Αφηρημένο

Ιστορικό

2-ψευδαργύρου-γλυκοπρωτεΐνη 1 (AZGP1) είναι μια διεπιστημονική πρωτεΐνη που συμμετέχει σε πολλές σημαντικές λειτουργίες στο ανθρώπινο σώμα, συμπεριλαμβανομένης της γονιμοποίησης, ανοσορύθμιση και την κινητοποίηση των λιπιδίων. Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι AZGP1 εμπλέκεται επίσης στην καρκινογένεση και διαφοροποίηση του όγκου. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε τα επίπεδα έκφρασης και προγνωστική αξία της AZGP1 στην πρωτοβάθμια γαστρικών καρκίνων.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

Εξετάσαμε την έκφραση των AZGP1 σε 35 ζεύγη καρκινικών και συμφωνημένα δίπλα noncancerous γαστρικό βλεννογόνο ιστούς με πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) και κηλίδωση Western. Επίσης, αναλύσαμε την έκφραση AZGP1 σε 248 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε διαδικασίες εκτομή μεταξύ 2005 και 2007 με ανοσοϊστοχημεία. Οι σχέσεις μεταξύ των επιπέδων έκφρασης AZGP1, οι κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες, και την επιβίωση των ασθενών ερευνήθηκαν. έκφραση AZGP1 μειώθηκε σημαντικά τόσο στο mRNA (

P

= 0.023) και της πρωτεΐνης επίπεδα (

P

= 0,019) σε δείγματα ιστού του όγκου, σε σύγκριση με την έκφραση σε συμφωνημένα παρακείμενο δείγματα μη καρκινικό ιστό . Οι ανοσοϊστοχημικές δεδομένα χρώση έδειξαν ότι η έκφραση AZGP1 μειώθηκε σημαντικά σε 52,8% (131/248) των γαστρικών περιπτώσεις αδενοκαρκινώματος. Κλινικοπαθολογοανατομικές ανάλυση έδειξε ότι η μειωμένη έκφραση της AZGP1 συσχετίστηκε σημαντικά με τη θέση του όγκου (

P

= 0,011), ιστολογικές Βαθμός (

P

= 0,005) και το στάδιο Τ (

P

= 0.008). καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι η μειωμένη έκφραση της AZGP1 συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα στομάχου (

P

= 0,009). Η πολυπαραγοντική Cox ανάλυση εντόπισε η έκφραση AZGP1 ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τη συνολική επιβίωση των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα στομάχου (HR = 1,681, 95% CI = 1,134 – 2,494,

P

= 0,011).

Συμπεράσματα

η μελέτη μας δείχνει ότι AZGP1 θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως καταστολέας υποψήφιος όγκου και μια πιθανή προγνωστική βιοδείκτη σε γαστρική καρκινογένεση

Παράθεση:. Huang Cy, Zhao JJ, Lv L, Τσεν Υο, Λι Yf, Jiang Ss, et al. (2013) μειωμένη έκφραση AZGP1 σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε πρωτοπαθή καρκίνο του στομάχου. PLoS ONE 8 (7): e69155. doi: 10.1371 /journal.pone.0069155

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 5 Μάρτη 2013? Αποδεκτές: 5 Ιούνη 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Ιούλη του 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Διδακτορική Ταμείο του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (20100171110084). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικός καρκίνος είναι η δεύτερη συνηθέστερη αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο, με 988.000 νέα κρούσματα και 736.000 θανάτους ετησίως [1] – [2]. Στην Κίνα, γαστρικό καρκίνο είχε προβλεφθεί να είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου το 2005 με 0,4 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις και 0,3 εκατομμύρια θανάτους που αναφέρθηκαν [3]. Η θεραπεία του καρκίνου του στομάχου περιλαμβάνει ένα συνδυασμό χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, και θεραπεία με ακτινοβολία. Αλλά σχεδόν το 60% των ασθενών που πάσχουν υποκύψει σε καρκίνο του στομάχου μετά από μόνη της μια θεραπευτική εκτομή ή μετά από μια θεραπευτική εκτομή με επακόλουθη επικουρική θεραπεία [4]. Καρκίνο του στομάχου είναι μια ετερογενής νόσος τόσο ιστολογίας και της γενετικής? ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα των ασθενών είναι δύσκολο να προβλεφθεί χρησιμοποιώντας κλασικές ιστολογικές ταξινομήσεις. Η γαστρική καρκινογένεση είναι μια πολυπαραγοντική και πολυσταδιακή διαδικασία που περιλαμβάνει την ενεργοποίηση ογκογονιδίων και αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε διαφορετικά στάδια εξέλιξης του γαστρικού καρκίνου. Πρόσφατα, αρκετές νέες ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια που σχετίζονται με καρκίνο του στομάχου έχουν εντοπιστεί. Ως εκ τούτου, είναι κλινικά σημαντικό να βρεθεί αποτελεσματική νέους στόχους για την έγκαιρη διάγνωση και η αποτελεσματική θεραπεία του καρκίνου του στομάχου.

