Αφηρημένο

Οι ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη σχεδόν πάντα αναπτύσσουν οστική μετάσταση. Αν και πολλές μελέτες δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση φαίνεται να συσχετίζεται με προχωρημένο καρκίνο και προωθεί μετάσταση όγκου επηρεάζοντας τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την αγγειογένεση, την επίδραση της αλλαγμένης σηματοδότησης ΝΡ-κΒ σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη εντός Κοκαλιάρης μεταστατικών αλλοιώσεων δεν είναι σαφώς κατανοητή. Ενώ C4-2B και PC3 καρκίνου του προστάτη κύτταρα αναπτύσσονται καλά στο οστό, τα κύτταρα LNCaP είναι δύσκολο να αναπτυχθούν σε ποντικού οστού μετά intraskeletal ένεση. Οι μελέτες μας δείχνουν ότι όταν συγκρίνεται με LNCaP, δραστικότητα ΝΡ-κΒ είναι σημαντικά υψηλότερη σε C4-2B και PC3, και ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του οστεοκλαστών επαγωγής γονιδίων PTHrP και RANKL. Περαιτέρω, ρυθμισμένο μέσο που προέρχεται από ΝΡ-κΒ ενεργοποιημένα κύτταρα LNCaP επάγουν τη διαφοροποίηση των οστεοκλαστών. Επιπλέον, η αδρανοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη ανέστειλε σχηματισμό όγκου στο οστό, τόσο στην PC3 οστεολυτικές και οστεοβλαστικές /οστεοκλαστικής μικτά κύτταρα C4-2B? ενώ η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση σε κύτταρα LNCaP προωθούνται καρκινική εγκαθίδρυση και του πολλαπλασιασμού στο οστό. Η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα LNCaP είχε ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός οστεοβλαστικών /οστεοκλαστικής μικτού όγκου με αυξημένη οστεοκλάστες που περιβάλλει το νέο οστό σχηματίζεται, παρόμοια με μεταστάσεις παρατηρείται συχνά σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οστεοκλαστική αντίδραση απαιτείται ακόμη και στις οστεοβλαστικά καρκινικά κύτταρα και η ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη αυξάνει οστεοκλαστογένεσης μέχρι ρύθμισης osteoclastogenic γονίδια, συμβάλλοντας έτσι στο σχηματισμό οστού μεταστατικό

Citation.: Jin Ε, Sterling JA, Edwards JR, DeGraff DJ, Lee C, Πάρκο SI, et al. (2013) Η ενεργοποίηση του NF-kappa Β Σηματοδότησης προάγει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη στα οστά. PLoS ONE 8 (4): e60983. doi: 10.1371 /journal.pone.0060983

Επιμέλεια: Qiming Jane Wang του Πανεπιστημίου του Πίτσμπουργκ της Ιατρικής Σχολής, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Αυγούστου 2012? Αποδεκτές: 5 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: 5η του Απριλίου 2013

Copyright: © 2013 Jin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε με RJ από το Υπουργείο άμυνας (DOD) Καρκίνος του προστάτη Πρόγραμμα Έρευνας (PCRP) (W81XWH-10-1-0236)? να JAS από την tmen (5U54 CA 126505), το Πανεπιστήμιο Vanderbilt Κέντρο οστών PPG (5P01 CA40035) και το Υπουργείο Υποθέσεων Βετεράνων Βραβείο Ανάπτυξης Σταδιοδρομίας? να RJM από το National Cancer Institute (4R01 CA076142-14) και των Frances Preston Εργαστήρια του Τ.Ι. Ίδρυμα Martell. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σχεδόν όλοι οι ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη (PCA) να αναπτύξει μετάσταση osseus. Η ανάπτυξη της ανάπτυξης του όγκου στο οστό είναι η πιο κρίσιμη επιπλοκή των προηγμένων προστάτη, συχνά με αποτέλεσμα σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα [1]. Σε αντίθεση με άλλους τύπους καρκίνου, μία αρχική μεταστατικά κατάθεση των κυττάρων PCA είναι σχεδόν περιορίζεται αυστηρά σε οστό και είναι συχνά η μόνη θέση του άπω εξάπλωσης ακόμη και σε προχωρημένα στάδια της νόσου του [2]. Μόλις τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη εισάγετε τον σκελετό, ένα καταστροφικό κύκλο των ακαθάριστων βλάβη του σκελετού και του όγκου αύξηση συμβαίνει, σε ποιο σημείο θεραπευτική αγωγή δεν είναι πλέον δυνατή και ανακουφιστική θεραπεία γίνεται η μόνη επιλογή. Ο διάμεσος χρόνος μεταξύ της διάγνωσης μιας κλινικά εμφανή σκελετική μετάσταση και ο θάνατος είναι περίπου 3-5 χρόνια [3]. Ως εκ τούτου, η κατανόηση του μηχανισμού με τον οποίο τα κύτταρα του προστάτη ευδοκιμούν εντός του περιβάλλοντος οστού και την ανάπτυξη αποτελεσματικών μέθοδο (ες) για την πρόληψη ή τη θεραπεία του προστάτη μετάσταση οστού είναι κρίσιμης σημασίας για την αύξηση του ποσοστού επιβίωσης των ασθενών με προχωρημένο προστάτη.

