Αφηρημένο

Ιστορικό

Η χρόνια φλεγμονή παίζει έναν αιτιώδη ρόλο στην έναρξη όγκου του στομάχου. Ο προσδιορισμός της πρόβλεψης βιοδεικτών από γαστρική φλεγμονή σε ογκογένεση θα μας βοηθήσει να διακρίνουμε γαστρικού καρκίνου από ατροφική γαστρίτιδα και τη διάγνωση του πρώιμου σταδίου καρκίνο του στομάχου. Φωσφολιπάση C έψιλον 1 (PLCε1) έχει αναφερθεί ότι διαδραματίζουν ζωτικό ρόλο στη φλεγμονή και την καρκινογένεση. Στόχος της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η κλινική σημασία της PLCε1 στην έναρξη και εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Κατ ‘αρχάς, η έκφραση mRNA και πρωτεΐνης PLCε1 αναλύθηκαν με αντίστροφη μεταγραφή -PCR και κηλίδωση Western σε φυσιολογικά γαστρικού βλεννογόνους επιθηλιακή κυτταρική γραμμή γαστρικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές GES-1 και AGS, SGC7901, και MGC803. Τα αποτελέσματα έδειξαν τόσο mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης του PLCε1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με την κανονική γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα βλεννογόνους. Δεύτερον, αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε με ανοσοϊστοχημική ανίχνευση σε μικροσυστοιχία ιστού συμπεριλαμβανομένων 74 ζεύγη γαστρικού καρκίνου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Τρίτον, η ανεξαρτησία ανοσοϊστοχημική ανάλυση 799 χρόνια δειγμάτων ατροφική γαστρίτιδα ιστών έδειξε ότι η έκφραση PLCε1 στην ατροφική γαστρίτιδα ιστούς ήταν κάτω-ρυθμίζονται από την έκφραση PLCε1 ήταν αρνητική σε 524 (65,6%) ατροφική γαστρίτιδα. Επιπλέον, σε συνδυασμό κλινικών ιστούς από ατροφική γαστρίτιδα σοβαρή και ασθενείς με γαστρικό καρκίνο χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσουν περαιτέρω τα προηγούμενα αποτελέσματα αναλύοντας mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης έκφρασης PLCε1 σε κλινικά δείγματα.

Συμπεράσματα /Έννοιες

Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι PLCε1 πρωτεΐνη μπορεί να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για τη διάκριση καρκίνου του στομάχου από φλεγμονή βλάβη, και θα μπορούσε να έχει μεγάλες δυνατότητες σε εφαρμογές όπως η διάγνωση και η προ-προειδοποίηση του πρώιμου σταδίου καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Chen J , Wang W, Zhang Τ, Ji J, Qian Q, Lu L, et al. (2012) διαφορική έκφραση της φωσφολιπάσης C Epsilon 1 σχετίζεται με χρόνια ατροφική γαστρίτιδα και γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 7 (10): e47563. doi: 10.1371 /journal.pone.0047563

Επιμέλεια: Javier Σ Castresana, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα, Ισπανία

Ελήφθη: 22 του Ιουνίου του 2012? Αποδεκτές: 18η Σεπτεμβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 15 Οκτωβρίου 2012

Copyright: © Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Key πρόγραμμα βασικής έρευνας της Κίνας (973 Έργων) (2010CB933900), New Century Εξαιρετικό ταλέντο του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (NCET-08-0350), Ειδικές Μολυσματικές ασθένειες βασικό έργο της Κίνας (2009ZX10004-311), Εθνική φυσικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (31170961 και 31100717), Σαγκάη Επιστήμης και Τεχνολογίας Ταμείο (12ZR1415800) και Shanghai Jiao Tong University Ταμείο Καινοτομίας για μεταπτυχιακούς φοιτητές (Ζ-340-007). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικός καρκίνος είναι η τέταρτη κοινή όγκους στον κόσμο. Η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του στομάχου αυξάνεται σταθερά λόγω των πρόσφατων αλλαγών του τρόπου ζωής και διατροφής συνήθειες στην Κίνα [1]. Όσο για γαστρικό καρκίνο, τα ποσοστά επιβίωσης εξαρτώνται από την έγκαιρη διάγνωση της ασθένειας. Τυπικά, το προγενέστερο ένας καρκίνος ανιχνεύεται και διαγιγνώσκεται, τόσο πιο επιτυχής η θεραπεία θα είναι. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό να βελτιωθούν οι ρυθμοί έγκαιρη διάγνωση και έγκαιρη θεραπεία για τον καρκίνο του στομάχου. Έχουμε προσπαθήσει να καθιερώσει ένα σύστημα προ-έγκαιρης προειδοποίησης γαστρικού καρκίνου βασίζονται στη γονιδιακή ανάλυση μικροσυστοιχιών έκφρασης από το 2005 [2]. Εν τω μεταξύ, έχουμε επίσης την ελπίδα να βρουν τις αρχές του γαστρικού καρκίνου κύτταρα

in vivo από

multi-mode στοχευμένες τεχνικές απεικόνισης [3] – [7]. Ωστόσο, στερείται των βιοδεικτών για καρκίνο του στομάχου εξακολουθεί να είναι το μεγαλύτερο εμπόδιο για την έγκαιρη διάγνωση.