AZGP1 (2-ψευδαργύρου-γλυκοπρωτεΐνης 1, Ζη-άλφα 2-γλυκοπρωτεΐνη) είναι ένα 41 kDa διαλυτή πρωτεΐνη με ένα μείζονος συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας-1 (MHC-1) -όπως φορές στη δομή του, και ήταν αρχικά αναγνωρίστηκε και καθαρίστηκε σε ανθρώπινο ορό, το 1961 [5]. Το γονίδιο για AZGP1, τοποθετήθηκε στο χρωμόσωμα 7q22.1 μέσω φθορισμού υβριδισμού καρυότυπο, αποτελείται από τέσσερα εξώνια και εσώνια τρία [6], [7]. Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημικές μελέτες, έχει βρεθεί ότι AZGP1 εκφράζεται κυρίως σε επιθηλιακά κύτταρα του μαστού, του προστάτη, του ήπατος και διάφορα άλλα γαστρεντερικά όργανα [8]. Σύμφωνα με την παραγωγή του κατά εκκριτικά επιθηλιακά κύτταρα, AZGP1 βρίσκεται σε μια σειρά από σωματικά υγρά [9], [10], [11].

AZGP1 είναι μια διεπιστημονική πρωτεΐνη που συμμετέχει σε πολλές σημαντικές λειτουργίες στο ανθρώπινου σώματος, συμπεριλαμβανομένων γονιμοποίηση [11], ανοσορύθμιση [12] και την κινητοποίηση των λιπιδίων [13], [14], [15]. AZGP1 συνδέεται επίσης με καρκινική καχεξία. AZGP1 έχει ένα υψηλό επίπεδο αμινοξέων ομολογία αλληλουχίας με τον παράγοντα λιπίδια κινητοποίηση που προέρχονται από όγκους [14], και σε ένα μοντέλο ποντικού όγκων AZGP1 παράγουν, AZGP1 διεγείρεται λιπόλυση σε λιποκύτταρα που οδηγεί σε καχεξία [16]. Πρόσφατα, έχει δειχθεί ότι AZGP1 εμπλέκεται επίσης στην καρκινογένεση και διαφοροποίηση του όγκου. προσδιορισμοί πρωτεϊνών και έκφραση mRNA έχουν δείξει μια σχέση μεταξύ των επιπέδων AZGP1 και την ιστολογική βαθμολογία των όγκων του καρκίνου του μαστού [17], [18]. Επιπλέον, πολλές μελέτες υποδεικνύουν ότι AZGP1 είναι ένας πιθανός δείκτης του καρκίνου του προστάτη [9], [19] του ορού. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι δρα AZGP1 ως νέου καταστολέας όγκων σε καρκίνο του παγκρέατος [20]. Ωστόσο, μέχρι τώρα η κατάσταση έκφρασης του AZGP1 και προγνωστική αξία αυτής της πρωτεΐνης σε πρωτογενείς γαστρικών καρκίνων δεν έχουν αναφερθεί.

Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε το επίπεδο έκφρασης AZGP1 σε γαστρικών καρκίνων χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου ποσοτικής RT -PCR (qRT-PCR), Western και ανοσοϊστοχημεία. Επιπλέον, εντοπίσαμε τη σχέση μεταξύ της έκφρασης AZGP1 και των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά του γαστρικού καρκίνου, και αξιολογήσαμε την προγνωστική αξία της έκφρασης AZGP1 για την επιβίωση μετά από εκτομή των ασθενών με καρκίνο του στομάχου.