Σε αντίθεση με άλλα στερεά όγκοι που σχετίζονται με οστεολυτικές μεταστάσεις, η PCA μετάσταση στα οστά συνδέεται με οστεοβλαστικές μετάσταση. Ωστόσο, η επιτυχής αποικισμός του οστού από τα κύτταρα του προστάτη απαιτεί τόσο οστεολυτικές και οστεοβλαστικές διαδικασίες. Αυτό συμβαίνει εν μέρει επειδή τα κύτταρα του προστάτη είναι ικανά να παράγουν παράγοντες ανάπτυξης που μπορεί να επηρεάσει τόσο οστεοβλάστες και οστεοκλάστες, με αποτέλεσμα οστεοβλαστική σχηματισμό οστού και η υπερβολική επαναρρόφηση οστού [1], [4]. Ενώ ο ρόλος των οστεοβλαστών σε προστάτη μετάσταση στα οστά είναι καλά αναγνωρισμένο, διάφορα ευρήματα υποδηλώνουν έντονα έναν σημαντικό ρόλο για τη λειτουργία των οστεοκλαστών στην επιτυχή σχηματισμό του προστάτη οστικών μεταστάσεων [5] – [10]. Για παράδειγμα, όταν τα κύτταρα του προστάτη αποικίσουν αρχικά ένα κόκαλο, εντούτοις θεωρείται πρώτα να επάγουν την οστεοκλαστογένεση [11], και μετέπειτα επαναρρόφηση οστού. Ιστομορφομετρική στοιχεία δείχνουν ότι οστεοβλαστικών μεταστάσεων σχηματίζουν σε δοκιδωτό οστό σε θέσεις της προηγούμενης επαναρρόφησης οστεοκλαστών και τέτοια επαναρρόφηση απαιτείται για τον επακόλουθο σχηματισμό οστεοβλαστικών οστών [12]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι προστάτη προκαλεί εναπόθεση των οστών μέσω μιας συνολικής αύξησης της οστικής ανακατασκευής. Επιπλέον, οστεοκλαστική επαναρρόφηση οστού συμβάλλει στην πλειονότητα των σκελετικών επακόλουθα, ή σκελετικών σχετίζονται εκδηλώσεις (SREs, όπως κάταγμα και πόνος), σε ασθενείς με οστικές μεταστάσεις. Περαιτέρω, οστεοκλαστική επαναρρόφηση οστού συμβάλλει επίσης στη δημιουργία όγκων στον σκελετό. Ως εκ τούτου, οστεοκλαστογένεση που προκαλείται από τα κύτταρα του προστάτη προτείνεται να είναι ένα πρώιμο συμβάν της μετάστασης στα οστά και αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση αρχικής για την PCA οστών αποικισμό. Αν και η έννοια της ενεργοποίησης των οστεοκλαστών, ως υποκείμενο στοιχείο της ανάπτυξης του προστάτη στα οστά είναι ήδη καλά αναγνωρίζεται, οι μηχανιστικές λεπτομέρειες με τις οποίες τα κύτταρα του προστάτη αυξάνουν την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών και στη συνέχεια να προκαλέσει μετάσταση στο περιβάλλον των οστών είναι ακόμα ασαφής.

είναι πλέον ευρέως πιστεύεται ότι η μοριακή τριάδα – Receptor Activator του NF-κΒ Ligand (RANKL), RANK υποδοχέα της, και του ενδογενούς αναστολέα διαλυτό RANKL, οστεοπροτεγερίνη (OPG) – διαδραματίζει ουσιαστικό και άμεσο ρόλο στο σχηματισμό, τη λειτουργία και την επιβίωση των οστεοκλάστες. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι RANKL /RANK /OPG είναι οι βασικοί ρυθμιστές του μεταβολισμού των οστών, τόσο σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένων των οστικών μεταστάσεων του προστάτη [13], [14]. Ένα άλλο σημαντικό γονίδιο, παραθυρεοειδή ορμόνη πρωτεΐνη που σχετίζεται με (PTHrP), είναι γνωστό ότι εμπλέκεται σε διαφοροποίηση οστεοκλαστών. PTHrP παράγεται από όλους σχεδόν τους όγκους που μετάσταση σε οστά, και πολυάριθμες μελέτες έχουν καταδείξει μια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης PTHrP και των σκελετικών εντοπισμός των όγκων. PTHrP έχει εξέχουσα επιπτώσεις στο οστό μέσω αλληλεπίδρασης της με τον υποδοχέα ΡΤΗ-1 επί των οστεοβλαστικών κυττάρων. Κατά τρόπο έμμεσο, PTHrP υποστηρίζει οστεοκλαστογένεσης από up-ρύθμιση RANKL σε οστεοβλάστες [15]. τα κύτταρα του προστάτη έχουν δειχθεί ότι εκφράζουν διάφορους παράγοντες που ρυθμίζουν την οστεοκλαστογένεση, συμπεριλαμβανομένων PTHrP, μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικιών (Μ-CSF), τα μέλη των β παράγοντα ανάπτυξης μεταμόρφωσης (ΤΟΡ-β) υπεροικογένεια, και ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (uPA- πλασμίνη), με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs? ειδικά ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9), καθώς και η ιντερλευκίνη-1 (IL-1) και η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) [16]. Ωστόσο, ο προσδιορισμός του κρίσιμου μηχανισμού (-ών) ή κύρια οδός (ες) που είναι υπεύθυνος για την αρχική έκφραση των γονιδίων osteoclastogenic (ες) και η υπερβολική απορρόφηση με αποτέλεσμα την προώθηση της μετάστασης προστάτη των οστών παραμένει άπιαστο.

