Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου που βρέθηκαν σε άνδρες και από τις κύριες αιτίες θανάτου από καρκίνο στον δυτικό κόσμο. Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε τις επιμέρους σχήματα έκφρασης πρωτεΐνης από ιστολογικά χαρακτηρίζεται από PCa και τον περιβάλλοντα καλοήθη ιστό που λαμβάνεται από το εγχειρίδιο μικρο ανατομή χρησιμοποιώντας εξαιρετικά ευαίσθητες ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων απόκλιση γέλη (2D-ΨΗΦΟ) σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας. Πρωτεομικής δεδομένα αποκάλυψαν 118 κηλίδες πρωτεΐνης που θα εκφράζονται διαφορικά σε καρκίνο (n = 24) σε σύγκριση με καλοήθη (n = 21) προστατικό ιστό. Αυτές οι κηλίδες αναλύθηκαν με MALDI-TOF-MS /MS και ταυτοποιήθηκαν 79 διαφορετικές πρωτεΐνες. Χρησιμοποιώντας ανάλυση κύριων συνιστωσών θα μπορούσαμε σαφώς ξεχωριστή όγκου και φυσιολογικό ιστό και δύο διακριτές ομάδες καρκινικών με βάση το πρότυπο έκφρασης της πρωτεΐνης. Με τη χρήση μιας προσέγγισης βιολογία συστημάτων, θα μπορούσαμε να χαρτογραφήσει πολλές από αυτές τις πρωτεΐνες, τόσο σε μεγάλες οδών που εμπλέκονται στην εξέλιξη του προστάτη, καθώς και σε μία ομάδα πιθανών διαγνωστικών ή /και προγνωστικούς δείκτες. Λόγω της πολυπλοκότητας του άκρως διασυνδεδεμένου δικτύου συντομότερη διαδρομή, οι λειτουργικές υπο δίκτυα αποκάλυψε μερικές από τις πιθανές πρωτεΐνες υποψήφιο βιοδείκτη για περαιτέρω επικύρωση. Με τη χρήση μιας προσέγγισης της βιολογίας συστημάτων, η μελέτη μας αποκάλυψε νέων πρωτεϊνών και των μοριακών δικτύων με αλλοιωμένη έκφραση σε προστάτη. Περαιτέρω λειτουργική επικύρωση των επιμέρους πρωτεϊνών είναι σε εξέλιξη και μπορεί να παρέχει νέες ιδέες στην εξέλιξη του προστάτη δυνητικά οδηγεί στο σχεδιασμό των νέων διαγνωστικών και θεραπευτικών στρατηγικών

Παράθεση:. Ummanni R, Mundt F, Pospisil Η Venz S, Scharf C , Barett C, et al. (2011) Προσδιορισμός των κλινικά σημαντικών πρωτεϊνικών στόχων στον καρκίνο του προστάτη με 2D-ΨΗΦΟ συνδυασμό Φασματομετρίας Μάζας και Βιολογία Συστημάτων πλατφόρμα του δικτύου. PLoS ONE 6 (2): e16833. doi: 10.1371 /journal.pone.0016833

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 30 Αυγούστου του 2010? Αποδεκτές: 16 Ιανουαρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 11 Φεβρουαρίου 2011

Copyright: © 2011 Ummanni et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το γερμανικό Ομοσπονδιακό Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας, στο πλαίσιο του Προγράμματος για την Ιατρική Genome Research (Επιχορηγήσεις: 01GS0890, 01GS0892, 01GS0189). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι σήμερα ο ηγετικός καρκίνου μεταξύ των ανδρών στις δυτικές χώρες [1]. Η νεκροτομή μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι περίπου το 30% των ανδρών ηλικίας άνω των 50 ετών και 80% των ανδρών στα 70 τους έχουν μικροσκοπική ένδειξη καρκίνου του προστάτη [2], [3]. Κατά το έτος 2007 στις Ηνωμένες Πολιτείες, εκτιμάται ότι περίπου 218.890 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται και 27.050 άνδρες πέθαναν από προστάτη [4]. Η (πρώιμη) ποσοστό ανίχνευσης και επομένως η συχνότητα εμφάνισης της προστάτη έχει αυξηθεί δραματικά λόγω της εισαγωγής του ελέγχου PSA. Παρ ‘όλα αυτά, ο προσδιορισμός του PSA ορού εμφανίζουν ορισμένοι σημαντικοί περιορισμοί, καθώς αυξημένα επίπεδα συσχετίζονται στενά τόσο με υπερπλασία και τον καρκίνο.