Αποτελέσματα

AZGP1 mRNA έκφρασης Αναλύθηκε με qRT-PCR

Η μεταγραφική επίπεδα AZGP1 προσδιορίστηκαν με δοκιμασίες qRT-PCR χρησιμοποιώντας 35 ζεύγη εκτομή δείγματα (δείγματα ιστού όγκου και συμφωνημένα παρακείμενο δείγματα ιστού μη-όγκου) από ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Τα επίπεδα mRNA AZGP1 ήταν σημαντικά μειωμένα σε δείγματα 28 (80%) του ιστού του όγκου σε σύγκριση με τα συμφωνημένα γειτονικά δείγματα ιστού μη-όγκου (

P

= 0.023, Εικόνα 1).

Σχετική έκφραση του AZGP1 στο γαστρικό ιστούς όγκων καρκίνου σε σύγκριση με παρακείμενους ιστούς μη-όγκου (n = 35) αξιολογούνται από qRT-PCR (

P

= 0,023).

η

Έκφραση AZGP1 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western

τα επίπεδα της πρωτεΐνης AZGP1 στα εκτομή γαστρικού καρκίνου δείγματα προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν μία ταινία για AZGP1 σε 41 kDa, και η ποσότητα της πρωτεΐνης που υπάρχει AZGP1 μετρήθηκε με πυκνομετρία και το ύψος. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα qRT-PCR, μια μείωση στην έκφραση AZGP1 παρατηρήθηκε σε 25 (71,4%) των γαστρικών ιστών όγκου σε σύγκριση με τα συμφωνημένα παρακείμενους ιστούς μη-όγκου (

P

= 0,019, Σχήμα 2Α). Οκτώ ζεύγη αντιπροσωπευτικών γαστρικού καρκινικών ιστών και των παρακείμενων ιστών συμφωνημένα μη όγκου δείχνεται στο Σχήμα 2Β.

(Α) Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης AZGP1 μειώθηκε σημαντικά σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με το γειτονικό μη συμφωνημένα ογκογόνους ιστούς (n = 35,

P

= 0,019)? (Β) Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα της κηλιδώσεως Western ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης AZGP1 σε οκτώ γαστρικό καρκινικούς ιστούς (Τ) και τα συμφωνημένα παρακείμενες μη ογκογόνους ιστούς (Ν).

Η

ανοσοϊστοχημική ανάλυση AZGP1 έκφρασης στο γαστρικό καρκίνο δείγματα ιστού και η σχέση της με την κλινικοπαθολογοανατομικές Χαρακτηριστικά

για να επιβεβαιώσετε τις μοριακές βιολογικές διαπιστώσεις και διερεύνηση των κλινικοπαθολογοανατομικές τα προγνωστικά τους ρόλους της έκφρασης AZGP1, πραγματοποιήσαμε ανοσοϊστοχημική ανάλυση σε 248 γαστρικό καρκίνο τμήματα ενσωματωμένες σε παραφίνη. Η θετική έκφραση του AZGP1 εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα (Εικόνα S1). Μεταξύ των 248 γαστρικό δείγματα καρκίνου, 117 (47,2%) έδειξε υψηλή έκφραση AZGP1 (AZGP1 ++ ή AZGP1 +++), ενώ οι υπόλοιπες 131 περιπτώσεις (52,8%) που εμφανίζεται χαμηλή έκφραση AZGP1 (AZGP1- ή AZGP1 +) (Εικόνα 3, Πίνακας 1). Κανονική γαστρικό ιστών έδειξε την ισχυρότερη θετική χρώση AZGP1 (Σχήμα 3Α)

(Α) Η κανονική γαστρικό ιστούς, βαθμολογήθηκαν ως AZGP1 (+++)?. (Β) γαστρικό καρκίνο, βαθμολογήθηκαν ως AZGP1 (+++) ? (Γ) γαστρικό καρκίνο, βαθμολογήθηκαν ως AZGP1 (++)? (D) γαστρικό καρκίνο, βαθμολογήθηκαν ως AZGP1 (+)? και (Ε) γαστρικό καρκίνο, βαθμολογήθηκαν ως AZGP1 (-). Αρχική μεγέθυνση: A – D × 200.

Η

Με βάση τις κατηγορίες που ορίζονται στις προαναφερόμενες μεθόδους, τα στοιχεία έδειξαν ότι η χαμηλή έκφραση του AZGP1 συσχετίστηκε σημαντικά με τη θέση του όγκου (

P

= 0,011), ιστολογικές βαθμός (

P

= 0,005) και το στάδιο Τ (

P

= 0,008), αλλά όχι με την ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, ριζική εκτομή, κομβικό κατάσταση (στάδιο Ν) ή την κατάσταση μετάσταση (Μ φάση). Οι μικροφωτογραφίες δείχνονται στο Σχήμα 3.