Είναι ευρέως αποδεκτό ότι RANKL /RANK /OPG είναι οι βασικοί ρυθμιστές του μεταβολισμού των οστών και η PTHrP είναι ένα από τα πιο σημαντικά κλειδιά ρυθμιστικές αρχές σε οστεοκλαστών και τη διαφοροποίηση των οστεοβλαστών. Ως εκ τούτου, στην παρούσα μελέτη έχουμε επικεντρωθεί στην κατανόηση πώς RANKL και PTHrP ρυθμίζονται στα κύτταρα του προστάτη από τον NF-κΒ. NF-κΒ πρωτεΐνες αποτελούν σημαντική κατηγορία των μεταγραφικών ρυθμιστών στη ΣΕΣΣ. Άφθονα στοιχεία υποστηρίζει ένα βασικό ρόλο για την οδό σηματοδότησης ΝΡ-κΒ στον έλεγχο της έναρξης και της εξέλιξης του ανθρώπινου καρκίνου [17] – [20]. Η υπερ-έκφραση του ΝΡ-κΒ στον πυρήνα των κυττάρων προστάτη φαίνεται να συσχετίζεται με προστάτη χημειοαντίσταση, προχωρημένο στάδιο, επανάληψη PSA και μεταστατική εξάπλωση [21] – [27]. Αρκετές μελέτες έχουν δημοσιεύσει στοιχεία που να αποδεικνύουν την οδό NF-κΒ είναι ένας παράγοντας που συμβάλλει στην σπλαχνικό ή «μαλακών ιστών» μετάσταση σε προστάτη [18], [19], [28], [29]. Προηγουμένως, έχουμε αναφέρει ότι η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση προωθεί ευνουχισμού ανθεκτική ανάπτυξη του προστάτη [30]. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση στον αποικισμό των κυττάρων προστάτη μέσα στο περιβάλλον οστό και ο ρόλος αυτού του μηχανισμού παίζει στο σκελετικό καταστροφή που σχετίζεται με μετάσταση στα οστά προστάτη. Αναφέρουμε ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση αυξάνει την έκφραση των γονιδίων σε osteoclastogenic κύτταρα PCa, η οποία είναι επαρκής για καρκινικά κύτταρα να προσκολληθούν και να αναπτυχθούν στο περιβάλλον οστό και να ενισχύσει τον σχηματισμό αλλοίωσης. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση σε κύτταρα προστάτη αυξάνει οστεοκλαστογένεσης μέχρι ρύθμισης osteoclastogenic γονίδια, συμβάλλοντας έτσι στην οστικές μεταστάσεις σχηματισμού. Η μελέτη μας δείχνει ότι η στόχευση κάτω ρύθμιση του NF-κΒ θα μπορούσε να έχει σημαντικό αντίκτυπο στη μείωση των επώδυνων οστικών μεταστάσεων σε ασθενείς με προχωρημένο προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και Υλικά |

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκινώματος προστάτη LNCaP και PC-3 ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA). C4-2B κύτταρα ήταν δώρα του Δρ Leland Chung (Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, CA) [31]. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα. Οι κυτταρικές σειρές ήταν συνήθως καλλιεργούνται σε RPMI 1640 (Gibco-BRL) μέσου που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Hyclone), 0,1% ITS και 0,1% γλουταμίνη (Gibco-BRL).

Δημιουργία ΝΡ κΒ σηματοδότηση συνεχώς ενεργοποιημένο /απενεργοποιημένο κυτταρικές σειρές προστάτη

Για να δημιουργήσετε μια μόνιμα ενεργοποιημένη NF-κΒ σηματοδότηση κυτταρική σειρά προστάτη, LNCaP κύτταρα σταθερά μολυνθεί με ρετροϊικό ΙΚΚ2-EE με αποτέλεσμα LNCaP-EE, στο οποίο NF-κΒ δραστικότητα ενεργοποιήθηκε με μία ουσιαστικά δραστική (EE) μεταλλάξεις της ΙΚΚ2 [32], [33]. Για τη δημιουργία του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση συνεχώς αδρανοποιημένο κυτταρικές σειρές PCa, C4-2B και PC3 κύτταρα σταθερώς μολυσμένα με ΙΚΚ2-KD ρετροϊικού φορέα (C4-2B-KD και PC3-KD), στην οποία η ενεργότητα του ΝΡ-κΒ αναστάλθηκε με μια κινάση νεκρά (KD) ΙΚΚ2 μεταλλαγμένα [32], [33]. Τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με κενό φορέα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (LNCaP-EV, C4-2B-EV και PC3-EV). Όλες οι φορείς ρετροϊών ήταν ένα δώρο από τον Δρ Martin Leverkus, Πανεπιστήμιο του Μαγδεμβούργου, Γερμανία.

Η αντίστροφη μεταγραφή και Real-time PCR

Σύνολο RNAs από LNCaP, LNCaP-EE, C4-2B και PC3 κύτταρα εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Gibco-BRL), και υπολειμματικό γονιδιωματικό DNA απομακρύνθηκε με DNaseI κατεργασία (Invitrogen). Τα RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας τυχαία εναύσματα και Superscript II (Gibco-BRL) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν RANKL ήταν 5′-TGGAAGGCTCATGGTTGGAT-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-CATTGATGGTGAGGTGTGCAA-3′ (αντίστροφο)? PTHrP ήταν 5’-TTAAAGCAGTACCCCCCTACCA-3 ‘(προς τα εμπρός), 5′-ATGGGCTCTAGCGCCTCTCT-3’ (αντίστροφο). Real-time PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν σε ένα όγκο 20 μΐ χρησιμοποιώντας μια μορφή πλάκας 96-φρεατίων και ο φθορισμός ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης σε πραγματικό χρόνο Bio-Rad Ι-Cycler IQ. γονιδιακή έκφραση ομαλοποιήθηκε με 18 ετών rRNA από 2

-ΔΔCt μέθοδο [34].

RANKL ELISA και PTHrP Radio-ανοσο προσδιορισμούς (RIA)

Για τον προσδιορισμό των επιπέδων RANKL και PTHrP εκκρίνεται από τα κύτταρα PCa, LNCaP-EV, LNCaP-EE, PC3-EV και PC3-KD κύτταρα καλλιεργήθηκαν ξεχωριστά για 48 ώρες? οι αριθμοί των κυττάρων μετρήθηκαν. 40 και 100 μι μέσου καλλιέργειας χρησιμοποιήθηκαν στην ELISA (MyBioSource) και RIA (Beckman Coulter) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, αντίστοιχα. Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν με αναγνώστη ELISA ή ένα μετρητή γάμμα (Beckman Coulter) και οι συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Western ανάλυση κηλίδος

λύμα ολόκληρων κυττάρων εκχυλίζεται από NF-κΒ ενεργοποιημένα /απενεργοποιημένα κύτταρα του προστάτη. Ένα δείγμα 20 μα εκάστου δείγματος πρωτεΐνης διαχωρίστηκε σε Τπδ-γλυκίνη γέλη κλίση 4 έως 12% (Novex ™), και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Schleicher & amp? Schuell, Germany). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε ΤΒδ-Τ (θρυψίνη ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, 1% Tween-20) ρυθμιστικό. Το RANKL (N19, Σάντα Criuz) ή PTHrP (N19, Σάντα Criuz) αντισώματα προστέθηκαν στη βέλτιστη συγκέντρωσή τους (1:1000) και οι κηλίδες επωάστηκαν 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύση τρεις φορές για 10 λεπτά κάθε φορά σε TBS-Τ, πραγματοποιήθηκε επώαση για 1 ώρα με τα δευτερογενή αντισώματα αντι-ποντικού υπεροξειδάσης συζευγμένο με κατσίκα, αντίστοιχα. Τα σήματα αναπτύχθηκαν από ένα σύστημα ανίχνευσης ECL (Amersham Biosciences, Amersham, USA).

