. ήπατος από ένα 4α αγωγή ποντικό, j. σπλήνα ενός κανονικού ποντικού, k. σπλήνα ενός ποντικού με όγκο, l. σπλήνα κατεργασμένου ποντίκι.

Η

Το πιο σημαντικό, βρήκαμε ότι κατά την κατεργασία με 4α, τα ζώα με όγκο έδειξαν σημαντική διαφορά στο ποσοστό επιβίωσης σε σύγκριση με τον μη επεξεργασμένο έλεγχο του όγκου (Σχ. 5Β). Ενώ τα ζώα ελέγχου επιβίωσαν για μόνο ένα μέγιστο 70 ημέρες μετά την ανάπτυξη του όγκου, η πλειοψηφία των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με 4α επιβίωσαν για περισσότερο των 250 ημερών υποδεικνύοντας ~ 4-φορές αύξηση στο χρόνο ζωής (Εικ. 5Β). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι η χορήγηση 4α μείωσε σημαντικά το φορτίο του όγκου και αύξησε τη διάρκεια ζωής των ζώων.

Η ιστολογική αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε επίσης σε δύο διαφορετικά χρονικά σημεία (25

ου και 45

ης ημέρας ) της αγωγής. Τομές από ιστό όγκου ενός ποντικού αγωγή 25 ημερών δεν έδειξε πολλά αιματοξυλίνη χρωματισμένο πυρήνες με λίγο κυτταροπλασματική χρώση υποδεικνύει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ενεργός, ενώ στην περίπτωση των ελέγχων, δεν υπάρχουν άλλα κύτταρα διαφορετικά από τους πυρήνες των σκελετικών μυών βάφτηκαν (Εικ. S3A). αγωγή ιστών όγκου 4α έδειξαν σημαντική μείωση σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα (Εικ. S3A). Τομές ιστού από το μηρό μετά από 45

ης ημέρας της αγωγής έδειξε αμελητέο αριθμό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων και ήταν περισσότερο συγκρίσιμο με αυτό των φυσιολογικών ιστών, ενώ πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα ήταν άφθονα σε ποντικούς που φέρουν όγκο, όπου δόθηκε καμία θεραπεία (Εικ. S3A). Για να αναλύσουμε αν η θεραπεία 4α είχε καμία αρνητική επίδραση στην άλλους ιστούς, τμήματα του ήπατος αναλύθηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Εικ. S3C, D). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν υπερτροφία των ηπατοκυττάρων τόσο φέρει όγκο και 4α ποντίκια με αγωγή. Ωστόσο, αποκαταστάθηκε πίσω στην κανονική μόνο στις περιπτώσεις όπου ο όγκος οπισθοχωρούν μετά τη θεραπεία με την ένωση 4α, σε αντίθεση με τα ποντίκια χωρίς θεραπεία όπου ακανόνιστο ηπατοκύτταρα ακόμη φανεί (Εικ. S3C, D).