Συσχέτιση μεταξύ Έκφραση AZGP1 Βασισμένο σε ανοσοϊστοχημεία και Patient Επιβίωση

Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης των ασθενών 248 γαστρικό καρκίνο ήταν 45 μήνες (εύρος 2-89 μήνες) . Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης και το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών βελτιώθηκαν σημαντικά στην ομάδα έκφραση υψηλού AZGP1 από την ομάδα χαμηλής έκφρασης [64,2% έναντι 49,5% (συνολικό ποσοστό επιβίωσης) και 65,1% έναντι 50,4% (ποσοστό επιβίωσης 5 ετών), αντίστοιχα,

P

= 0,009, Εικόνα 4].

Χαμηλή έκφραση AZGP1 συσχετίστηκε με κακή επιβίωση του ασθενούς. Οι ασθενείς στην ομάδα έκφραση υψηλού AZGP1 εμφάνισαν σημαντικά καλύτερη επιβίωση από την ομάδα έκφραση χαμηλή AZGP1 (log-rank test:

P =

0,009).

Η

μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική Αναλύσεις

μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν για να συγκριθεί η επίδραση της έκφρασης AZGP1 και άλλες κλινικοπαθολογοανατομικές παράμετροι για την πρόγνωση. Με βάση μια μονοπαραγοντική ανάλυση που περιλάμβανε όλα τα 248 ασθενείς, 8 παράγοντες βρέθηκαν να έχουν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με τη συνολική επιβίωση. Η ανάλυση αυτή έγινε ακόλουθοι παράγοντες κατά την εξέταση: θέση του όγκου, το μέγεθος του όγκου, η ιστολογική ποιότητας, τα επίπεδα έκφρασης AZGP1, το στάδιο TNM (7η έκδοση κατάταξης TNM) και κατά πόσον μια ριζική εκτομή έγινε ή όχι (Πίνακας 2). Όλα τα 8 παράγοντες περιλαμβάνονται σε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο Cox αναλογικών κινδύνων για την προσαρμογή για τις επιπτώσεις των συμπαράγοντες. Με βάση αυτό το μοντέλο, η θέση του όγκου, τα επίπεδα έκφρασης AZGP1, το στάδιο Τ και Ν στάδιο του όγκου επιβεβαιώθηκαν ως ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες (Πίνακας 2).

Η

Συζήτηση

Καρκίνος στομάχου παραμένει μία από τις πιο θανατηφόρες ανθρώπινες κακοήθειες. Ακόμη και με τις προόδους στη διάγνωση και θεραπεία, η πρόγνωση για γαστρικό καρκίνο είναι ακόμα μελαγχολική [1], [21]. Η κλινική έκβαση του καρκίνου του στομάχου εξαρτάται από μια σειρά από χαρακτηριστικά όγκου, όπως η ανάπτυξη του όγκου, τη διαφοροποίηση, την εισβολή και απομακρυσμένη μετάσταση, τα οποία ρυθμίζονται από μία ποικιλία σχετικών γονιδίων. Ως εκ τούτου, θεωρείται γενικά ότι οι γενετικές μεταβολές που οδηγούν στην ενεργοποίηση των ογκογονιδίων και την αδρανοποίηση των καταστολείς των όγκων είναι οι υποκείμενες αιτίες της παθογένειας του καρκίνου. Η διαδοχική κέρδος των ογκογονιδίων και απώλεια καταστολείς όγκων παρέχουν την αναγκαία βάση για την σταδιακή εξέλιξη των συμπαγών όγκων από την έναρξη έως τον μετασχηματισμό και την εξέλιξη του όγκου [22], [23], [24]. Προηγουμένως, AZGP1 έχει αναφερθεί ότι έχουν ιδιότητες καταστολής όγκου στον καρκίνο του μαστού, καρκίνο του προστάτη, καρκίνο του παγκρέατος και ορισμένες άλλες κακοήθεις όγκους [17], [20], [25]? Ωστόσο, ο ρόλος του AZGP1 στην πρωτογενή καρκίνο του στομάχου δεν έχει ακόμη εκτιμηθεί. Η μελέτη μας έδειξε ότι η έκφραση AZGP1 ήταν σημαντικά μειωμένο σε αμφότερα τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης σε δείγματα ιστών όγκου, σε σύγκριση με την έκφραση σε συμφωνημένα παρακείμενο δείγματα μη καρκινικό ιστό. Συνεπής με τη μελέτη μας, Brysk MM et al. έδειξαν επίσης ότι τα επίπεδα AZGP1 είναι υψηλότερα σε φυσιολογικούς ιστούς του στόματος από του στόματος σε όγκους [26]. Gagnon S et al. Επίσης, απέδειξε ότι AZGP1 ήταν παρούσα σε καλοήθη υπερπλασίας αδένες στο 91,1% των περιπτώσεων, αλλά μόνο 40,7% (ελάχιστα διαφοροποιείται συστατικό) έως 48,5% (καλά διαφοροποιημένο συστατικό) του προστάτη αδενοκαρκινώματα και μόνο το 8% των μεταστάσεων [27]. Αυτά τα αποτελέσματα της μελέτης υποστηρίζουν την υπόθεση ότι AZGP1 μπορεί να χρησιμεύσει ως καταστολέας όγκων σε ορισμένες μορφές καρκίνου.