Σήμερα, είναι ευρέως αποδεκτό ότι

Helicobacter pylori

(

Η. Pylori

) παίζει αιτιώδης ρόλο στην εκδήλωση της χρόνιας φλεγμονής (γαστρίτιδα) που οδηγεί σε κακοήθεια, και έχει ταξινομηθεί ως τελικό καρκινογόνο για τον άνθρωπο από τον Διεθνή Οργανισμό Ερευνών για τον Καρκίνο (IARC) [8] – [10]. Επιπλέον, με βάση τις ιστολογικές διαφορές μεταξύ της χρόνιας γαστρίτιδας και γαστρικού καρκίνου, πρώιμου σταδίου καρκίνο του στομάχου είναι συχνά ανιχνεύεται με ενδοσκόπηση. Έτσι, διερεύνηση των μοριακών και βιολογικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της γονιδιακής ενίσχυσης και ενεργοποιήσεις, οι οποίες εμφανίζονται από χρόνια γαστρίτιδα σε γαστρικό καρκίνο, μπορεί να παρέχει κάποια νέα γνώσεις σχετικά με την παθολογία της νόσου αυτής και των νέων προγνωστικοί δείκτες. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, υπάρχουν λίγες αναφορές για την αντιμετώπιση των ειδικών βιοδεικτών που μπορεί να διακρίνει γαστρική φλεγμονή από γαστρική καρκινογένεση.

Η εξειδικευμένη φωσφολιπάση C (PLC) αντιπροσωπεύει μια μεγάλη οικογένεια, που καταλύει την υδρόλυση της φωσφατιδυλινοσιτόλης 4, 5-διφωσφορικής σε δύο ζωτικής σημασίας δεύτερους αγγελιοφόρους, διακυλογλυκερόλη και ινοσιτόλη 1,4,5-τριφωσφορικής ινοσιτόλης, οι οποίες περιλαμβάνουν έξι οικογένειες των ισομορφών των θηλαστικών PLC (β, γ, δ, ε, ζ και η) [11] – [13]. Μεταξύ αυτών, PLCε είναι ένα πρόσφατα ταυτοποιημένο μέλος της οικογένειας PLC [12]. Είναι ένας βασικός κατάντη τελεστή της οικογένειας Ras μικρά GTPases: Ras, Rap1 και Rap2 [12], [14], [15]

Πρόσφατα, πολλά έργα ανέφερε ότι PLCε1 έπαιξε κρίσιμο ρόλο στην ογκογένεση και. φλεγμονή. έκφραση PLCε1 έχει βρεθεί ότι συσχετίζεται με καρκίνο του ανθρώπου της ουροδόχου κύστης, και το knockdown του PLCε1

in vitro

και

in vivo

ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου της ουροδόχου κύστης [16], [17]. Περαιτέρω, έχει αναφερθεί ότι PLCε1 υπερεκφράζεται στον καρκίνο του δέρματος [18]. Σε PLCε

– /- ποντίκια, εμφάνισε σημαντική αντίσταση στο σχηματισμό όγκων και στην 12-Ο-δεκατετρανοϋλοφορβόλης-13-οξικό (ΤΡΑ) φλεγμονή του δέρματος -induce [18], [19]. Μεταγενέστερες μελέτες έδειξαν ότι PLCε έπαιξε κρίσιμο ρόλο στην αυθόρμητη εντερική ογκογένεση με αύξηση της αγγειογένεσης και φλεγμονής με τη χρήση του coli αδενωματώδη πολυποδίαση (APC)

Min /+ μοντέλο ποντικού [20].

Επιπλέον, PLCε απαιτήθηκε στην ενεργοποίηση της παραγωγής κυτοκινών σε μη άνοσο κύτταρα του δέρματος σε μία ποικιλία φλεγμονωδών αντιδράσεων, και αυτή τη σημαντική λειτουργία της PLCε επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν PLCε [21], [22]. Από την άλλη πλευρά, PLCε απαιτήθηκε για τον παράγοντα νέκρωσης όγκου συνδετήρα 2 (CCL2) έκφραση (TNFa) επαγόμενη χημειοκίνης (C-C μοτίβο) σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα και συνεργάζεται με πυρηνικό παράγοντα κάπα Β (ΝΡ-κΒ) οδού [23]. Μια τέτοια λειτουργία της PLCε στη φλεγμονή είναι μοναδική μεταξύ των ισοενζύμων PLC [13].

