Abstract

Ο CCR6 χημειοκινικού υποδοχέα έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι συνδέεται με ορθοκολικό καρκίνο (CRC) εξέλιξης. Ωστόσο, η άμεση απόδειξη για το αν CCR6 σε όγκους είναι ένας προγνωστικός δείκτης για την επιβίωση των ασθενών με CRC και αν διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην μετάσταση CRC

in vivo

λείπει. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι τα επίπεδα της CCR6 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε κυτταρικές σειρές CRC και τα πρωτογενή κλινικά δείγματα CRC. CCR6 αυξορρύθμιση ήταν συσχετίζεται στενά με τα στάδια της νόσου και τον χρόνο επιβίωσης των ασθενών CRC. Εξόντωση CCR6 ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων CRC

in vitro

. Η υπερέκφραση του CCR6 στα κύτταρα CRC αυξημένο πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, και το σχηματισμό αποικιών τους

in vitro

και προώθησε τους μεταστατικό δυναμικό

in vivo

. CCR6 ενεργοποιημένη Akt της σηματοδότησης, ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια μετάσταση και μειωτικά γονίδια καταστολής μετάσταση. Επιλεκτική στόχευση των CCR6 σε όγκους ανέστειλε δραματικά την ανάπτυξη του CRC σε ποντικούς. Έτσι, η έκφραση του όγκου του CCR6 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην CRC μετάσταση, ρυθμίζεται προς τα πάνω CCR6 προβλέπει κακή επιβίωση σε ασθενείς CRC, και τη στόχευση της έκφρασης CCR6 σε όγκους μπορεί να είναι μια δυνητική θεραπευτική στρατηγική για CRC

Παράθεση:. Liu J, Ke F, Xu Z, Liu Ζ, Zhang L, Γιαν S, et al. (2014) CCR6 Είναι ένας προγνωστικός δείκτης για τη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, και υπερέκφραση Βελτιώνει την μετάσταση του

In Vivo

. PLoS ONE 9 (6): e101137. doi: 10.1371 /journal.pone.0101137

Επιμέλεια: Jun Li, η Sun Yat-sen University Medical School, Κίνα

Ελήφθη: 26 Ιανουαρίου του 2014? Αποδεκτές: 3 Ιούνη 2014? Δημοσιεύθηκε: 30 του Ιουνίου του 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας και 973 Πρόγραμμα (No: 91029730, αριθ: 81.202.304, αριθ: 2012CB917100, No: 2010CB529700 και No: 30972787), από το Πρόγραμμα για τον καθηγητή Ειδικής Διορισμός (Ανατολική Μελετητής) στη Σαγκάη ιδρύματα της τριτοβάθμιας εκπαίδευσης, με την Επιστήμη και την Τεχνολογία Επιτροπή του Δήμου Σαγκάης (αριθ: 09140902600), από την κορυφαία ακαδημαϊκά Πειθαρχία Έργο της Επιτροπής Δημοτικής Εκπαίδευσης της Σαγκάης (αριθ: J50208 και αριθ: J50207), από τη Σαγκάη Pujiang Πρόγραμμα (No: 10PJ407300 ), καθώς και από τη Σαγκάη Επιτροπή Επιστήμης και Τεχνολογίας (11DZ2260200). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια σημαντική ανησυχία για την υγεία σε όλο τον κόσμο. Παρά το γεγονός ότι σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί την τελευταία δεκαετία, οι προκλήσεις για τη θεραπεία CRC και των μεταστάσεων του παραμένουν τρομερή [1]. Επί του παρόντος, παρά τη χρήση συγκεκριμένων δραστικών φαρμάκων για τη θεραπεία του μεταστατικού CRC όλο και πιο δημοφιλής, ποσοστά θεραπείας είναι χαμηλά και οι υποκείμενες μοριακοί μηχανισμοί για τη μετάσταση οργάνου προσανατολισμένη του CRC δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

χημειοκίνες είναι 8 – σε πεπτίδια 12-kDa που λειτουργούν ως κυτοκίνες χημειοελκυστικό και ασκούν τις βιολογικές επιδράσεις τους με αλληλεπίδραση με G υποδοχέων χημειοκινών διαμεμβρανική πρωτεΐνη-συνδεδεμένη. Ένας αριθμός χημειοκινών και των αντίστοιχων υποδοχέων τους είναι γνωστό ότι παίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην διακίνηση λευκοκυττάρων και παλιννόστησης, ιδιαίτερα σε θέσεις φλεγμονής, βλάβης ιστού και κακοήθη κυτταρική μετανάστευση [2], [3]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ οι περισσότεροι υποδοχείς χημειοκινών δεσμεύονται με πολλαπλές χημειοκίνες, η CCR6 υποδοχέα χημειοκίνης έχει μόνο ένα συνδέτη χημειοκίνης, CCL20 (προηγουμένως γνωστή ως φλεγμονώδης πρωτεΐνη μακροφάγων-3α ή ΜΙΡ-3α) [4].