παροδική επιμόλυνση δοκιμασία

Ο φορέας NGL [a ΝΡ-κΒ αποκρίνεται φορέα ρεπόρτερ ο οποίος έχει λουσιφεράση και πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) γονίδια αναφοράς] [35] χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ στα κύτταρα καρκίνου του προστάτη από πειράματα παροδικής επιμόλυνσης. LNCaP, C4-2B και PC3 κύτταρα επιστρώθηκαν σε μία αρχική πυκνότητα των 2.5 χ 10

4 φρεάτιο σε πλάκες καλλιέργειας ιστού /24 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον φορέα NGL χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη (Invitrogen) για τέσσερις ώρες σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης προσδιορίστηκε με συν-επιμόλυνση pRL-CMV που περιέχει το γονίδιο ανταποκριτή λουσιφεράσης Renilla (Promega). Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης Promega Corp 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Οι τιμές απεικονίζονται αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τουλάχιστον τριών μεμονωμένων δειγμάτων ± SEM.

διαφοροποίηση των οστεοκλαστών δοκιμασία

κύτταρα του μυελού των οστών απομονώθηκαν από μηριαία οστά ποντικού με πίεση του υγρού που εφαρμόζεται με μία σύριγγα. Για την απόκτηση των οστών που προέρχονται από μυελό των μονοκυττάρων /μακροφάγων, τα κύτταρα του μυελού των οστών καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM που περιέχει 10% L929 υπερκείμενο ως πηγή του Μ-CSF και RANKL [36]. Μετά τις πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα μυελού των οστών διαφοροποιούνται σε μονοκύτταρα /μακροφάγα (περίπου 6 ημέρες), τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ρυθμισμένο μέσο από διαφορετικά κύτταρα PCa (LNCaP, LNCaP-EE, C4-2B και τα κύτταρα PC3) . Για να δημιουργηθούν τα ρυθμισμένα μέσα που περιέχουν εκκρίσεις των κυττάρων προστάτη, RPMI 1640 (που περιέχει 5% FBS, 0.1% ITS και 0,1% γλουταμίνη) προστέθηκε στη ΣΕΣΣ πιάτο καλλιέργειας κυττάρων. Μετά από 24 ώρες, το μέσο συλλέχθηκε και μεταφέρθηκε σε κύτταρα στόχους (μονοκύτταρα /μακροφάγα). Το μέσο όρο ήταν αλλάζονται καθημερινά. Στη συνέχεια, μετά από 10 ημέρες επιπλέον καλλιέργειας με ρυθμισμένα μέσα, τα κύτταρα-στόχοι σταθεροποιήθηκαν και η διαφοροποίηση των οστεοκλαστών επιβεβαιώθηκε με ανθεκτική σε τρυγικά όξινο φωσφορικό (TRAP) χρώση (Sigma). Κύτταρα με θετική χρώση για TRAP που περιέχουν 3 ή περισσότερους πυρήνες μετρήθηκαν ως οστεοκλάστες. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, ο αριθμός των οστεοκλαστών σε κάθε φρεάτιο της πλάκας 24-φρεατίων μετρήθηκε κάτω από το μικροσκόπιο. Κάθε ομάδα έχει 6 πηγάδια (φρεάτια της πλάκας 24 φρεατίων). Τα αποτελέσματα έδειξαν ως μέσος αριθμός ± τυπικές αποκλίσεις.

πολλαπλασιασμό οστεοβλάστες δοκιμασία

Μια 3-ημερών κουτάβι παλιά άγριου τύπου C57BL6 αναισθητοποιήθηκε σε πάγο μετά από βουτιά σε 70% αιθανόλη. Στη συνέχεια θανατώθηκαν με αποκεφαλισμό με ψαλίδι, το τριχωτό της κεφαλής έγινε μια κεντρική τομή και εκτίθενται το κρανίο. Κρανίο (μετωπιαίο, το βρεγματικό, χρονική και ινιακό οστά) αποκόπηκε με ένα ζευγάρι πρόστιμο ίριδας ψαλίδι και απομακρύνονται εγκεφάλου σε α-ΜΕΜ (ελεύθερο ορού) σε 60 mm δίσκο. Κρανιακών οστών κόπηκε σε 4-5 κομμάτια. Οστά τέθηκαν σε κωνικό σωλήνα 15 ml με 2 ml μέσου κολλαγενάσης [media α-ΜΕΜ χωρίς ορό με κολλαγονάση Α (2 mg /ml)]. Τα οστά επωάζονται για 30 λεπτά σε 100 rpm σε 37 ° C βακτηριακή αναδευτήρα. Το υπερκείμενο μέσο απαλά απορρίφθηκε, και τα οστά προστέθηκαν 5 ml των νέων μέσων κολλαγενάσης και επωάζονται για 2 ώρες στους 150 rpm σε κούνημα θερμοκοιτίδα. Μετά από φυγοκέντρηση σε 1500 rpm για 3 λεπτά, το υπερκείμενο μέσο ήπια απορρίφθηκε και επαναιωρήθηκαν 5 ml σε α-ΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS και 2 χ Penn /Strep και μεγάλωσε σε πιάτο 60 mm. Μετά από 2 εβδομάδες, οι πρωτογενείς οστεοβλάστες καλλιεργήθηκαν σπάρθηκαν σε αγροτεμάχια των 96 φρεατίων και κατεργάστηκαν με ρυθμισμένο μέσο από ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται /απενεργοποιημένα κύτταρα προστάτη (LNCaP-EV, LNCaP-EE? C4-2B-EV, C4-2B-KD? PC3-EV και τα κύτταρα PC3-KD). Για να δημιουργηθούν τα ρυθμισμένα μέσα που περιέχουν εκκρίσεις των κυττάρων προστάτη, RPMI 1640 (που περιέχει 5% FBS, 0.1% ITS και 0,1% γλουταμίνη) προστέθηκε στα πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας PCa. Μετά από 24 ώρες, το μέσο συλλέχθηκε και μεταφέρθηκε σε κύτταρα στόχους (οστεοβλάστες). δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία.