Πρόσφατα, δύο πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP) rs2274223 και rs11187870 σε PLCε1 τόποι έχουν χαρακτηριστεί ως νέα θέση ευαισθησίας για καρκίνο του στομάχου σε κινέζικα του πληθυσμού με ανάλυση του γονιδιώματος σε επίπεδο γονιδίου-σύνδεσης (GWAS) [24] – [26]. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν τη συσχέτιση μεταξύ PLCε1 και κίνδυνο γαστρικών καρκίνων.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την μορφή έκφρασης του PLCε1 σε ανθρώπινο γαστρικό ιστούς, συμπεριλαμβανομένων των κανονικών, ατροφική γαστρίτιδα, και ιστούς όγκων, και έκανε μια υπόθεση σχετικά με την ρόλος του PLCε1 σε χρόνια φλεγμονή και την ογκογένεση του καρκίνου του στομάχου. Σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς, βρήκαμε ότι PLCε1 πρωτεΐνη εντόνως εκφρασμένο σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς, ενώ ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ατροφική γαστρικό ιστούς. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν έντονα ότι PLCε1 μπορεί να είναι μια δυνητικά υποσχόμενη βιοδείκτη για τη διάκριση καρκίνου του στομάχου από ατροφική γαστρίτιδα και θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για τη διάγνωση σε πρώιμο στάδιο καρκίνο του στομάχου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Καταστάσεις

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Sun Yat-sen University Κέντρο Καρκίνου και στην επιτροπή δεοντολογίας του πρώτου συνδεδεμένες νοσοκομείο της Σαγκάης Jiao Tong University, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε θέμα.

κυτταρικές σειρές

Τα SV40-μετασχηματισμένα αθάνατο γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων GES-1 διατηρήθηκαν στο ινστιτούτο μας και να συντηρούνται σύμφωνα με τις συστάσεις [27]. Τρεις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου AGS, SGC7901 και MGC803 ελήφθησαν από την Κινεζική Ακαδημία Επιστημών κυττάρων Τράπεζας Type Culture Collection και φυλάσσονται στο εργαστήριο μας. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) (Sigma Chemical, St. Louis, ΜΟ), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 0.1 mg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο με 5% CO

2.

RNA Εκχύλιση και αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ

Ολικό RNA από κύτταρα και ιστούς δείγματα εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το εκχυλισμένο RNA προκατεργάστηκε με RNase-free DNase, και 2 μg RNA από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA ασταρώνονται με τυχαία εξαμερή. Για την PCR-μεσολαβούμενη ενίσχυση του PLCε1 cDNA, ένα αρχικό ενίσχυσης χρησιμοποιώντας PLCε1-ειδικών εκκινητών έγινε με ένα στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθήθηκε από 30 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 60 s, συγκόλληση αρχικού τεμαχίου εις 55 ° C για 30 s, και επέκταση εκκινητή στους 72 ° C για 30 s. Μετά την ολοκλήρωση των βημάτων ποδηλασία, μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 5 λεπτά διεξήχθη πριν η αντίδραση διακόπτεται και αποθηκεύεται στους 4 ° C. δεδομένα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν με τη μέση γεωμετρική του γονιδίου housekeeping αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) για τον έλεγχο της μεταβλητότητας στα επίπεδα έκφρασης. Η αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας την έκδοση λογισμικού Primer Express 3.0 (Applied Biosystems). Οι αλληλουχίες των με νόημα και αντινόημα εναρκτήρες είχαν ως εξής: 5′-GCAAGAAGTGGCCTTCTCAG-3 ‘(F) και 5′-GAACTTGAAGGGAGGGCATT -3′ (R) για PLCε1, 5’-GCTCCTCCTGAGCGCAAG-3 ‘(F) και 5’- CATCTGCTGGAAGGTGGACA -. 3 ‘(R) για GAPDH

Western Blotting

τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δειγματοληψίας [62.5 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 6.8), 2% SDS, 10% γλυκερόλη , και 5% 2-h-μερκαπτοαιθανόλης]. Όλα τα φρέσκα ιστοί θεμελιωμένη σε σκόνη σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια υποβάλλονται σε λύση με ρυθμιστικό διάλυμα δειγματοληψίας. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία Bradford (Bio-Rad Laboratories). Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών εφαρμόστηκαν σε 9% πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου SDS (SDS-PAGE), διαχωρίστηκε ηλεκτροφορητικώς και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο (Amersham Pharmacia Biotech). Η μεμβράνη επωάστηκε με αντι αντίσωμα PLCε1 κουνελιού (1:250? Sigma). έκφραση PLCε1 ανιχνεύθηκε με υπεροξειδάση αρμορακίας συζευγμένη με IgG αίγας αντι-κουνελιού (1:2,000? Amersham Pharmacia Biotech) και μια ενισχυμένη κιτ χημειοφωταύγειας (Amersham Pharmacia Biotech) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. β-ακτίνη ανιχνεύεται με ένα αντίσωμα κουνελιού αντι-β-ακτίνης (αραίωση 1:1,000? Sigma) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης

Ασθενείς, ιστών δείγματα και ιστών Microarray

Ασθενείς με ατροφικό. γαστρίτιδα και ο καρκίνος επιλέχθηκαν από ασθενείς που είχαν προγραμματιστεί για το ανώτερο γαστρεντερικό ενδοσκόπηση για την εξέταση ρουτίνας για καρκίνο του στομάχου στην Πρώτη συνδεδεμένες νοσοκομείο της Σαγκάης Jiao Tong University και η Sun Yat-sen University Κέντρο καρκίνου από τον Ιανουάριο 2003 έως το Δεκέμβριο του 2009. Αποκλείσαμε τους ασθενείς που είχαν έλαβαν παράγοντες κατά του έλκους ή αντιβιοτικά για μέχρι και δύο μήνες πριν από την εξέταση και σε εκείνους που είχαν ιστορίες του καρκίνου του στομάχου, γαστρικό ή δωδεκαδακτυλικό έλκος ή γαστρική χειρουργική επέμβαση. . Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση για τους ιστούς των ασθενών έγινε για να προσδιοριστεί χαρακτηριστικά ιστοπαθολογικές

Ο βαθμός της ατροφίας ταξινομήθηκε σε τρία επίπεδα σοβαρότητας, ανάλογα με την εμφάνιση του βλεννογόνου πτυχώσεις και αγγείωση, ως εξής: ήπια (διαφανή πρόστιμο των αιμοφόρων αγγείων και κιτρινωπό αποχρωματισμό περιορίζεται στο κάτω μέρος του σώματος, με παχιά βλεννογόνου πτυχώσεις), μέτρια (σκάφη σαφώς διαφανείς αίματος και κίτρινο-γκριζωπό αποχρωματισμό μέχρι την μέση και πάνω μέρος του σώματος, με αραιωμένο και στένωση του βλεννογόνου πτυχώσεις), και σοβαρή (σαφώς διαφανή μεγάλα αιμοφόρα αγγεία και graygreenish αποχρωματισμό μέχρι το πάνω μέρος του σώματος, με εξαφάνιση της βλεννογόνου πτυχώσεις επί εμφύσηση αέρα). Η χρήση των κριτηρίων αυτών δικαιολογείται από τις προηγούμενες εκθέσεις σχετικά με τη συνοχή μεταξύ ενδοσκόπηση και ιστολογικά ευρήματα για ατροφική γαστρίτιδα [28], [29]. Όταν επιβεβαιώθηκαν τόσο ενδοσκοπικά και ιστολογικά ευρήματα, 799 ασθενείς ατροφική γαστρίτιδα, συμπεριλαμβανομένων 281 ήπια, μέτρια 265 και 253 σοβαρή, αντίστοιχα, είχαν εγγραφεί στη μελέτη μας. Οι 799 ασθενείς συμπεριλήφθηκαν 439 άνδρες και 320 γυναίκες, με ηλικία media 35,6 έτη (εύρος, 18-55 ετών).

Κάθε δείγμα όγκου τοποθετήθηκε ένα ιστολογικό βαθμό με βάση τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (WHO) κριτήρια ταξινόμησης. Όλοι οι ασθενείς με γαστρικό καρκίνο οργανώθηκαν χρησιμοποιώντας την 7η έκδοση του όγκου-Node-Μετάσταση σύστημα σταδιοποίησης της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου (UICC) (TNM). Οι ασθενείς με καρκίνο εντάχθηκαν στη μελέτη μας, όταν η διάγνωση τους ήταν ιστολογικά επιβεβαιωμένη. Οι φυσιολογικοί ιστοί ήταν επιλέξιμα εάν ενδοσκοπική διάγνωση τους ήταν φυσιολογική. Μετά τη διαλογή Η &? Ε-χρώση διαφάνειες για βέλτιστη ιστό όγκου και κανονικό ιστό δίπλα σε καρκινικά με απόσταση 10 cm από τον όγκο, κατασκευάσαμε TMA ολισθαίνει με 74 ζεύγη ιστών όγκου και γειτονικά προς τους ιστούς του όγκου (σε συνεργασία με Σαγκάη Biochip , Σαγκάη, Κίνα) .Οι 74 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου (εύρος ηλικίας = 40 έως 84 ετών? μέση ηλικία = 63,77 χρόνια? 23 θηλυκά και 35 αρσενικά) περιλαμβάνονται 36 πρώιμο περιπτώσεις (στάδιο pTNM Ι = 11, στάδιο pTNM ΙΙ = 25) και 36 προχωρημένες περιπτώσεις (στάδιο pTNM III = 32, pTNM στάδιο IV = 6). Μεταξύ αυτών, 6 (0,81%) ταξινομήθηκαν ως καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα, 40 (54,1%) ως μετρίως διαφοροποιημένων, και 25 (33,8%), όπως κακώς διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα.