CCR6 εκφράζεται κυρίως σε λευκοκύτταρα, με έκφραση σε ώριμα λεμφοκύτταρα, ειδικά σε κύτταρα μνήμης [4], ανώριμα δενδριτικά κύτταρα (DCs) συγκεκριμένων σειρών [5] και μεταναστεύουν ρυθμιστικά Τ κύτταρα [6]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, CCR6 απουσιάζει από τα κοκκιοκύτταρα (εκτός ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα), μονοκύτταρα, ανώριμα λεμφοκύτταρα, και ώριμων DCs [7] – [9]. CCL20 δείχνει τόσο τη συστατική και επαγόμενη έκφραση, κυρίως σε βλεννογόνο λεμφοειδείς ιστούς και στο ήπαρ [10], και ο βασικός ρυθμός έκφραση αυξάνεται κάτω από φλεγμονώδεις παθήσεις [11]. Το βασικό επίπεδο έκφρασης CCL20 θεωρείται ότι ρυθμίζει τη μετανάστευση των CCR6 εκφράζουν ανώριμα DCs και λεμφοκύτταρα μνήμης από το αίμα για ομοιοστατική επιτήρηση. Η ρύθμιση προς τα πάνω του CCL20 κατά τη διάρκεια φλεγμονής μπορεί να ενισχύσει την μετανάστευση και των δύο αυτών τύπων κυττάρων εντός του ιστού [12] – [14]. Για ανθρώπινους καρκίνους, συσσωρευμένα δεδομένα υποδηλώνουν συσχέτιση μεταξύ του συστήματος υποδοχέα χημειοκίνης-χημοκίνης και του μεταστατικού δυναμικού των καρκινικών κυττάρων. Για παράδειγμα, κύτταρα όγκου από τουλάχιστον 23 διαφορετικά είδη ανθρώπινων καρκίνων των επιθηλιακών, μεσεγχυματικών και αιμοποιητικών προέλευση ρητή CXCR4 [15], [16]. CCR7 βρέθηκε επίσης σε μαστού, γαστρικό, και του οισοφάγου πλακώδους καρκίνου, και η έκφρασή του συσχετίζεται με κακή πρόγνωση [15], [17], [18]. Όλες αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η έκφραση των υποδοχέων χημειοκινών σε μετάσταση καρκίνου δεν είναι τυχαία.

Η CCR6 χημειοκινικού υποδοχέα είναι ιδιαίτερου ενδιαφέροντος στο ήπαρ μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Η μοναδική CCL20 χημειοκινικού συνδέτη του εκφράζεται κυρίως στο λεμφικό ιστό και στο ήπαρ [19]. Η ανώμαλη έκφραση του υποδοχέα χημειοκίνης CCR6 σε κύτταρα CRC φέρεται εμπλέκονται σε όργανο-επιλεκτική μετάσταση όγκου [20], [21]. Ωστόσο, η άμεση

in vivo

στοιχεία που να υποστηρίζουν ένα ρόλο για CCR6 στη μετάσταση του CRC είναι ανύπαρκτη. Στην παρούσα μελέτη διαπίστωσε ότι υπερέκφραση CCR6 στο μεταστατικό κυτταρικές σειρές CRC προέβλεψε κακή επιβίωση για τους ασθενείς CRC. Η υπερέκφραση του CCR6 ήταν αρκετή για να προωθήσει τη μετάσταση των κυττάρων CRC τόσο

in vitro

και

in vivo

. Επιλεκτικά αναστέλλοντας τη λειτουργία CCR6 ανέστειλε δραματικά την ανάπτυξη του CRC σε ποντικούς. CCR6 παρουσιάζει άμεσο ρόλο στην μετάσταση της ανθρώπινης CRC, ενδεχομένως με τη ρύθμιση των γονιδίων μετάσταση σχετίζονται.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από την Ηθική επιτροπές του Νοσοκομείου της Σαγκάης Jiao Tong University School of Medicine, Κίνα.

Όλα τα ποντίκια διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές-ελεύθερες παθογόνων (SPF) τους όρους σύμφωνα με τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση του Εργαστηρίου ζώα και με την έγκριση (SYXK-2003 με 0026) του Επιστημονικού συμβουλίου Διερεύνηση της Σαγκάης Jiao Tong University School of Medicine, Σαγκάη της Κίνας. Για τη βελτίωση κάθε ταλαιπωρίας των ποντικών που παρατηρήθηκε κατά τη διάρκεια αυτών των πειραματικών μελετών, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 εισπνοή.

Μια μικροσυστοιχία ιστού συμπεριλαμβανομένων 191 ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου και τα αντίστοιχα δείγματα παρα-όγκου αγοράστηκε από το Εθνικό Κέντρο Μηχανικής για βιοτσίπ στη Σαγκάη. Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση από τον δότη ελήφθη για τη χρήση των δειγμάτων τους για ερευνητικούς σκοπούς. Κανένας από τους ασθενείς έλαβαν χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από την χειρουργική εκτομή. Οι παρακείμενες μη-καρκινικές κολονικής ιστοί ελήφθησαν από το ελάχιστο των 2 cm μακριά από τον όγκο για να εξασφαλιστεί ότι οι ιστοί αυτοί ήταν απαλλαγμένα από τα καρκινικά κύτταρα. Δείγματα συνήθως σταθερό σε 10% φορμόλη στην άμεση μετεγχειρητική περίοδο και ενσωματωμένα σε παραφίνη μέσα σε 24 ώρες από την αφαίρεση.

Ποντίκια

C57BL /6J, Balb /c και B6.129P2-Ccr6tmlDgen /J (που ορίζεται ως CCR6

– /-). ποντίκια αγοράστηκαν από το Εργαστήριο Jackson (Bar Harbor, ΜΕ)