Δύο-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση γέλης (2DE), ένα ισχυρό εργαλείο που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών και των χαρακτηριστικών έκφρασης είναι ένας από οι βασικές τεχνολογίες στην πρωτεομική [5], [6]. ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης των υλικών ασθενής είναι κατατοπιστική οδήγησε στα εντοπισμό του καρκίνου ειδικούς δείκτες για τη διάγνωση, θεραπευτικοί στόχοι και αποτελεί τη βάση για την αποκάλυψη διαφόρων κυτταρικών γεγονότων που σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου [7]. Μέχρι σήμερα, αρκετές ερευνητικές ομάδες έχουν ήδη πραγματοποιηθεί έκφραση της πρωτεΐνης και του γονιδίου profiling μελέτες για χειρουργικές και δείγματα βιοψίας προστάτη [8] – [12], αλλά οι περισσότερες από τις δυνατότητες που αναφέρθηκαν δείκτες δεν είναι σε κλινική εφαρμογή για την οριστική διάγνωση του προστάτη. Ωστόσο, προηγούμενες μελέτες επικεντρώθηκαν στις ατομικές συγκρίσεις των πρωτεομική ανάλυση της ριζοσπαστικής προστατεκτομών από ασθενείς με καρκίνο με εκείνα των ασθενών χωρίς καρκίνο με τα συμβατικά 2DE. Η ενδο-ατομική ανάλυση των όγκων και των δειγμάτων καλοήθους ιστού (δίπλα στο όγκου) από τους ίδιους τους ασθενείς με καρκίνο μπορεί να μειώσει την τεχνική μεταβλητότητα και έτσι παρέχει ένα μέσο για την αύξηση της ειδικότητας των αποτελεσμάτων και να αυξήσουν τις πιθανότητες να προσδιορίσει συγκεκριμένη ασθένεια που σχετίζεται με πρωτεΐνη αλλαγές.

στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η συγκριτική πρωτεώματος του καρκίνου του προστάτη και των παρακείμενων ιστολογική καλοήθη ιστό του από ασθενείς με καρκίνο με οριστική παθολογική χαρακτηρισμό σε 2-D απόκλιση σε γέλη ηλεκτροφόρησης μας συστήματος (ΨΗΦΟ) για την πρωτεΐνη ηλεκτροφόρηση 2-D [13 ] και MALDI-TOF-MS /MS για ταυτοποίηση πρωτεϊνών. Τα διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών αναλύθηκαν με MetaCore ™ (Gene GO) και το πρόγραμμα Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems). Τα σημαντικότερα κέντρα των σημαντικών επιμέρους δικτύων επικυρώθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση. ανάλυση συστημάτων δικτύου βιολογία θα μπορούσε να παράσχει τη δυνατότητα ρόλος των πρωτεϊνών σε διάφορα ρυθμιστικά μονοπάτια που ελέγχουν προστάτη πρόοδο και την πρόβλεψη νέων βιοδεικτών, η οποία μπορεί να επικυρωθεί περαιτέρω χρησιμοποιώντας Western και η ανοσοϊστοχημική (IHC) προσεγγίσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα και δήλωση Δεοντολογίας

τα δείγματα ιστών και τα δεδομένα των ασθενών ελήφθησαν με ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου του Αμβούργου Eppendorf και πραγματοποιείται σύμφωνα με τη δήλωση του Ελσίνκι. Για την ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης ολόκληρη προστάτες συλλέχθηκαν μετά από ριζική προστατεκτομή από ασθενείς με αυξημένες τιμές PSA και προεγχειρητική παθολογική εξέταση στο Martini Κλινικές, Αμβούργο, Γερμανία. Οι ασθενείς δεν έλαβαν προεγχειρητική θεραπεία. 24 ασθενείς επιλέχθηκαν και το αντίστοιχο κλινικά και παθολογικά δεδομένα παρέχονται είναι στον Πίνακα 1. Τα επίπεδα του PSA στον ορό των ασθενών αυτών προσδιορίστηκαν και όλοι οι ασθενείς είχαν ένα εύρος μεταξύ 3,9 και 30,4 ng /ml (μέση τιμή PSA = 10.93 ng /ml) και ένα σκορ Gleason μεταξύ 3 + 3 και 4 + 5 [14], [15].