Η ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η μορφή έκφρασης του PLCε1 πρωτεΐνης σε 74 συμφωνημένα ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς και 799 ατροφική γαστρίτιδα δείγματα. Εν συντομία, ενσωματωμένα σε παραφίνη δείγματα κόπηκαν σε τομές πάχους 4 μm και ψήθηκε στους 60 ° C για 2 ώρες και ακολούθησε αποπαραφινώσεως με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν. Οι τομές βυθίστηκαν σε ΕϋΤΑ αντιγονική ρυθμιστικού διαλύματος ανάκτησης και μικροκύματα για αντιγονική ανάκτηση, μετά την οποία υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε μεθανόλη για να αποσβεστεί η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης, που ακολουθείται από επώαση με 1% αλβουμίνη βόειου ορού για να εμποδίσει μη ειδική σύνδεση. Οι τομές επωάστηκαν με αντι-κουνελιού PLCε1 (1:50? Sigma) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Φυσιολογικό ορό κατσίκας χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Μετά την πλύση, οι τομές ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με βιοτινυλιωμένο αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα (Zymed) που ακολουθείται από περαιτέρω επώαση με σύμπλεγμα στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης αρμορακίας (Zymed). τομές ιστών στη συνέχεια βυθίζεται σε 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη και αντίθετα με το 10% αιματοξυλίνη Mayer, το αφυδατωμένο, και να τοποθετηθεί.

Η βαθμολόγηση των PLCε1 Ανοσοϊστοχημεία

PLCε1 ανοσολογική αντίδραση αξιολογήθηκε ανεξάρτητα από 3 παθολόγους ( WW, QQ και LL), οι οποίοι δεν γνώριζαν την έκβαση των ασθενών. Το ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων και η ένταση της χρώσης κυττάρων προσδιορίστηκε με κάθε παρατηρητή, και ο μέσος όρος των βαθμολογιών 3 υπολογίστηκε. Έχουμε επιλέξει τυχαία 10 πεδία υψηλής ισχύος (μεγέθυνση, × 400? 100 κύτταρα ανά πεδίο υψηλής ισχύος) και μετρήθηκαν 1000 κύτταρα. Όταν ο μέσος όρος του ποσοστού του PLCε1-θετικών κυττάρων είναι κοντά στο 0% ή 100%, η τυπική απόκλιση (SD) είναι κοντά στο μηδέν? και, όταν η μέση τιμή είναι περίπου 50%, το SD είναι περίπου 5%. Έτσι, το SD δεν αυξάνει με τη μέση τιμή. Σε αυτή τη μελέτη, η έκφραση PLCε1 βαθμολογήθηκε ως εξής: ιστού με θετική κυτταροπλασματική χρώση σε ≤25% των κυττάρων βαθμολογήθηκε αρνητικά, και ιστού με θετική κυτταροπλασματική χρώση σε & gt? 25% των κυττάρων βαθμολογήθηκε θετική [30]

στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του στατιστικού πακέτου λογισμικού SPSS 17.0. Η μέθοδος Wilcoxon δοκιμή χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των εν λόγω συμφωνημένα γαστρικών όγκων ιστούς στο μικροσυστοιχία ιστό. Η δοκιμή και η ακριβής δοκιμές του Fisher χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα εν λόγω γαστρικό καρκίνο και σοβαρή ατροφική γαστρίτιδα, και επίσης διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η σημασία της σχέσης μεταξύ της έκφρασης PLCε1 και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά. Κάθε πείραμα διεξήχθη ανεξαρτήτως τουλάχιστον δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

σ

& lt?. 0,05 σε όλες τις περιπτώσεις θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Up-ρυθμιζόμενη έκφραση της PLCε1 στο γαστρικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές

Πρώτον, ανιχνεύσαμε την έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης του PLCε1 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές γαστρικού (Σχήμα 1). Η αντίστροφη μεταγραφή ανάλυση-PCR και ανάλυση Western blotting πραγματοποιήθηκαν σε αυτά τα δείγματα που προέρχονται από φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνους κύτταρα GES-1 και τρεις κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου AGS, SGC7901 και MGC803. Βρήκαμε ότι όλοι οι κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου αποκάλυψε υψηλότερη έκφραση PLCε1 από ότι σε φυσιολογικούς ελέγχους γαστρικού κύτταρο στα δύο επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης.