Για την επικύρωση περαιτέρω αυτή μείωση της έκφρασης AZGP1 στην πρωτογενή καρκίνο του στομάχου, εκτελέσαμε ανοσοϊστοχημική ανάλυση με αντι-hAZGP1 αντίσωμα κουνελιού. Παρατηρήσαμε χαμηλότερη έκφραση του AZGP1 ανοσοχρώση στο εγγύς ή ολική γαστρικού καρκίνου σε σύγκριση με το μακρινό γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Μερικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι οι ασθενείς εγγύς γαστρικό καρκίνο έχουν χειρότερη επιβίωση από τους ασθενείς μακρινό γαστρικού καρκίνου [28]. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η χαμηλή έκφραση του AZGP1 σε γαστρικό καρκίνο συνδέεται με πιο κακοήθεις φαινοτύπους. Επιπλέον, ανακαλύψαμε ότι μειωμένη έκφραση AZGP1 συνδέθηκε με πτωχά διαφοροποιημένα αδενοκαρκινώματα (G3 εναντίον G1 /G2), υποδεικνύοντας ότι μπορεί να προκαλέσει AZGP1 τη διαφοροποίηση του γαστρικού καρκίνου. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με τα ευρήματα της Diez et al. [17], [18] ο οποίος περιέγραψε τη σύνδεση μεταξύ υψηλή έκφραση AZGP1 και τα υψηλά επίπεδα της διαφοροποίησης στον καρκίνο του μαστού. Παρόμοια ευρήματα έχουν επίσης αναφερθεί για τον καρκίνο του προστάτη [19], τον καρκίνο του μαστού και τον καρκίνο του παγκρέατος [26]. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η χαμηλή έκφραση του AZGP1 συνδέθηκε με προχωρημένο στάδιο Τ. Αυτά τα αποτελέσματα να εννοηθεί ότι η χαμηλή έκφραση του AZGP1 μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου. Σύμφωνα με τη μελέτη μας, Irmak S et al. πρότεινε ότι AZGP1 σχετίζεται με την ανάπτυξη του επιφανειακού καρκίνου της ουροδόχου κύστης και η μετατροπή της σε μια επεμβατική φαινότυπο [29]. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν συλλογικά ένα σημαντικό ρόλο για AZGP1 στη διαφοροποίηση και την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου.

Χρησιμοποιώντας την ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier, οι ασθενείς στη μελέτη μας με χαμηλή έκφραση AZGP1 είχαν σημαντικά μικρότερη συνολική επιβίωση από εκείνους με υψηλά επίπεδα έκφρασης. Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η μειωμένη έκφραση της AZGP1 στο γαστρικό καρκινικούς ιστούς ήταν σημαντικά σχετίζεται με το συνολικό ποσοστό επιβίωσης και το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η έκφραση AZGP1, μαζί με κάποιες παραδοσιακές προγνωστικούς παράγοντες όπως η τοποθεσία του όγκου, το στάδιο Τ και Ν σταδίου, ήταν ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου στην πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του στομάχου. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι AZGP1 θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα νέο προγνωστικό δείκτη πρόγνωσης σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο μετά από χειρουργική εκτομή.