μοντέλο ποντικού της νόσου των οστών που οφείλεται σε νεοπλασία

Όλες οι μελέτες σε ζώα διεξήχθησαν αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Vanderbilt Θεσμικών Animal Care & amp? Χρήση Επιτροπής (Αριθμός Άδειας: M /09/387). Τόσο ο NF-κΒ ενεργοποιείται (PC3-EV, C4-2B-EV και LNCaP-EE) και αδρανοποιημένο (PC3-KD, C4-2B-KD και LNCaP-EV) κύτταρα του προστάτη χρησιμοποιήθηκαν για να διερευνήσει κατά πόσον η ενεργοποίηση του ΝΡ κΒ σηματοδότηση συμβάλλει στη δημιουργία όγκων του προστάτη και της ανάπτυξης στο περιβάλλον οστό. Για να μειωθεί η μεταβλητότητα μεταξύ των ξενιστών κατά τη σύγκριση ελέγχου και δοκιμής ομάδες, NF-κΒ ενεργοποιείται και απενεργοποιημένα κύτταρα προστάτη εμβολιάζονται στο ίδιο ποντίκι. Σε κάθε υποδοχής, η αριστερή κνήμη εγχύθηκε με NF-κΒ ενεργοποιείται προστάτη (PC3-EV, C4-2B-EV και LNCaP-EE) κύτταρα, ενώ η δεξιά κνήμη εγχύθηκε με NF-κΒ αδρανοποιηθεί προστάτη (PC3-KD, C4-2B-KD και LNCaP-EV) κύτταρα, αντιστοίχως. Ειδικότερα, ένα εναιώρημα μονού κυττάρου 2 × 10

5 PC3-EV ή PC3-KD? C4-2B-EV ή C4-2B-KD? LNCaP κύτταρα-EV ή LNCaP-EE /10 μΙ PBS τοποθετήθηκε απευθείας μέσα στο παλιό 6-7 εβδομάδων αρσενικών αθυμικών γυμνών ποντικών (BALB /c στέλεχος) του οστού με intratibial ένεση κάτω από το αναισθησία με ισοφλουράνιο, αντίστοιχα. Κάθε ομάδα είχε ένα ελάχιστο 4 ποντικών. Οστεοβλαστική βλάβες αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας απεικόνιση μικρών ζώων X-ray ακτινογραφία (ΡθχϊΙγοπ LX-60? Lincolnshire). Μετά τη θυσία, ο όγκος των οστών αξιολογήθηκε από την αξονική τομογραφία και ιστολογική ανάλυση σε 3 (για PC3-EV και PC3-KD κύτταρα εγχέονται ποντίκια) και 10 (για LNCaP-EV, LNCaP-EE, C4-2B-EV και C4-2B -KD κύτταρα εγχύθηκαν ποντικοί) εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό του όγκου. Συγκομιδής κνήμες ακινητοποιήθηκαν σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα-φορμαλίνης διάλυμα 10% για 24 ώρες και απασβεστώθηκαν σε 0,5 mol /L EDTA σε Ca

2 + – και Mg

2 + -δωρεάν PBS του Dulbecco για μία εβδομάδα πριν από την ενσωμάτωση σε παραφίνη. Έξι-μικρόμετρο διαμήκη σειριακές τομές κόπηκαν από την κνήμη και χρωματίστηκαν με Η &? Ε ή με IHC να αναλύσει την ανάπτυξη του όγκου στο οστό. Ιστομορφομετρική ανάλυση για τον όγκο του όγκου (TV) και ο όγκος του δοκιδωτού οστού (BV) διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Metamorph (Molecular Devices, Inc.) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37].

τομογραφίας με μικροϋπολογιστή (μCT) ανάλυση

για τον προσδιορισμό της τρισδιάστατης αρχιτεκτονική του οστού μετά τον εμβολιασμό του όγκου, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και ο κνημών συνελέγησαν και σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης-διάλυμα 10% για 24 ώρες, ακολουθούμενη από 70% αιθανόλη. Τα δείγματα σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα μCT (Scanco μCT 40? Bassersdorf, Ελβετία). Η σάρωση αποτελούνταν από 129 φέτες, με μία τιμή κατωφλίου των 263. Μία τρισδιάστατη αναπαράσταση των εικόνων έγινε με την περιοχή ενδιαφέροντος που αποτελείται από δοκιδωτή περιοχών. Περιοχές ενδιαφέροντος συντάχθηκαν για κάθε ένα από τα 100 φέτες, ακριβώς μέσα στο φλοιώδες οστό, ώστε να περιλαμβάνει μόνο το σπογγώδες οστό και το μυελό.