Α, η έκφραση του mRNA PLCε1 σε γαστρικό κανονική κυτταρική σειρά καρκίνου του GES-1 και κυτταρικές σειρές SGC7901 , MGC803 και AGS με αντίστροφη μεταγραφή-PCR. Β, η έκφραση της πρωτεΐνης PLCε1 γαστρικού φυσιολογικές κυτταρικές σειρές GES-1 και καρκινικές κυτταρικές σειρές SGC7901, MGC803 και AGS με κηλίδωση Western.

Η

PLCε1 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε γαστρικός καρκίνος Αλλοιώσεις αλλά ρυθμισμένα προς τα κάτω σε ατροφική Γαστρίτιδα βλάβες

στη συνέχεια, διερευνήσαμε το ρόλο της PLCε1 τόσο του όγκου και των φυσιολογικών ιστών σε ένα γαστρικό καρκίνο μικροσυστοιχία ιστού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, παρατηρήθηκε ότι και οι δύο όγκων και φυσιολογικών ιστών κατέδειξε την θετική έκφραση του PLCε1. Ωστόσο, όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, ιστός ανάλυση δεδομένων μικροσυστοιχιών είχαν δείξει ότι το ποσοστό των PLCε1 θετική έκφραση σε ιστούς όγκων είναι σημαντικά υψηλότερη από ότι σε γειτονικό φυσιολογικό ιστούς με Wilcoxon ανάλυση των δοκιμών (73,0% έναντι 20,3%,

ρ

& lt?. 0.01)

Εκπρόσωπος εικόνες από Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των 74 αρχειοθετημένα γαστρικού καρκίνου και 799 ατροφική γαστρίτιδα περιπτώσεις. Α, επισκόπηση των μικροσυστοιχιών ιστού από ανοσοχρώση αντισώματος PLCε1. Οι βιοψίες Συσκευασμένο φαίνεται λεπτομερώς στο (Β και C). Β και Γ αντιστοιχίζονται όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών από ίδιο ασθενή. Ο ασθενής είναι pTNM σταδίου ΙΙΙ με ελάχιστα διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα. Τόσο όγκου (Β) και των παρακείμενων φυσιολογικά κύτταρα (C) είναι θετικά για PLCε1. Εκπρόσωπος ανοσοϊστοχημική (D) /ιστολογική (G) παρατηρήσεις σε ατροφική γαστρίτιδα ιστού, Εκπρόσωπος ανοσοϊστοχημική (Ε) /ιστολογική (H) παρατηρήσεις σε γαστρικό φυσιολογικό ιστό, Εκπρόσωπος ανοσοϊστοχημική (F) /ιστολογική (Ι) παρατηρήσεις σε γαστρικό ιστό καρκίνου . (Αρχική μεγέθυνση, × 2 για το Β και Γ, × 200 για D, E, F, G, H και Ι).

Η

Για να προσδιοριστεί η έκφραση PLCε1 σε περιβάλλον φλεγμονής, επεκτείναμε PLCε1 ανοσοϊστοχημική ανάλυση χρησιμοποιώντας ένα άλλο ανεξάρτητο σύνολο τομών ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη από 799 δειγμάτων ατροφική γαστρίτιδα ιστού. Οι ανοσοϊστοχημικές αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση PLCε1 ήταν θετική σε 275 (37,0%) ατροφική γαστρίτιδα, συμπεριλαμβανομένων 106 (37,7%) ήπια ατροφική γαστρίτιδα, 98 (26,0%) μέτρια ατροφική γαστρίτιδα και 71 (28,1%) σε σοβαρή ατροφική, αντίστοιχα. Επιπλέον, η έκφραση PLCε1 συσχετίστηκε με τον βαθμό της ατροφίας (

σ

= 0,036) (βλέπε Πίνακα 2). Ως εκ τούτου, σε σύγκριση με όγκο και φυσιολογικούς ιστούς, ατροφική γαστρίτιδα δείγματα είχαν μειωμένη έκφραση PLCε1 (

σ

& lt? 0.001) (βλέπε Πίνακα 2)

Η

Στη συνέχεια, επιβεβαίωσε αυτές τις ανοσοϊστοχημικές μικροσυστοιχιών ιστού. αποτελέσματα με αντίστροφης-μεταγραφής-ΡΟΚ και στύπωμα Western ανάλυσης τριών ζευγών του γαστρικού καρκίνου και παρακείμενων φυσιολογικών ιστών και τρία ζεύγη σοβαρής ατροφικής γαστρίτιδας και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών, τα οποία ελήφθησαν από τον ίδιο ασθενή. Σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς, τρία εξετάστηκαν γαστρικών όγκων που εμφανίζονται πάνω ρύθμιση της έκφρασης PLCε1 τόσο σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης, αλλά όλα σοβαρής ατροφικής γαστρίτιδας ιστών είχαν χαμηλότερη έκφραση του PLCε1 (βλέπε Εικόνα 3.). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα της ανάλυσης των μικροσυστοιχιών ανοσοϊστοχημικής ιστού, η αντιστοιχισμένη ανάλυση έδειξε επίσης PLCε1 ήταν υπερεκφράζεται σε όγκο, αλλά κάτω-ρυθμίζονται σε σοβαρή ατροφική γαστρίτιδα σε σύγκριση με τα συμφωνημένα παρακείμενων φυσιολογικών ιστών.