CRC κυτταρικές σειρές και Κυτταροκαλλιεργειών

Μια αθανατοποιημένα ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρο γραμμή, ΗΕΚ293Τ, καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (DMEM, Hyclone) με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Η κυτταρική σειρά ορθοκολικού ποντικού CMT93 διατηρήθηκε σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Μια άλλη κυτταρική σειρά ορθοκολικού ποντικού, CT26, διατηρήθηκε σε RPMI-1640 με 10% FBS. ΗΕΚ293Τ, CMT93, CT26 και επτά ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC, Caco-2, SW480, ΗΤ-29, HCT116, SW1116, SW620 και LoVo, ελήφθησαν όλα από την Τράπεζα Κυττάρων της Επιτροπής Type Culture Collection της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), όπου είχαν χαρακτηρίζεται από τη λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA, ανίχνευσης μυκόπλασμα, και τη ζωτικότητα των κυττάρων. κύτταρα Caco-2 αναπτύχθηκαν σε Ελάχιστο Ουσιώδες Μέσο Eagle (Gibco) με 20% FBS. ΗΤ-29 και HCT116 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 5a μέσο McCoy (Gibco) με 10% FBS. SW1116, SW480 και SW620 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Leibovitz του L-15 Medium (Gibco) με 10% FBS. LoVo αναπτύχθηκαν σε F-12K μέσο (Gibco) με 10% FBS. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα

2 και 95% αέρα, εκτός SW1116, SW480 και SW620, τα οποία αναπτύχθηκαν σε 100% αέρα στους 37 ° C 5% CO.

Ανοσοϊστοχημεία

για immunohischemistry, τομές ιστού (5

μm) κόπηκαν από τεμάχια ρουτίνα, de-παραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν, και υποβάλλεται σε θερμική επαγόμενη ανάκτηση επιτόπου (hier) μεθόδους πριν από την επώαση με τα κατάλληλα αντισώματα. Οι τομές εμβαπτίζονται σε 10

mM ρυθμιστικό κιτρικού νατρίου σε pH 6,0 και στη συνέχεια θερμαίνεται σε μια χύτρα ταχύτητας για 10

λεπτά. Μετά το ξέπλυμα με τρεχούμενο νερό και PBS, οι τομές επωάστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού /5% φυσιολογικό ορό κατσίκας TBST επί 0,5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινο αντίσωμα CCR6 (1:50 αραίωση? R &? D System, κλώνος: # 53103). Αυτή η αραίωση θεωρήθηκε βέλτιστη μετά την τιτλοδότηση αντισωμάτων χρησιμοποιώντας ανθρώπινης αμυγδαλής ως θετικός έλεγχος. Ένα άσχετο IgG ποντικού

αντίσωμα 2b χρησιμοποιήθηκε ως ισοτυπικός έλεγχος σε όλες τις περιπτώσεις για να αποδειχθεί ότι η χρώση ήταν ειδική για CCR6. Την επόμενη ημέρα, οι τομές επισημάνθηκαν με ένα κατάλληλο συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα, που αναπτύχθηκε με diaminobenzaminidine (DAB) και με αιματοξυλίνη.

Αξιολόγηση των Immunohischemistry χρώσης

Για την οπτική εκτίμηση, η αξιολόγηση της ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε ανεξάρτητα από δύο παθολόγους που αγνοούσαν κλινικών δεδομένων των ασθενών. Όπως εκτελούσε προηγουμένως από άλλους [18], δημιουργήσαμε μια ανοσοαντιδραστική βαθμολογίας πολλαπλασιάζοντας το σκορ για το ποσοστό των θετικών κυττάρων, και τη βαθμολογία για την χρώση ένταση. Το σκορ για το ποσοστό των θετικών κυττάρων όγκου βαθμολογήθηκε ως εξής: 0, κανένας? 1, 1-24%? 2, 25-49%? 3, 50-74%? και 4, 75-100%. Η ανοσοχρώση ένταση βαθμολογήθηκε ως εξής: 0, κανένας? 1, αδύναμη? 2, ενδιάμεσα? και 3, έντονη. Εμείς χωρίζεται όλα τα δείγματα (n = 191) σε δύο ομάδες (χαμηλή ή υψηλή έκφραση CCR6) σύμφωνα με το διάμεσο αρχή. Για να συγκριθεί η έκφραση απόκλιση CCR6 στους καρκινικούς ιστούς του κόλου και συμφωνημένα κανονική γειτονικούς ιστούς σε κάθε κλινικό στάδιο, η ποσοτικοποίηση της έντασης ανοσοκηλιδώσεως ειδικού CCR6 διεξήχθη χρησιμοποιώντας λογισμικό γέλη εικόνας (IPWIN60). Εν συντομία, η ανοσοχρώση CCR6 όλων καρκινικούς ιστούς του κόλου και συμφωνημένα παρακείμενες μη-καρκινικές κολονικής ιστούς στο τσιπ συστοιχίας ιστού φωτογραφήθηκαν με ένα μικροσκόπιο σε 100-πλάσια μεγέθυνση (Carl Zeiss). Το λογισμικό τζελ εικόνα (IPWIN60) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των τιμών OD σε εικόνες που συλλαμβάνονται. Η μέση τιμή OD του τρεις φωτογραφίες από κάθε πυρήνα στις διαφάνειες συστοιχία ιστού χρησιμοποιήθηκε, και η έκφραση διαφορικό CCR6 στον όγκο και συμφωνημένα κανονική παρακείμενους ιστούς σε κάθε κλινικό στάδιο συγκρίθηκαν.

Επούλωση Δοκιμασία Healing

HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr, SW1116

CCR6, SW480

shCtr, SW480

shCCR6, LoVo

shCtr και LoVo

κύτταρα shCCR6 χωριστά σπάρθηκαν σε έξι-φρεατίων, καλλιεργήθηκαν μέχρι σχεδόν το 80% συρροή, και χωρίς ορό για 24

ώρες. Τεχνητή τραύματα δημιουργήθηκαν με απόξεση των μονοστιβάδων με ένα αποστειρωμένο 10

μ

l άκρη, και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS αρκετές φορές για την απομάκρυνση επιπλέοντα κύτταρα. Εκπρόσωπος εικόνες των κυττάρων που μεταναστεύουν στις πληγές συνελήφθησαν μετά από 0 ώρα και 24 ώρες κάτω από ένα μικροσκόπιο (20 Χ).