Οι μοριακοί μηχανισμοί του όγκου κατασταλτικής ιδιότητες AZGP1 είναι ακόμα ασαφής. AZGP1 ανήκει στην οικογένεια μακροσφαιρίνη, μια αρχαία και εξελικτικά συντηρητική σύνδεσμος του ανοσοποιητικού συστήματος. Zorin NA et al. πρότεινε ότι η ικανότητα του για δέσμευση μακροσφαιρίνες υδρολάσες καθιστά την αναστολή των πιθανών ενζύμου μεσολάβηση εισβολή όγκου [30]. Ταυτόχρονα, περίσσεια συμπλοκών μακροσφαιρίνης /υδρολάση μπορεί να ενεργοποιήσει απόπτωση [31]. Ο Ν et al. ανέφεραν ότι AZGP1 επίσης ρυθμίζει προς τα κάτω εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση, η οποία είναι υπεύθυνη για τη ρύθμιση της μετάβασης G2-M, ένα βήμα περιορισμού του ρυθμού στον κυτταρικό κύκλο. Αυτό υποδηλώνει ότι AZGP1 παίζει έμμεσο ρόλο στην παρεμπόδιση εξέλιξη του όγκου [32]. AZGP1 προτάθηκε ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο του παγκρέατος με Κονγκ Β. Κ.ά. Η μελέτη τους πρότεινε ότι το γονίδιο AZGP1 επάγει τα μεσεγχυματικά-to-επιθηλιακών transdifferentiation με αναστολή ΤΘΡ-β-μεσολαβούμενη σηματοδότηση ΕΚΚ [20]. Ο λειτουργικός ρόλος και οι μηχανισμοί του AZGP1 σε γαστρικό καρκίνο χρειάζονται περαιτέρω έρευνα.

Εν κατακλείδι, ερευνήσαμε πρώτα τα επίπεδα έκφρασης και προγνωστική αξία της AZGP1 στην πρωτοβάθμια γαστρικών καρκίνων σε αυτή τη μελέτη. Αποτελέσματα Η μελέτη μας προτείνει ότι AZGP1 μπορούσε να χρησιμεύσει ως καταστολέας όγκου υποψήφιος και προγνωστικές βιοδείκτη σε πρωτογενή γαστρικών καρκίνων και είναι ένας πιθανός στόχος για θεραπευτική παρέμβαση? Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στη ρύθμιση της AZGP1 στο γαστρικό καρκίνο εντάλματα περαιτέρω έρευνα.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η έρευνα αυτή εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Sun Yat-sen University Κέντρο Καρκίνου και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή που συμμετέχουν στη μελέτη.

Ανθρώπινο ιστών Δείγμα

s

η

Ένα σύνολο 35 ζεύγη καρκινικών και να συνδυαστούν δίπλα noncancerous γαστρικό βλεννογόνο ιστοί συλλέχθηκαν από ασθενείς με γαστρικό καρκίνο που υποβάλλονται σε γαστρεκτομή στο Sun Yat-sen University Κέντρο καρκίνου από το 2010 έως το 2011. Μετά την χειρουργική εκτομή, τα φρέσκα ιστοί αμέσως βυθίζεται σε RNAlater (Ambion, Inc., USA) για την αποφυγή αποικοδόμηση RNA, φυλαγμένο σε 4 ° C όλη τη νύκτα για να επιτρέψει διεξοδική διείσδυση του RNAlater εντός του ιστού και στη συνέχεια καταψύχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την πραγματοποίηση της εκχύλισης RNA και πρωτεΐνης. Ένα άλλο 248 δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες πρωτογενή γαστρικού καρκινώματος που είχαν συλλεχθεί μεταξύ του 2005 και του 2007 ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο Κέντρο Καρκίνου Sun Yat-sen. Κανένας από αυτούς τους ασθενείς είχαν λάβει ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Η ιστοπαθολογική τύπο και το στάδιο του καρκίνου του στομάχου προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τα κριτήρια της κατάταξης της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας και το στάδιο ΤΝΜ που ορίζονται από την Ένωση για τη Διεθνή Έλεγχο του Καρκίνου.