Α και Γ , η έκφραση του PLCε1 mRNA και της πρωτεΐνης σε κάθε ένα από τα γαστρικών όγκων (Τ) και το γαστρικό παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (Ν) ζεύγη από τον ίδιο ασθενή με αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ και στύπωμα Western. Β και D, η έκφραση της πρωτεΐνης PLCε1mRNA και σε κάθε μία από τις σοβαρές ατροφικής γαστρίτιδας (S) και το γαστρικό παρακείμενων φυσιολογικών ιστών (Ν) ζεύγη από τον ίδιο ασθενή με αντίστροφη μεταγραφή-ΡΟΚ και στύπωμα Western.

Η

Οι παρατηρήσεις αυτές πρότειναν ότι κατάστασης έκφρασης PLCε1 ήταν πολύ διαφορετική στο πλαίσιο της φλεγμονής έναντι ογκογένεσης. Τα αποτελέσματά μας προτείνω ιδιαίτερα ότι τα αποτελέσματά μας προτείνω ιδιαίτερα ότι η πρωτεΐνη PLCε1 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης του καρκίνου του στομάχου.

συσχετίσεις μεταξύ PLCε1 και κλινικοπαθολογική Χαρακτηριστικά

Δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά της έκφρασης PLCε1 σε κλινικοπαθολογικοί δεδομένα, όπως η ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, την ταξινόμηση, κλινικό στάδιο, μεταξύ των ασθενών σε διαφορετικά στάδια του γαστρικού καρκίνου στην μικροσυστοιχία ιστού (που φαίνονται στον πίνακα S1).

Ιδιαίτερα, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, έκφραση της πρωτεΐνης PLCε1 σε κυτόπλασμα ήταν συχνά ανιχνεύθηκε σε όλους τους ιστούς του όγκου, φυσιολογικούς ιστούς αλλά λιγότερο συχνά σε ατροφική γαστρίτιδα ιστούς.

Ωστόσο, όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, στη μικροσυστοιχία ιστό, θετική έκφραση PLCε1 παρατηρήθηκαν σε φλεγμονώδη κύτταρα και λεμφοκύτταρα σε 13 (48,1%) παρακείμενο φυσιολογικό δείγματα ιστού από μεταστάσεις λεμφαδένων (N0) ασθενείς με γαστρικό καρκίνο (που φαίνεται στο Σχήμα 4Α). Επιπλέον, σε σοβαρή ατροφική γαστρίτιδα ιστούς, 6 (2,37%) δείγματα εμφάνισαν θετική έκφραση PLCε1 σε φλεγμονώδη κύτταρα ή λεμφικών ιστών (Σχήμα 4Β). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η έκφραση του PLCε1 μπορεί να σχετίζεται με φλεγμονώδη κύτταρα εισβολής κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και μεταστάσεων όγκου.

Αντιπροσωπευτικά ανοσοϊστοχημική (A) /ιστολογική (Β) παρατηρήσεις σε μια γαστρική φυσιολογικό ιστό, Αντιπρόσωπος ανοσοϊστοχημικές (C ) /ιστολογική (D) παρατηρήσεις σε ατροφική γαστρίτιδα ιστού. Τα βέλη δείχνουν θετικά χρωματισμένα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος (Αρχική μεγέθυνση, × 200).

Η

Συζήτηση

Εδώ, η μελέτη μας έδειξε ότι πρώτον PLCε1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ανθρώπινο γαστρικό ιστούς όγκων, αλλά ρυθμισμένα προς τα κάτω σε περιβάλλον φλεγμονής, σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. Η διαφορική έκφραση των PLCε1 σε διαφορετικούς ιστούς πολύ πρότεινε ότι η έκφραση της PLCε1 θα μπορούσε να διαδραματίσει καίριο ρόλο στη φλεγμονή και την καρκινογένεση.