Δοκιμασία Μετανάστευσης Transwell

Transwell επιμελητήρια, αποτελούμενοι από φίλτρο μεμβράνης με μέγεθος πόρων 8-μm ένθετα (Corning, USA) χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η ικανότητά κυτταρική μετανάστευση. FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοελκτικό. Εν συντομία, HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr, SW1116

CCR6, SW480

shCtr, SW480

shCCR6, LoVo

shCtr και LoVo

shCCR6 κύτταρα συλλέχθηκαν και επανα-αιωρούνται σε μέσα ελεύθερα ορού. Μια ποσότητα 3 × 10

4 κύτταρα προστέθηκε μέσα στον άνω θάλαμο και επωάστηκαν για 24

ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα που είχαν μεταναστεύσει μέσω της μεμβράνης στην κατώτερη επιφάνεια σταθεροποιήθηκαν με ψυχρή μεθανόλη για 10

min, χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες επί 30

λεπτά, πλύθηκαν, ξηράνθηκε στον αέρα, φωτογραφήθηκαν και αντιπροσώπευαν .

Colony Δοκιμασία σχηματισμού

HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr και SW1116

κύτταρα CCR6 χωριστά σε πλακίδια έξι φρεατίων σε πυκνότητα 600 κύτταρα /φρεάτιο. Τα μέσα αλλάχθηκαν δύο φορές την εβδομάδα, και μετά από 14 ημέρες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη για 10 λεπτά, χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες επί 15 λεπτά, ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS για να απομακρυνθεί η περίσσεια του χρώματος, φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν.

Ανάλυση Western Blot

Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western: ανθρώπινη CCR6 (# 14000000-1.969000000 εκατομμύρια, eBioscience ™ San Diego, USA), το ποντίκι CCR6 (# ab78429, Abcam), β-ακτίνης ( CP01, Calbiochem), Akt (pan) (C67E7) Κουνέλι mAb (# 4691, Cell Signaling Technology), φωσφο-Akt (Ser473) Κουνέλι mAb (# 4060, Cell Signaling Technology), φωσφο-Akt (Thr308) (C31E5E) Κουνέλι mAb (# 2965, Cell Signaling Technology), ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) (137F5) mAb κουνέλι (# 4695, Cell Signaling Technology), φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) ( 20G11) Κουνέλι mAb (# 4376, Cell Signaling Technology). FXYD5 (# AP14909c, Abgent), SYK (# 626201, Biolegend), uPAR (# sc-10815, Santa Cruz Biotechnology), Cdh1 (# 3195P, Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου), KISS-1 (# sc-18134, Santa Cruz Biotechnology ), και Timp2 (# 635401, Biolegend). Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως προηγουμένως δημοσιευθεί [22].

Κατασκευή Φορέα

Ο φορέας λεντοϊού pGC-FU-Luc δομήθηκε με εισαγωγή του γονιδίου λουσιφεράσης πυγολαμπίδας (Luc) καθοδικά του υποκινητή CMV στον φορέα πλασμιδίου pGC-FU που φέρει το γονίδιο αντίστασης στη νεομυκίνη. Η φορέα λεντοϊού μεταφοράς pLVX-IRES-ZsGreen1-CCR6 κατασκευάστηκε για να υπερεκφράζουν σταθερά CCR6 σε Luc-HCT116. Εν συντομία, το 1125-bp αλληλουχία κωδικοποίησης της ανθρώπινης CCR6 (NM_004367) ενισχύθηκε από το πρόπλασμα cDNA του ανθρώπινου PBMCs και υποκλωνοποιείται στις θέσεις ΧΗοΙ και BamHI του φορέα pLVX-IRES-ZsGreen1 (Clontech Laboratories, USA). Ο φορέας pLVXshRNA2 μεταφοράς βραδέος ιού (Clontech Laboratories, USA) χρησιμοποιήθηκε για να εκφράσει Τα siRNAs από τον υποκινητή U6. Εκτός από την έκφραση Τα siRNAs, pLVX-shRNA2 εκφράζει, επίσης, την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη ZsGreen1. Για το νοκ ντάουν της CCR6, τέσσερις αλληλουχίες στόχου σχεδιάστηκαν. Οι αλληλουχίες στόχοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: shCCR6-1, 5′-TCGACTCCAGTGAAGATTATT-3 ‘? shCCR6-2, 5’-GGTCTATGACAGACGTCTATC-3 ‘? shCCR6-3, 5’-TTTGTAGCTCTAGGGTATATA-3 ‘? shCCR6-4, 5’-GACCAGTGAGACCGCAGATAA-3 ‘. Κωδικοποιημένα ελέγχου, 5’-TGTTCGCATTATCCGAACCAT-3 ‘. Εν συντομία, τα συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια DNA που αποτελείτο από ένα 21 νουκλεοτιδίων αλληλουχία-ειδική ακολουθείται από την αλληλουχία βρόχο (CTCGAG) και τέλος το αντίστροφο συμπλήρωμα της αλληλουχίας στόχευσης συντέθηκαν, ανόπτηση, και εισάγεται στο φορέα pLVX-shRNA2 (Clontech) μεταξύ BamHI και θέσεις EcoRI καθοδικά του υποκινητή U6. Τέσσερις pLVX-shRNA2-CCR6 μεταφοράς πλασμιδίου ήταν παροδικές επιμόλυνση στο ΗΕΚ 293 Τ-κύτταρα με λιποφεκτίνης, RT-PCR υποβλήθηκαν σε διαλογή για την πλέον αποτελεσματική έκφραση CCR6 mRNA knockdown, ένας ShCCR6-1 πλασμίδιο που δείχνει σχεδόν 75% μείωση CCR6 mRNA στο SW480 κύτταρα pick up για τον ακόλουθο σταθερή CCR6 νοκ ντάουν CRC κατασκευή κυτταρικής σειράς.