Η ανοσοϊστοχημεία

τομές ιστών παραφίνη-ενσωματωμένες της κνήμης ήταν χρωματισμένο ανοσοϊστοχημικά με αντισώματα κατά του AR (κλώνος Ν20, Santa Cruz), PSA (κλώνος LK2H10, Santa Cruz) και Fox Α1 (κλώνος Τ20, Santa Cruz). Το πρωτογενές αντίσωμα επωάζεται στην κατάλληλη συγκέντρωση (AR: 1:1000? PSA: 1:500? Fox A1: 1:1000) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το δευτερεύον αντίσωμα επωάστηκε για 60 λεπτά, χρησιμοποιώντας είτε χρένο-συζευγμένο με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-κουνελιού ή κατσίκας αντι-ποντικού (1:1000), αντίστοιχα. Διαφάνειες ξεπλύθηκαν εκτεταμένα με νερό της βρύσης, με αιματοξυλίνη Mayer και τοποθετούνται

Στατιστική και Ανάλυση Εικόνας

Ανάλογα με την περίπτωση, πειραματικές ομάδες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δύο δειγμάτων

t

. – δοκιμή, με τη σημασία που ορίζεται ως

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

η ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση αυξάνει την έκφραση των γονιδίων οστεοκλαστογένεσης που σχετίζονται με τα κύτταρα του προστάτη

ΙκΒα αναστέλλει ΝΡ-κΒ σηματοδότηση με σύνδεση προς ΝΡ-κΒ και την πρόληψη της πυρηνικής εντόπισης [38], [39]. Ως εκ τούτου, προς τα κάτω ρύθμιση των ΙκΒα οδηγεί σε συνεχή ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση [40], [41]. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του NF-κΒ σηματοδότηση στον προστάτη /ανάπτυξη και εξέλιξη του προστάτη, πραγματοποιήσαμε RNA μικροσυστοιχιών να συγκρίνουν άμεσα ιστούς του προστάτη από ΙκΒα νοκ άουτ (ΚΟ) ποντίκι [40], [41] (συμπεριλαμβανομένων ΙκΒα – /- και ΙκΒα +/- ποντίκια) με φυσιολογικούς ιστούς προστάτη ποντικού. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση μικροσυστοιχιών έδειξαν ότι η έκφραση πολλών οστεοκλαστογένεσης που σχετίζονται με γονίδια, όπως RANKL, PTHrP, GM-CSF και υΡΑ, αυξήθηκε κατά 2-φορές τόσο ΙκΒα – /- και ΙκΒα +/- προστάτη ιστών, σε σύγκριση με εκείνη του φυσιολογικό προστάτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω εάν ΝΡ-κΒ σηματοδότηση εμπλέκεται στη ρύθμιση της οστεοκλαστογένεσης που σχετίζονται με τα γονίδια σε κύτταρα PCa, έχουμε ενεργοποιημένο ΝΡ-κΒ σηματοδότηση σε κύτταρα LNCaP μολύνοντας με ΙΚΚ2-EE ρετροϊικού φορέα, στον οποίο ενεργοποιήθηκε δραστικότητα ΝΡ-κΒ με μία ουσιαστικά δραστική μεταλλάγματα του ΙΚΚ2 [32], [33]. Η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση επιβεβαιώθηκε με τη χρήση του ανταποκριτή NGL, ένα πλασμίδιο ανταποκριτής του ΝΡ-κΒ η οποία έχει ένα στοιχείο απόκρισης ΝΡ-κΒ συζευγμένο με ένα ρεπόρτερ GFP /λουσιφεράσης [35] (Εικ. 1Α). ανάλυση qRT-PCR έδειξε ότι RANKL και η έκφραση PTHrP έχουν αυξηθεί σημαντικά σε ΝΡ-κΒ ενεργοποιημένα κύτταρα LNCaP, σε σύγκριση με τα κενά κελιά φορέα ελέγχου (Εικ. 1Β και 1Γ). RANKL και PTHrP είναι γνωστά ως βασικοί παράγοντες της οστεοκλαστογένεσης στο οστό, και διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην μετάσταση στα οστά πολλών καρκίνων [15], [42] – [45]. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα από μας qRT-PCR υποδεικνύει ότι ΝΡ-κΒ σηματοδότηση εμπλέκεται στη ρύθμιση της RANKL και PTHrP, τα γονίδια που σχετίζονται με την οστεοκλαστογένεση σε κύτταρα PCa.

ΝΡ-κΒ σηματοδότηση ενεργοποιήθηκε σε κύτταρα LNCaP με μολύνοντας με ρετροϊικό φορέα ΙΚΚ2-EE (LNCaP-EE), ενώ τα κύτταρα LNCaP έχουν μολυνθεί με τον κενό φορέα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (LNCaP-EV). δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε LNCaP-EV και LNCaP κύτταρα-EE μετρήθηκαν με τη χρήση ενός ΝΡ-κΒ αποκρίνεται ρεπόρτερ NGL (Α). Η έκφραση του RANKL (Β) και PTHrP (C) μετρήθηκε με qRT-PCR. Οι τιμές απεικονίζονται αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τουλάχιστον τριών μεμονωμένων δειγμάτων ± SEM. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε από δύο δειγμάτων

t-test

. **

P

& lt?. 0.01

Η

κύτταρα του προστάτη ικανά να αναπτύσσονται στο μικροπεριβάλλον των οστών έχουν υψηλότερη δραστηριότητα NF-κΒ