Η φλεγμονή αναγνωρίζεται ως ένα ζωτικό συστατικό του τοπικού περιβάλλοντος διατήρηση της ανάπτυξης των όγκων, συμπεριλαμβανομένων έναρξη, την προώθηση , κακοήθη μετατροπή, εισβολή, και μετάσταση [31]. Αιτιολογική συσχέτιση μεταξύ γαστρικής προώθηση του όγκου και η φλεγμονή έχει υποστηριχθεί από τις παρατηρήσεις ότι η φλεγμονή που προκαλείται από

Helicobacter pylori

μόλυνση μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο προώθησης όγκων [8] – [10]. Πρόσφατα, πολυάριθμες αναφορές έχουν δείξει ότι τα επίπεδα έκφρασης PLCε1 είναι ιδιαίτερα σχετίζεται με φλεγμονή και ογκογένεση [19] – [21], [23]. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός βασίζεται η βιολογική σημασία των PLCε1 σε γαστρικό ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου παραμένει ασαφής. Η μελέτη μας απέδειξε ότι PLCε1 πάνω ρύθμιση μπορεί να είναι σημαντική για την εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου. Ιδιαίτερα, ρύθμιση προς τα κάτω της στο περιβάλλον της φλεγμονής, ιδιαίτερα πρότεινε ότι PLCε1 μπορεί να είναι ένας σημαντικός βιολογικός δείκτης, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάκριση του γαστρικού καρκίνου κατάστασης από ατροφική στάδιο βλάβη.

Επίσης, στη δουλειά μας, PLCε1 πρωτεΐνη μπορεί να είναι ανιχνευθεί σε φλεγμονώδη κύτταρα και ιστούς λεμφοκυττάρων σε μερικές γειτονικές φυσιολογικούς ιστούς στο N0 βαθμό και ορισμένες σοβαρές ατροφική γαστρίτιδα ιστούς. Στα θηλαστικά, PLCε1 έχει αναφερθεί ότι εκφράζεται σε μη-άνοσα κύτταρα όπως επιδερμικά κερατινοκύτταρα, δερματικούς ινοβλάστες, και επιθηλιακά κύτταρα, αλλά όχι σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος όπως είναι τα λεμφοκύτταρα, κοκκιοκύτταρα, μακροφάγα, και δενδριτικά κύτταρα [21], [32], [33]. . Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η λειτουργία της PLCε1 πρωτεΐνης σε γαστρικό καρκίνο μπορεί να συνδέεται με την έκφραση της στο ανοσοποιητικό σύστημα

Σύμφωνα με αυτά τα διαθέσιμα αποτελέσματα, προτείναμε ένα πιθανό μηχανισμό του PLCε1 πρωτεΐνης λειτουργούν στην ογκογένεση του καρκίνου του στομάχου: PLCε1 πρωτεΐνη ως τελεστή του Ras και Rap μικρές ΟΤΡάσες [12], [14], [15] είναι σε πρώτη εκφράζεται σε φυσιολογικό γαστρικό βλεννώδεις ιστούς. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της ατροφικής γαστρικής βλάβης, η έκφραση πρωτεΐνης PLCε1 μειώνεται για την πρόληψη της πρόωρης διείσδυση φλεγμονή, σύμφωνα με PLCε

– /- ποντίκια εμφανίζει την ένδειξη αντίστασης στην φλεγμονή του δέρματος ΤΡΑ επάγει [18], [19]. Με την αύξηση του χρόνου και του βαθμού της φλεγμονής της ατροφικής γαστρικής βλάβης, PLCε1 πρωτεΐνη σταδιακά εκφράζεται σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, επειδή PLCε απαιτήθηκε σε μια ποικιλία φλεγμονωδών αντιδράσεων [21], [22], η οποία μπορεί να προκαλέσει τελικά τον σχηματισμό του γαστρικού καρκίνου. Ταυτόχρονα, PLCε1 πρωτεΐνη παίρνει υψηλότερη έκφραση σε καρκίνο του στομάχου κύτταρα επειδή PLCε υπερέκφραση μπορεί να προωθήσει την εντερική ογκογένεση στο APC η

Min /+ ποντικό [20].

Εν περιλήψει, προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης PLCε1 στα γαστρικά καρκίνο, αλλά κάτω ρύθμιση σε ατροφική γαστρίτιδα παρατηρήθηκε από τη μελέτη μας. Η σημασία του ρόλου της PLCε1 στο γαστρικό καρκίνο υπογραμμίζεται περαιτέρω από το εύρημα μας αντίστροφη συσχέτιση της με χρόνια ατροφική γαστρίτιδα. Τα αποτελέσματα αυτά δεν δείχνουν μόνο ότι PLCε1 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης για τη διάκριση καρκίνου του στομάχου από ατροφική γαστρίτιδα, αλλά επίσης να δικαιολογούν περαιτέρω μελέτες για τη δημιουργία μια πιθανή σχέση μεταξύ της βιολογικής λειτουργίας του PLCε1 και παθογένεση του καρκίνου του στομάχου. Οι μελέτες μας δείχνουν επίσης ότι PLCε1 μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση του καρκίνου του στομάχου, ειδικά σε αρχικό στάδιο, και μπορεί να αποτελέσει μια νέα δείκτης για τη διάγνωση σε πρώιμο στάδιο καρκίνο του στομάχου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Η σχέση μεταξύ PLCε1 έκφρασης και κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0047563.s001

(DOC)