Lentivirus παραγωγής και Μεταγωγή

λεντιϊοί παρήχθησαν και συγκομίζονται 72 ώρες μετά την επιμόλυνση των κυττάρων 293 Τ με φακοϊούς και τα πλασμίδια συσκευασία pMD2.G και psPAX2 χρησιμοποιώντας profection θηλαστικών Μορφομετατροπή System (Promega). Μετά από διήθηση διαμέσου ενός 0.45-μm χαμηλής δέσμευσης πρωτεΐνης-πολυσουλφονικό φίλτρου (Millipore), το υπερκείμενο συλλέχθηκε χωριστά και φυγοκεντρείται για 10 λεπτά στα 2000 χ g, 4 ° C πριν από την διήθηση διαμέσου ενός φίλτρου μεγέθους πόρου 0,45 μπι και πάλι. Η διερχόμενη ροή χρησιμοποιήθηκε απευθείας για την μεταγωγή ανθρωπίνων ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Για το πείραμα knockdown, έξι κλωνικές γραμμές εξετάστηκαν για έκφραση CCR6 με κηλίδωση Western. Σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές SW480 και LoVo δείχνει αποτελεσματικά μειώθηκε πρωτεΐνη CCR6 σαρώθηκαν και καθαρίστηκαν περαιτέρω με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογή για μεταγενέστερους πειράματα. Για το πείραμα υπερέκφραση, δύο σε μεταγωγή κυτταρικές σειρές HCT116 παρήχθησαν: HCT116 που υπερεκφράζουν ZsGreen1 (HCT116

CTR) και HCT116 που υπερεκφράζουν τα γονίδια δισιστρονική CCR6-ZsGreen1 (HCT116

CCR6). Η ZsGreen1

+ κύτταρα HCT116 ή ZsGreen1

+ CCR6

+ κύτταρα HCT116 καθαρίστηκαν περαιτέρω με ενεργοποιημένο φθορισμό διαλογή κυττάρων και επεκτάθηκε στο μέσο καλλιέργειας. Ομοίως, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr και SW1116

κύτταρα CCR6 επίσης δημιουργούνται. Επιπλέον, τρεις σε μεταγωγή κυτταρικές σειρές HCT116 παρήχθησαν για

in vivo πειράματα

: HCT116 που υπερεκφράζουν σταθερά το γονίδιο Luc (Luc-HCT116) με επιλογή G418, HCT116 με υπερεκφράζουν το γονίδιο Luc και το γονίδιο ZsGreen1 (Luc-HCT116

CTR) και HCT116 με υπερεκφράζουν το γονίδιο Luc και τα δισιστρονική γονίδια CCR6-ZsGreen1 (Luc-HCT116

CCR6). ZsGreen1

+ Luc-HCT116 κύτταρα ή ZsGreen1

+ CCR6

+ κύτταρα Luc-HCT116 καθαρίστηκαν περαιτέρω με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων διαλογή και επεκτάθηκε στο μέσο καλλιέργειας.

Ανθρώπινο μετάσταση όγκου PCR Array

HCT116

Ctr ή HCT116

CCR6 κύτταρα λύθηκαν άμεσα σε αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ, και το συνολικό RNA εκχυλίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen, Carlsbad, CA). Στη συνέχεια, το σύστημα σύνθεσης Super Script III (Invitrogen) χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε σε κάθε δείγμα με τη χρήση του Ανθρώπου μετάσταση όγκου RT

2 Profiler PCR Array (Super Array Bioscience, ΗΠΑ) σε ένα γρήγορο σύστημα πραγματικού χρόνου PCR ΑΒΙ 7900HT (Applied Biosystems, USA). Ανθρώπινη β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για ομαλοποίηση με τη μέθοδο ΔΔCt.

Πειραματική

in vivo

μετάσταση στο ήπαρ Μοντέλο

Η ηπατική μεταστατική ικανότητα καθορίστηκε με έγχυση 1 × 10

6 κύτταρα ανά ποντικό εντός του σπλήνα του BALB /c γυμνά ποντίκια. Εν συντομία, BALB /c γυμνά ποντίκια αναισθητοποιήθηκαν με i.p. ένεση Pelltobarbitalum Natricum, και 1 × 10

6 HCT116 κύτταρα του όγκου

Ctr ή HCT116

CCR6 σε 25 μί ενέθηκαν στο εξωτερικευμένης σπλήνα με σύριγγα ινσουλίνης (BD εταιρείας) μετά από κοιλιακή τομή. Πέντε λεπτά μετά την ένεση των κυττάρων, τα αιμοφόρα αγγεία σπλήνα απολινώθηκαν και η σπλήνα απομακρύνθηκε. Τέλος, η κοιλιακή πληγή κλείστηκε με συνδετήρες. Μετά από 5 εβδομάδες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα ήπατα αφαιρέθηκαν στη συνέχεια και φωτογραφήθηκαν.