Έχει αναφερθεί ότι C4- 2Β και PC3 προστάτη κύτταρα αναπτύσσονται καλά, αλλά τα κύτταρα LNCaP είναι δύσκολο να αναπτυχθούν σε οστών ποντικού μετά από intratibial /intrafemural ένεση [46]. Αυτό δείχνει ότι τα γεγονότα γονιδιακή έκφραση κυττάρου-ειδικό συμβάλλουν στην επιτυχή αποικισμό του οστού από τα κύτταρα του προστάτη. Για να καθοριστεί εάν δραστικότητα ΝΡ-κΒ αντανακλά PCa ανάπτυξη κυττάρων στο μυελό των οστών, ενδογενής δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε LNCaP, C4-2B και PC3 κύτταρα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον ανταποκριτή NGL [35]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ σε C4-2B και PC3 κύτταρα (τα οποία αναπτύσσονται καλά στο οστό) είναι σημαντικά υψηλότερο από εκείνο των κυττάρων LNCaP (Εικ. 2Α). Επιπλέον, qRT-PCR υποδεικνύει PTHrP (mRNA) έκφραση είναι σημαντικά υψηλότερη σε ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται LNCaP-EE, C4-2B και PC3 κύτταρα, σε σύγκριση με ότι σε κύτταρα LNCaP (Εικ. 2Β). δοκιμασίες ELISA και RIA δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση αυξημένη RANKL και ΡΤΗγΡ έκκριση (πρωτεΐνη) σημαντικά σε κύτταρα LNCaP-EE, σε σύγκριση με τα κενά κελιά φορέα ελέγχου (Σχ. 2C, D και Ε). Ωστόσο, η απενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση σε PC3 κύτταρα (PC3-KD) μολύνοντας τα με ΙΚΚ2-KD ρετροϊικού φορέα στην οποία η ενεργότητα του ΝΡ-κΒ αναστάλθηκε με μια νεκρή κινάση (KD) ΙΚΚ2 μεταλλαγμένο [32], [33] ( Το Σχ. 2C), οδήγησε σε μια σημαντική μείωση στα επίπεδα RANKL και PTHrP σε σύγκριση με τα κενά κελιά φορέα ελέγχου (PC3-EV) (Σχ. 2D και Ε). Ανάλυση Western blotting επιβεβαίωσε περαιτέρω ότι η έκφραση του RANKL και PTHrP αυξήθηκε σε ΝΡ-κΒ ενεργοποιημένα κύτταρα προστάτη (LNCaP-EE), ενώ, μειώθηκε το ΝΡ-κΒ αδρανοποιημένα κύτταρα προστάτη (PC3-KD), σε σύγκριση με τα κενά κελιά φορέα ελέγχου ( LNCaP-EV και PC3-EV) (Εικ. 2F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα του προστάτη που είναι ικανά να αναπτύσσονται στο μικροπεριβάλλον των οστών έχουν υψηλότερη δραστικότητα ΝΡ-κΒ και της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση up-ρυθμίζει την οστεοκλαστογένεση που σχετίζονται γονιδίων σε κύτταρα PCa, πιθανώς ενισχύοντας την ικανότητά τους να προσκολληθούν και να αναπτυχθούν στο οστό μικροπεριβάλλον.

(Α) κύτταρα προστάτη ικανά ανάπτυξης σε οστό μικροπεριβάλλον παρουσιάζουν αυξημένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ. δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε LNCaP, C4-2B και τα κύτταρα PC3 μετρήθηκαν με τη χρήση ενός ΝΡ-κΒ αποκρίνεται NGL ανταποκριτή. (Β) Έκφραση της PTHrP συσχετίζεται με την δραστικότητα του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση σε κύτταρα PCa. Έκφραση της PTHrP σε LNCaP, ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται LNCaP-EE, C4-2B και PC3 κύτταρα μετρήθηκε με qRT-PCR. (Γ) Παραγωγή NF-κΒ αδρανοποιηθεί κυτταρικές σειρές του προστάτη. ΝΡ-κΒ σηματοδότηση αδρανοποιήθηκε σε C4-2B και PC3 κύτταρα μολύνοντας με ΙΚΚ2-KD ρετροϊικού φορέα (C4-2B-KD και PC3-KD), ενώ τα κύτταρα του προστάτη που έχουν μολυνθεί με τον κενό φορέα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (C4-2B και PC3-EV). δραστικότητα ΝΡ-κΒ μετρήθηκε με τη χρήση ενός ΝΡ-κΒ αποκρίνεται NGL ανταποκριτή. (Δ και Ε) Έκφραση του RANKL (D) και PTHrP (Ε) πρωτεΐνες σε ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται LNCaP-EE και NF-κΒ αδρανοποιημένα κύτταρα PC3-KD μετρήθηκαν με δοκιμασίες ELISA και RIA, αντιστοίχως. Τα κύτταρα που έχουν μολυνθεί με κενό φορέα (LNCaP-EV και PC3-EV) χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. (F) Έκφραση του RANKL και PTHrP συσχετίζονται με τη δραστηριότητα του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση σε κύτταρα PCa. RANKL και έκφραση PTHrP αξιολογήθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western. Οι τιμές απεικονίζονται αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή τουλάχιστον τριών μεμονωμένων δειγμάτων ± SEM. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε από δύο δειγμάτων

t-test

. **

P

& lt?. 0.01

Η

Η ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση στα κύτταρα του προστάτη συμβάλλει στην οστεοκλαστογένεσης

Οι οστεοκλάστες είναι άκρως εξειδικευμένα πολυπύρηνα κύτταρα που είναι υπεύθυνα για τα οστά επαναρρόφηση, μια διαδικασία κρίσιμη για τη διατήρηση της δομής των οστών και της ομοιόστασης του ασβεστίου. Ωστόσο, η παθολογική ενεργοποίηση των οστεοκλαστών έχει σαν αποτέλεσμα την απώλεια οστού που συνδυάζεται με φλεγμονώδη αρθρίτιδα, η περιοδοντική νόσος, και μετάσταση του καρκίνου στα οστά. Οι οστεοκλάστες προέρχονται από μονοκύτταρα /μακροφάγα πρόγονοι γράμμωσης υπό την επίδραση της κυτοκίνης RANKL [47]. Για να καθοριστεί εάν η ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση PCa κύτταρα επιρροές οστεοκλαστογένεση στο μυελό των οστών, τα μονοκυττάρων /μακροφάγων προγόνους γενεαλογία από κύτταρα μυελού πρωτογενή οστών υποβλήθηκαν σε αγωγή με ρυθμισμένο μέσο από ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται /απενεργοποιημένα κύτταρα PCa, και παρακολουθήθηκαν για οστεοκλαστών διάκριση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ρυθμισμένο μέσο από ΝΡ-κΒ ενεργοποιημένα κύτταρα LNCaP (LNCaP-EE) που επάγεται TRAP-θετικού χαρακτηριστικού σχηματισμός πολυπυρηνικών κυττάρων των οστεοκλαστών, ενώ το ρυθμισμένο μέσο από κύτταρα LNCaP παρέλειψε να το πράξει (Σχ. 3Α και Πίνακας 1). C4-2B και κυττάρων ρυθμισμένα μέσα PC3 επάγει επίσης TRAP-θετικών σχηματισμό πολυπύρηνων κυττάρων (Σχ. 3Α και Πίνακας 1). Για να κατανοήσουμε τον τρόπο περαιτέρω ΝΡ-κΒ σηματοδότηση σε κύτταρα προστάτη επιρροές κυτταρικά συστατικά του microenviornment οστού, οστεοβλάστες από πρωτογενείς καλλιέργειες κυττάρων του μυελού των οστών ποντικού υπέστησαν αγωγή με ρυθμισμένο μέσο από ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται /απενεργοποιημένα κύτταρα PCa. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ρυθμισμένο μέσο που προέρχεται από ΝΡ-κΒ ενεργοποιημένα κύτταρα προστάτη δεν είχε σημαντική επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των οστεοβλαστών (Σχ. 3Β). Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση σε κύτταρα προστάτη συμβάλλει στην οστεοκλαστογένεση, αλλά όχι με τον πολλαπλασιασμό των οστεοβλαστών.