η

Μετά από ριζική προστατεκτομή δείγματα καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο μέχρι τη χρήση. Όγκου και καλοήθεις περιοχές σημειώθηκαν στα τμήματα. Εμείς που απασχολούνται χειροκίνητη μέθοδο micro ανατομή για να αποκτήσετε παθολογικά υλικά που έχουν χαρακτηριστεί για την προσέγγιση πρωτεομική μας. Οι αντίστοιχες περιοχές επί των υπολοίπων μπλοκ φέτες με κοφτερό μαχαίρι, ενσωματωμένα σε Tissue-tek® και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση.

απομόνωση πρωτεϊνών και η επισήμανση με CyDyes

ιστός ξεπλένονται με φυσιολογικό ορό (0,9% NaCl) για την απομάκρυνση υπολειμμάτων υλικών στερέωσης, σήμανση βαφή και το αίμα. Οι φέτες ιστοί ομογενοποιήθηκαν άμεσα σε ΨΗΦΟ ρυθμιστικού λύσης (30 mM Tris, 2 Μ ουρία Thio, 7 Μ ουρία, 4% CHAPS? Περίπου 0,5 /200 mg ιστών mL). Το προκύπτον ομογενοποίημα καθαρίστηκε για να αφαιρέσετε όλα τα υπολείμματα με φυγοκέντρηση στα 12.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C, το υπερκείμενο πρωτεΐνη συνελέγη και η συγκέντρωση της πρωτεΐνης του προσδιορίστηκε με μία τροποποιημένη δοκιμασία Bradford [16]. Η ποιότητα των δειγμάτων για ΨΗΦΟ αξιολογήθηκε από mini 2DE (7 cm IPG λωρίδες, ρΗ 4-7). Τα προϊόντα λύσης πρωτεΐνης επισημάνθηκαν με Cy Χρωστικές ουσίες σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για την ελάχιστη σήμανση (ελάχιστη βαφές CyDye ΨΗΦΟ Fluor, GE Healthcare). Προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί βαφή ειδικά τεχνήματα επισήμανση, Cy3 και Cy5 μοτίβα σήμανσης μετατράπηκε την ίδια ομάδα δειγμάτων. Ένα εσωτερικό πρότυπο πισίνα με ίσες ποσότητες από κάθε δείγμα πρωτεΐνης (25 μg) χρησιμοποιήθηκε για τη μείωση της διακύμανσης μεταξύ γέλη. Τα συγκεντρωμένα εσωτερικά πρότυπα σημάνθηκαν με Cy2. 50 μg πρωτεΐνης του κάθε δείγματος σημάνθηκε με 400

σ

mol της αντίστοιχης βαφής επί πάγου στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Η αντίδραση σβήστηκε /διακόπηκε με 10 mM L-λυσίνη για 10 λεπτά κάτω από τις ίδιες συνθήκες.

ΨΗΦΟ Δύο-διαστάσεων ηλεκτροφόρηση γέλης (ΨΗΦΟ-2-DE)