Πειραματικό

in vivo

μετάσταση στους πνεύμονες Μοντέλο

Επτά 7-εβδομάδων αρσενικούς BALB /c άτριχων ποντικών σε κάθε ομάδα έγινε ένεση με Luc-HCT116

Ctr ή Luc-HCT116

CCR6 κύτταρα. Εν συντομία, 5 χ 10

6 κύτταρα αιωρούνται σε 200 μΐ PBS εγχύθηκαν στην ουραία φλέβα κάθε BALB /c γυμνό ποντίκι. Μετά από 6 εβδομάδες, τα ζώα θανατώθηκαν και εξετάστηκαν μακροσκοπικά και μικροσκοπικά για την παρουσία μεταστάσεων. Για ολόκληρο το σώμα απεικόνισης μικρών ζώων, οι ποντικοί έλαβαν 150 μg /g του D-λουσιφερίνης υπόστρωμα σε στείρο PBS με ενδοπεριτοναϊκή ένεση και στη συνέχεια αναισθητοποιούνται με ισοφλουράνιο. εικόνες βιοφωτισμός συνελήφθησαν με μία συσκευή συζευγμένου φορτίου (Xenogen IVIS 200 Σύστημα, Xenogen Inc., Hopkinton, MA, USA) μέσα σε 15 λεπτά μετά την ένεση του υποστρώματος.

συγγενές μόσχευμα CRC μοντέλο και αντι-CCR6 Θεραπεία

CMT93 κύτταρα σε 100 μΙ PBS εγχύθηκαν υποδορίως (sc) σε 6-εβδομάδων αρσενικών CCR6

– /- ποντίκια (1 × 10

6 κύτταρα /ποντικό), ή CT26 κύτταρα σε 100 μλ PBS ενέθηκαν sc σε 7 εβδομάδων ποντικούς αρσενικούς BALB /c (1 χ 10

6 κύτταρα /ποντικό). Δέκα ημέρες μετά τον εμβολιασμό των καρκινικών κυττάρων, όταν τα καρκινικά κύτταρα που σχηματίζονται ιστούς στερεού όγκου, μπολιασμένα CCR6

– /- ποντίκια ή ποντίκια BALB /c διαιρέθηκαν τυχαία σε δύο ομάδες για θεραπεία με έλεγχο IgG ή αντι-CCR6. Είκοσι μικρογραμμάρια του IgG

2Α (R &? D System, κλώνος # 54447) διαλύθηκε σε 100 μΐ PBS ή 20 μg CCR6 (R &? D System, κλώνος # 140706) διαλύθηκαν σε 100 μΐ PBS εγχύονται ξεχωριστά εντός των θέσεων των όγκων κάθε δεύτερη ημέρα για 18 ημέρες. Μετά από 28 ημέρες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν, και τα ξενομοσχεύματα αφαιρέθηκαν, φωτογραφήθηκαν και ζυγίστηκαν. Για ανάλυση στυπώματος Western, πολυκλωνικά αντι-ποντικού CCR6 (# ab78429, Abcam) χρησιμοποιήθηκε ως το πρωτογενές αντίσωμα.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με GraphPad Prism 5.01 του λογισμικού. Στατιστικές δοκιμές για την ανάλυση των δεδομένων που περιλαμβάνονται στη δοκιμασία log-rank, ακριβές τεστ του Fisher, το Chi-square test, το τεστ Wilcoxon και το τεστ U-Mann Whitney. Η πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο παλινδρόμησης Cox. Τα ποσοτικά δεδομένα παρουσιάστηκαν ως οι μέσες τιμές ± τυπικές αποκλίσεις (SD). Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε τιμές *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01 και ***

σ

& lt? 0.001.

Αποτελέσματα

η αναβάθμιση του CCR6 συσχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου

Για να διερευνηθεί η κλινική σημασία των απορυθμίζεται CCR6 στην CRC, συλλέξαμε 191 δείγματα ιστού σε παραφίνη ενσωματωμένο πρωτογενή CRC (Πίνακας S1), και η έκφραση CCR6 επίπεδα εξετάστηκαν σε όλα αυτά τα δείγματα χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Η συσχέτιση της έκφρασης CCR6 με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και την επιβίωση των ασθενών CRC συνοψίστηκαν (Πίνακας S2). Οι στατιστικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι η έκφραση CCR6 συσχετίστηκε σημαντικά με το κλινικό στάδιο (

σ

= 0.0117), Ν ταξινόμηση (

σ

= 0,0309), Μ ταξινόμηση (

p =

0,0334) και ζωτικής σημασίας κατάστασης (

σ

= 0,0019) σε ασθενείς με CRC (Πίνακας S2). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκφραση CCR6 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε όλες τις προσδιορίστηκαν κλινικά δείγματα CRC αλλά ήταν ανιχνεύσιμο μόνο σε χαμηλά επίπεδα στους ιστούς paratumor (Σχήμα 1Α), και μονοπαραγοντική ανάλυση αποκάλυψε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ CCR6 ένταση χρώσης και τα στάδια του όγκου (n = 14,

σ

= 0,0039? n = 104,

σ

& lt? 0,0001? n = 57,

σ

& lt? 0,0001? n = 16,

p

= 0.0005) (Σχήμα 1Β). Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι CCR6 ρύθμιση προς τα άνω συνδέεται στενά με την κλινική εξέλιξη της ανθρώπινης CRC.

(Α) Ανοσοϊστοχημική χρώση των CCR6 στην πρωτοβάθμια CRC που προέρχονται από 191 ασθενείς CRC με κλινικό στάδιο I-IV. (Β) ανάλυση ψηφιακή εικόνα διεξήχθη για να μετρήσει χρώση ένταση του κλάσματος περιοχής CCR6 (CCR6-AF) τιμές των ζευγών δειγμάτων παρα-όγκου /όγκου σε κάθε κλινικό στάδιο, τεστ Wilcoxon.