Εκχύλιση του ολικού RNA και σε πραγματικό χρόνο Ποσοτική RT-PCR

το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η συνολική συγκέντρωση RNA εκτιμήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 260 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NANO DROP (ND-1000, Thermo Scientific, USA). Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) για να συνθέσει το πρώτο κλώνου του cDNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 2 μg ολικού RNA επεξεργάστηκε με Μ-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Promega, USA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Το προκύπτον cDNA στη συνέχεια υποβλήθηκε σε πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR για την αξιολόγηση των σχετικών επιπέδων mRNA του AZGP1 και GAPDH (αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης, ως ένας εσωτερικός έλεγχος) με τους ακόλουθους εκκινητές: AZGP1 εμπρός: 5′-GGAAGCAGGACAGCCAACTT -3 ‘, και αντίστροφη: 5′-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3′? GAPDH προς τα εμπρός: 5’-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ‘, και να αντιστραφεί: 5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3’. Gene-ειδική ενίσχυση εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα πραγματικού χρόνου PCR ΑΒΙ 7900HT (Life Technologies, Carlsbad, California, USA) με ένα 15-μΙ μίγματος PCR που περιέχει 0,5 μΙ cDNA, 7.5 μΐ 2 χ SYBR Green κύριο μείγμα (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), και 200 ​​ηΜ των κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών. Το μίγμα προθερμάνθηκε στους 95 ° C (10 λεπτά) και στη συνέχεια ενισχύεται στους 95 ° C (30 δευτερόλεπτα) και 60 ° C (1 λεπτό) για 45 κύκλους. Η καμπύλη ανάλυση μετρήθηκε στους 95 ° C για 15 sec, 60 ° C για 15 sec και 95 ° C για 15 sec. Η τιμή Ct (κύκλος κατωφλίου) του κάθε δείγματος υπολογίστηκε από τους κύκλους κατώφλι με το λογισμικό του οργάνου (SDS 2.3), και η σχετική έκφραση του mRNA AZGP1 κανονικοποιήθηκε με την τιμή GAPDH. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του κύκλου συγκριτικής όριο (2

-ΔCt) μέθοδος, όπως τον ακόλουθο τύπο: Σχετικό επίπεδο έκφρασης = 2

-ΔCt = 2

-Ct (GAPDH) – 2

-Ct (AZGP1), στην οποία Ct (GAPDH) είναι η τιμή Ct των GAPDH και Ct (AZGP1) είναι η τιμή Ct των AZGP1.

Δυτική Blotting Ανάλυση

Τα ομογενοποιημένα γαστρικό δείγματα καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του όγκου και μη όγκου ιστούς, λύθηκαν εντός RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως, και τα προϊόντα λύσης συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (12,000 rpm) στους 4 ° C για 30 λεπτά. Περίπου 20 μg δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν στη συνέχεια με ηλεκτροφόρηση σε ένα πηκτώματος δωδεκυλθειικού νατρίου πολυακρυλαμιδίου 12% και μεταφέρθηκαν σε ένα φθοριούχο πολυβινυλιδένιο μεμβράνες. Μετά τον αποκλεισμό των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης για 60 λεπτά με 5% γάλα χωρίς λιπαρά, οι μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι AZGP1 (PTG Company, USA, σε αραίωση 1:200). Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με TBST (τρις-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween-20) για 10 λεπτά και ανιχνεύθηκε με το ραφανιδική υπεροξειδάση (HRP) αντίσωμα IgG αντι-κουνελιού κατσίκας (Immunology Consultants Laboratory, USA, σε ένα 1: 2000 αραίωση) στους 37 ° C για 1 ώρα. Μετά από τρεις πλύσεις, οι μεμβράνες αναπτύχθηκαν με ένα ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA). Η ένταση της ζώνης μετρήθηκε με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, CA, USA). Τα επίπεδα πρωτεΐνης κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη του GAPDH ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπου GAPDH μονοκλωνικό αντίσωμα (Shanghai Kangchen, Κίνα, σε αραίωση 1:10000).