(Α) ρυθμισμένο μέσο από ΝΡ-κΒ ενεργοποιημένα κύτταρα προστάτη επάγει το σχηματισμό των κυττάρων δίκην-οστεοκλαστών

in vitro

. Bone μακροφάγα προερχόμενα από τον μυελό υποβλήθηκαν σε αγωγή με ρυθμισμένα μέσα από LNCaP, ΝΡ-κΒ ενεργοποιείται LNCaP-EE, C4-2B και τα κύτταρα PC3. χρώση TRAP πραγματοποιήθηκε μετά από 10 ημέρες επιπλέον καλλιέργειας με ρυθμισμένα μέσα. Τα βέλη υποδεικνύουν τις κυττάρων όμοιων με οστεοκλάστες. (Β) Η ενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση σε κύτταρα προστάτη δεν έχει σημαντική επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των οστεοβλαστών. Πρωτογενή καλλιεργημένα οστεοβλάστες υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ρυθμισμένα μέσα από το NF-κΒ ενεργοποιείται (LNCaP-EE, C4-2B-EV και PC3-EV) ή απενεργοποιείται (LNCaP-EV, C4-2B-KD και PC3-KD) κύτταρα του προστάτη. δοκιμασία πολλαπλασιασμού (δοκιμασία ΜΤΤ) πραγματοποιήθηκε στις 48 ώρες μετά τη θεραπεία.

Η

Ο ανταγωνισμός NF-κΒ σηματοδότηση αναστέλλει δημιουργία όγκων του προστάτη και της ανάπτυξης στο οστό

Για να προσδιοριστεί αν ανταγωνίζονται ΝΡ-κΒ σηματοδότηση αναστέλλει καρκινική εγκαθίδρυση PCa και ανάπτυξη στο μικροπεριβάλλον των οστών, δημιουργήσαμε ΝΡ-κΒ σηματοδότηση αδρανοποιημένο κυτταρικές σειρές προστάτη από σταθερώς μολύνοντας με ΙΚΚ2-KD φορείς (PC3-KD και C4-2B-KD) (Σχ. 2C ). Παρά το γεγονός ότι ο αποκλεισμός του ΝΡ-κΒ ελαφρώς παραλλαγμένη ρυθμούς πολλαπλασιασμού (Σχ. 4), όλα τα τροποποιημένα κύτταρα αναπτύχθηκαν καλά (επιβιώσουν)

in vitro

μετά προς τα κάτω ρύθμιση της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ. ΝΡ-κΒ αδρανοποιημένα PC3 και κυττάρων C4-2B (PC3-KD και C4-2B-KD) εμβολιάσθηκαν εντός του οστού των ποντικών με intratibial ένεση, και απεικόνισης ακτινογραφία μικρό ζώο ακτίνων Χ διεξήχθη για να παρακολουθεί την εμφάνιση αλλοιώσεων των οστών. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν για ιστολογική ανάλυση στις 3 εβδομάδες (για PC3-EV και τα κύτταρα PC3-KD εγχύθηκαν ποντικοί) και 10 εβδομάδες (για C4-2B-EV και τα κύτταρα C4-2B-KD εγχύθηκαν ποντικοί) μετά τον εμβολιασμό. Όλες οι όγκοι εμβολιασμένο με PC3-EV και τα κύτταρα C4-2B-EV (PC3 και C4-2B κύτταρα μολυσμένα με κενό φορέα, χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι) αναπτύχθηκε καλά στο οστό? ότι, NF-κΒ αδρανοποιημένο PC3-KD και την ανάπτυξη των κυττάρων C4-2B-KD δεν ανιχνεύθηκε (0/4 στα δύο ομάδα) με απεικόνιση ακτινογραφία ακτίνων-Χ ή ιστολογική ανάλυση (σχ. 5Α και 5Β). Ιστομορφομετρικές αναλύσεις έδειξαν ότι ο μέσος BV /TV είναι 5,3% για PC3-EV και 13,9% για όγκους C4-2B-EV. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η απενεργοποίηση του NF-κΒ σηματοδότηση αναστέλλει τόσο την οστεολυτική (PC3) και οστεοβλαστική /οστεοκλάστες μικτή (C4-2B) προστάτη όγκων ίδρυση και ανάπτυξη στο περιβάλλον οστό.

NF-κΒ ενεργοποιείται /αδρανοποιημένο κύτταρο του προστάτη γραμμές δημιουργήθηκαν με σταθερώς μολύνοντας με ΙΚΚ2-EE /ΙΚΚ2-KD φορείς. ΙΚΚ2-EV χρησιμοποιήθηκε ως φορέας ελέγχου. ρυθμός πολλαπλασιασμού προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ.

Η

ΝΡ-κΒ αδρανοποιημένο PC3-KD και τα κύτταρα C4-2B-KD μεταμοσχεύθηκαν στα οστά ποντικού με intratibial ένεση.