Η

απορυθμίζεται CCR6 Δηλώνει κακή πρόγνωση για CRC ασθενείς

Είναι σημαντικό, αποδείξαμε ότι η έκφραση CCR6 ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το χρόνο επιβίωσης (

σ

& lt? 0.001) (Εικόνα 2Α). Επιπλέον, η έκφραση CCR6 συσχετίστηκε με τη συνολική επιβίωση για την υποομάδα των ασθενών σε διαφορετικά κλινικά στάδια, σημαντικά στο στάδιο IV (

σ

& lt? 0,05) (Σχήμα 2Β-Ε). Επιπλέον, μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση αποκάλυψε ότι το Μ ταξινόμηση και την έκφραση CCR6 καθένα αναγνωριστεί ως ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για CRC (Πίνακας S3). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι CCR6 έχει δυνατότητες κλινική αξία ως προγνωστική βιοδείκτη για έκβαση της νόσου σε ασθενείς CRC.

(Α) Kaplan-Meier καμπύλες των ασθενών CRC με χαμηλό έναντι υψηλή έκφραση CCR6 (n = 191,

σ

& lt? 0,001, δοκιμασία log-rank). (Β) κατά Kaplan-Meier καμπύλες των ασθενών CRC με χαμηλό έναντι υψηλή έκφραση του CCR6 σε κλινικό στάδιο Ι (n = 14,

σ

= 0,0679, δοκιμασία log-rank). καμπύλες (C) Kaplan-Meier των ασθενών CRC με χαμηλό έναντι υψηλή έκφραση του CCR6 στο κλινικό στάδιο ΙΙ (n = 104,

σ

= 0,0738, δοκιμασία log-rank). (D) Kaplan-Meier καμπύλες των ασθενών CRC με χαμηλό έναντι υψηλή έκφραση του CCR6 σε κλινικό στάδιο ΙΙΙ (n = 57,

σ

= 0,1749, δοκιμασία log-rank). καμπύλες (Ε) Kaplan-Meier των ασθενών CRC με χαμηλό έναντι υψηλή έκφραση του CCR6 σε κλινικό στάδιο IV (n = 16,

σ

= 0,0429, δοκιμασία log-rank).

Η

Νοκ ντάουν του CCR6 αναστέλλει την μετανάστευση των CRC Cells

in vitro

η

η παρατηρούμενη υπερέκφραση CCR6 είχε μια ισχυρή σχέση με την εξέλιξη της CRC, που μας ώθησε να διερευνήσει τις επιπτώσεις της CCR6 για CRC ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης . Δύο κυτταρικές σειρές CRC, SW480 και LoVo, η οποία εξέφρασε την υψηλότερη έκφραση CCR6 ορθοκολικού κυτταρικών σειρών αναλύσαμε, χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργήσουν sublines με CCR6 σταθερά χτύπησε κάτω από shRNA (Σχήμα 3Α, Β). Εντυπωσιακά, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η knockdown του CCR6 προκάλεσε σημαντική καταστολή της μετανάστευσης κυττάρων σε κυτταρικές σειρές τόσο SW480 και LoVo σε μία δοκιμασία για επούλωση της πληγής (

ρ

& lt? 0,05, Εικόνα 3C). Χρησιμοποιήσαμε επίσης μια άλλη κλασσική δοκιμασία transwell να εκτιμηθεί η συμβολή του CCR6 στην κυτταρική μετανάστευση. Δείξαμε ότι η κατάλυση της CCR6 μείωσε σημαντικά τη μετανάστευση των δύο κυτταρικές σειρές SW480 και LoVo (

σ

& lt? 0.01, Σχήμα 3D). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η ειδική knockdown του CCR6 σε κυτταρικές γραμμές CRC μπορούν να μειώσουν σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων

in vitro.

Η

(Α) Κηλίδωση Western ανάλυση των επιπέδων CCR6 σε 7 καλλιεργημένο κύτταρο CRC γραμμές. Οι τιμές εκφράστηκαν ως φορές αλλαγές σε σχέση με Caco-2, και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνης. (Β) Κηλίδωση Western ανάλυση knockdown του CCR6 σε κύτταρα SW480 και LoVo, β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι τιμές εκφράστηκαν ως μεταβολές φορές σε σχέση με τους μάρτυρες (ShCtr), και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνης. (C) επούλωση της πληγής δοκιμασίες για την κινητικότητα των CCR6-σιγήσει SW480 και LoVo κύτταρα και κύτταρα ελέγχου. Αντιπροσωπευτικά εικόνες του ενός πεδίου κατά την έναρξη (t = 0 h) (άνω πάνελ) και στο τέλος της εγγραφής (t = 24 hr) (κάτω πίνακας) σε κάθε κατάσταση που δείχνεται. Η σχετική μετανάστευση των κυττάρων σε ShCtr και shCCR6 ομάδες φαίνονται στο δεξί πλαίσιο. (Δ) Εκπρόσωπος εικόνες της επικοινωνούντα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στην CCR6-σιγήσει SW480 και LoVo κυττάρων (κάτω πίνακας) ή κύτταρα ελέγχου κύτταρα (άνω πάνελ). Οι αριθμοί των μετανάστευσαν κυττάρων σε ShCtr και shCCR6 ομάδες φαίνονται στο δεξί πλαίσιο. Τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή από φρεάτια εις τριπλούν, ± Τ.Α. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, τεστ Wilcoxon. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

CCR6 Προωθεί την επιθετικότητα του CRC Cells

in vitro

Η

Για να διερευνήσουν κατά πόσον η έκτοπη υπερέκφραση CCR6 θα μπορούσε να ενισχύσει η επιθετικότητα των κυττάρων CRC, HCT116, Caco-2 και κυτταρικές SW1116 γραμμές που εκφράζουν σταθερά έκτοπη CCR6 καθορίστηκαν (Σχήμα 4Α). Εντυπωσιακά, τα δύο τραυμάτων δοκιμασίες θάλαμος επούλωση και τη μετανάστευση αποκάλυψε ότι η υπερέκφραση CCR6 η έντονα ενισχυμένη κυτταρική μετανάστευση σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου (

ρ

& lt? 0,05 ή

ρ

& lt? 0,01) (Σχήμα 4Β, C) . Επιπλέον, κατά τη διαδικασία της δημιουργίας σταθερών κυτταρικών σειρών CCR6, παρατηρήσαμε ότι υπήρχε περισσότερο σχηματισμό αποικίας σε κύτταρα CCR6-επιμολυσμένα κύτταρα ελέγχου από επιμολυσμένα. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις σχηματισμού αποικίας χρησιμοποιώντας το σταθερά επιμολυσμένα HCT116

CCR6, HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr και SW1116

CCR6 κύτταρα . Και πάλι, θα σημειωθεί ότι σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (CTR), το μέγεθος και τον αριθμό των αποικιών που σχηματίστηκαν σε CCR6 υπερεκφράζουν HCT116, Caco-2 και τα κύτταρα SW1116 αυξήθηκαν σημαντικά (

ρ

& lt? 0,05) (Σχήμα 4D) . Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας αποδεικνύουν ότι η αυξημένη έκφραση του CCR6 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επιθετική φαινότυπο των κυττάρων CRC

in vitro

.

(Α) Κηλίδωση Western ανάλυση της έκτοπη έκφραση της CCR6 σε HCT116

Ctr και HCT116

CCR6 κύτταρα ή Caco-2

Ctr και Caco-2

CCR6 ή SW1116

Ctr και SW1116

CCR6 κύτταρα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι τιμές εκφράστηκαν ως μεταβολές φορές σε σχέση με τους μάρτυρες (CTR), και ομαλοποιήθηκε ως προς β-ακτίνης. (Β) επούλωση της πληγής δοκιμασία για την κινητικότητα των HCT116

Ctr και HCT116

CCR6 ή Caco-2

Ctr και Caco-2

CCR6 ή SW1116

Ctr και SW1116

CCR6 κύτταρα . Αντιπροσωπευτικά εικόνες του ενός πεδίου κατά την έναρξη (t = 0) (άνω πάνελ) και στο τέλος της εγγραφής (t = 24 h) (κάτω πίνακας) σε κάθε κατάσταση που δείχνεται. Η σχετική μετανάστευση των κυττάρων σε CCR6 και ελέγχου ομάδες φαίνονται στο δεξί πλαίσιο. (C) Εκπρόσωπος εικόνες της επικοινωνούντα μετανάστευσαν κυττάρων σε σταθερά επιμολυσμένα HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, SW1116

CTR (άνω τμήμα) ή HCT116

CCR6, Caco-2

CCR6, SW1116

CCR6 κύτταρα (κάτω πίνακας). Μέσος αριθμός μετανάστευσαν κυττάρων HCT116

Οι Ctr και HCT116

CCR6 ή Caco-2

Ctr και Caco-2

CCR6 ή SW1116

Ctr και SW1116

CCR6 κύτταρα φαίνονται στο δεξιό πίνακα. (Δ) Εκπρόσωπος εικόνα του σχηματισμού αποικιών σε HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, SW1116

CTR (άνω τμήμα) ή HCT116

CCR6, Caco-2

CCR6, SW1116

κύτταρα CCR6 (κάτω πίνακας). Τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή από φρεάτια εις τριπλούν, ± Τ.Α. *

σ

& lt? 0,05, **

σ

& lt? 0,01, τεστ Wilcoxon. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Η υπερέκφραση του CCR6 Διευκολύνει Μετάσταση της CRC Cells

in vivo

Η

Το ήπαρ είναι η πιο κοινή ιστοσελίδα του παχέος εντέρου μετάσταση καρκίνου. Για να καθοριστεί εάν CCR6 παίζει ειδικά σημαντικό ρόλο στο ήπαρ μετάσταση του CRC, καθιερώσαμε ένα πειραματικό

in vivo

μοντέλο μετάστασης ήπατος με ένεση ανθρώπινα κύτταρα όγκου σε σπλήνες των BALB /c γυμνά ποντίκια και ακολούθησαν την ικανότητά τους να εισβάλλουν μέσω της πυλαίας φλέβας στο ήπαρ για να σχηματίσουν μεταστάσεις. Για να ορίσετε τη σχέση μεταξύ CCR6 και CRC μετάσταση στο ήπαρ

in vivo

, έξι 7 εβδομάδων αρσενικούς BALB /c γυμνά ποντίκια σε κάθε ομάδα έγινε ένεση με HCT116

Ctr ή HCT116

CCR6 κύτταρα σε η σπλήνα πριν από σπληνεκτομή. Μετά από 5 εβδομάδες, οι ποντικοί θανατώθηκαν, και εξετάστηκαν οι μεταστατικά οζίδια όγκων που σχηματίζονται στο ήπαρ. Εντυπωσιακά, μεταστατικά οζίδια όγκων πιο συχνά βρέθηκαν στο συκώτι του HCT116

ομάδα CCR6 από το HCT116

ομάδα Ctr (Σχήμα 5Α, που υποδεικνύεται από λευκά βέλη). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση CCR6 σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να ενισχύσει ηπατικές μεταστάσεις του CRC. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε την ολόσωμη σύστημα απεικόνισης φθορισμού μικρού ζώου (IVIS) για την παρακολούθηση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων

in vivo

. Πρώτον, κατασκευάσαμε το εκφράζουν σταθερά λουσιφεράση κυτταρική γραμμή, λουσιφεράση-HCT116 με επιμόλυνση κυττάρων HCT116 με τον φακοϊό λουσιφεράση, και επιλέγονται αυτά τα κύτταρα με G418.