Ανοσοϊστοχημεία Ανάλυση

Τα τμήματα ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν με διμεθυλοβενζόλιο και επανυδατώθηκαν μέσω της κατά 100%, 95%, 90%, 80% και 70% αιθανόλη. Μετά από τρεις πλύσεις σε PBS (αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό), τα πλακίδια υπέστησαν ζέση σε ρυθμιστικό ανάκτηση αντιγόνου που περιέχει 0.01 Μ κιτρικό νάτριο-υδροχλωρικό οξύ (ρΗ = 6.0) για 15 λεπτά σε φούρνο μικροκυμάτων. Μετά την έκπλυση με PBS, οι τομές ιστών επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα και οι πλάκες στη συνέχεια ξεπλύθηκαν σε 3% διάλυμα υπεροξειδάσης απόσβεσης (Invitrogen) για να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι AZGP1 (PTG Company, USA, σε αραίωση 1:200) στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια επωάστηκαν με υπεροξειδάση (HRP) (DAKO ChemMateTM EnVisionTM Detection Kit) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Μετά την πλύση σε PBS, το σήμα οπτικοποίηση αναπτύχθηκε με 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη διάλυμα (DAB), και όλα τα πλακίδια με αιματοξυλίνη. Ως αρνητικοί έλεγχοι, γειτονικά τμήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε παραπάνω εκτός του ότι αυτά επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C εντός διαλύματος αποκλεισμού χωρίς το πρωτεύον αντίσωμα.

Τα δείγματα αναλύθηκαν με τρεις παρατηρητές (Chunyu Huang, Lin Lv, και Jingjing Zhao), οι οποίοι δεν γνώριζαν την κλινική έκβαση των ασθενών. Αποκλίσεις μεταξύ των παρατηρητών βρέθηκαν σε λιγότερο από το 10% των εξεταζόμενων διαφάνειες και συναίνεση επιτεύχθηκε μετά από περαιτέρω επανεξέταση. Η συνολική βαθμολογία AZGP1 ανοσοχρώση υπολογίστηκε ως το άθροισμα του ποσοστού θετικότητας (το ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων όγκου) και την ένταση χρώσης. Το ποσοστό θετικότητας βαθμολογήθηκε ως «0» (lt &? 5%, αρνητική), «1» (5-25%, σποραδική), «2» (25-50%, εστιακή), ή «3» (& gt? 50 %, διάχυτη). Η ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε ως «0» (χωρίς χρώση), «1» (ασθενώς χρωματισμένο), «2» (μέτρια χρώση), ή «3» (έντονα χρωματισμένο). Η συνολική AZGP1 ανοσοχρώση βαθμολογία κυμαίνεται από 0 έως 9. Ορίσαμε τα επίπεδα έκφρασης AZGP1 ως εξής: «-» για ένα σκορ 0-1, «+» για ένα σκορ 2-3, που ορίστηκαν ως χαμηλή έκφραση? «++» Για ένα σκορ 4-6, και το «+++» για ένα αποτέλεσμα & gt?. 6, τα οποία ορίστηκαν ως υψηλή έκφραση

Συνέχεια Up

Η μετεγχειρητική παρακολούθηση -up διεξήχθη σε εξωτερικά ιατρεία μας και συμπεριλαμβάνονται κλινικές και εργαστηριακές εξετάσεις κάθε 3 μήνες για τα πρώτα 2 χρόνια, κάθε 6 μήνες κατά το τρίτο έως το πέμπτο έτος, και σε ετήσια βάση για επιπλέον 5 έτη ή μέχρι το θάνατο του ασθενούς, όποιο από τα δύο συμβεί πρώτο. Η συνολική επιβίωση, η οποία ορίζεται ως ο χρόνος από τη λειτουργία στο θάνατο του ασθενούς ή την τελευταία παρακολούθηση, χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο της πρόγνωση. Υπήρχαν περίπου 4% των ασθενών χάσει παρακολούθησης.

Στατιστική Ανάλυση

Μια ζευγαρωμένα δείγματα t-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνουν τα επίπεδα AZGP1 mRNA στα δείγματα ιστού του όγκου και του παρακείμενου μη δείγματα ιστού όγκου. Η

χ

2 τεστ για ποσοστό και οι συντελεστές συσχέτισης του Pearson χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της σχέσης μεταξύ της έκφρασης AZGP1 και διάφορα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Συνολικά καμπύλες επιβίωσης υπολογίστηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier και αναλύθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Cox ανάλυση αναλογικής κινδύνου χρησιμοποιήθηκε για την μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση για να διερευνήσει την επίδραση της κλινικοπαθολογοανατομικών μεταβλητών και της έκφρασης AZGP1 στην επιβίωση. Ένα δύο όψεων

P

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό SPSS (έκδοση 17.0? SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση της έκφρασης πρωτεΐνης AZGP1 σε γαστρικό καρκινικό ιστό. Η θετική έκφραση της AZGP1 εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069155.s001

(ΔΕΘ)