Η πρώτη διάσταση ισοηλεκτρική εστίαση διεξήχθη με τη χρήση 24 cm ακινητοποιημένη διαβάθμιση ρΗ ξηρό λωρίδες (IPG) με 4-7 ρΗ γραμμικής κλίσης. Για αναλυτικούς πηκτές, ένα ζευγάρι Cy3 και Cy5 επισημασμένα δείγματα (έκαστο 50 μα πρωτεΐνης) και 50 μα Cy2 επισημασμένου εσωτερικού προτύπου συνενώθηκαν και συμπληρώθηκε μέχρι 150 μλ με 2 × ρυθμιστικό δείγματος (7 Μ ουρία, 2 Μ θειουρία, 4 % CHAPS, 2% DTT) συμπληρωμένο με 2% (ν /ν) ρυθμιστικό IPG ρΗ 4-7). Για ενυδάτωση, αραιώστε τα δείγματα με 2 × ρυθμιστικό επανυδάτωση (8 Μ ουρία, 4% CHAPS, 13 mM DTT) συμπληρωμένο με 1% (ν /ν) IPG ρΗ 4-7 και μερικά τεμάχια βρωμοφαινόλης μπλε) προς τελικό όγκο 450 μλ. IPG ταινίες (24 cm, ρΗ 4-7, η GE Φροντίδα Υγείας) παθητικά επανυδατώθηκαν διάρκεια της νύχτας στους 20 ° C σε κασέτες IPGPhor. Για παρασκευαστική πηκτώματα, χρησιμοποιήθηκε 750 μg μη σημαδεμένης πρωτεΐνη συνενώνονται από ίσες ποσότητες των δειγμάτων. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με την πρωτεϊκή σύστημα IEF (Bio-Rad) χρησιμοποιώντας μια προγραμματισμένη κλίση τάσης στους 20 ° C με ένα όριο ρεύματος 50 μΑ ανά λωρίδα στο σκοτάδι κάτω από τις ακόλουθες συνθήκες: 4 h στα 250 V, 8000 V γραμμική κλίση προς 15000 V ώρες, ταχεία 8000 V έως 75000 V ώρες, για ένα σύνολο 90 KVH. Μετά IEF, οι λωρίδες IPG εξισορροπήθηκαν σε ρυθμιστικό 1 (50 mM Tris-HCl ρΗ 8.8, 8 Μ ουρία, 30% γλυκερόλη, 2% SDS και 0.5% DTT) και ρυθμιστικό 2 που περιέχει 4.5% ιωδοακεταμίδιο αντί DTT σε κάθε περίπτωση για 15 λεπτά.

Δεύτερη διάσταση πραγματοποιήθηκε σε σύστημα κυττάρων PROTEAN® Plus δΩΔΕΚΑ ™. Οι εξισορροπημένη λωρίδες εφαρμόζεται στην κορυφή του 12,5% γέλες SDS-PAGE και σφραγίζονται με 1% αγαρόζη παρασκευασμένη σε ρυθμιστικό SDS-τρις-γλυκίνης με ίχνη κυανού βρωμοφαινόλης ως χρωστική παρακολούθησης για την παρακολούθηση της ηλεκτροφόρησης. πηκτές πολυακρυλαμιδίου (12,5%) πετάχτηκαν σε γυάλινες πλάκες φθορισμού χαμηλής. Διεξήχθη ηλεκτροφόρηση με σταθερή τάση (80V) στους 20 ° C μέχρις ότου το μέτωπο χρωστικής έφθασε στον πυθμένα της γέλης. Η πλήρης συσκευή προστατεύεται από το φως. Μετά την ηλεκτροφόρηση, αναλυτική κασέτες τζελ πλύθηκαν με αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O και σκούπισε με σκόνη ελεύθερη χαρτί. Το Cy2 (εσωτερικό πρότυπο), Cy3 και Cy5 επισημασμένα πρωτεΐνες σε κάθε γέλη κατέστησαν ορατές με τη χρήση ενός τυφώνα 9400 ™ σαρωτή λέιζερ (GE Healthcare) στα 100 microns πυκνότητα χρησιμοποιώντας διαφορετικά μήκη κύματος διέγερσης και εκπομπής απευθείας από πήγματα μεταξύ γυάλινων πλακών. Βέλτιστη μήκη κύματος διέγερσης /εκπομπής για την ανίχνευση φθορισμού είναι 488/520 nm για Cy2, 532/580 nm για Cy3, και 633/680 nm για Cy5. Προπαρασκευαστικό πηκτώματα βάφτηκαν με Roti®-μπλε, ένα κολλοειδές Coomassie λαμπρό μπλε G250 λεκέ. Εν συντομία, οι γέλες σταθεροποιήθηκαν σε 40% μεθανόλη, 15% οξικό οξύ για τουλάχιστον 4 ώρες και στη συνέχεια βυθίζεται σε κολλοειδές διάλυμα χρώσης για όλη τη νύχτα. Για να αφαιρέσετε τζελ χρώση φόντο πλύθηκαν σε 20% μεθανόλη.

Εικόνα ανάλυση

Delta 2D διαφορική ανάλυση έκδοση λογισμικού 4.0 (Decodon GmbH, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Για την ανάλυση επιμέρους γέλη, κηλίδες ανιχνεύθηκαν, ποσοτικοποιείται και ομαλοποιήθηκαν σύμφωνα με την αναλογία όγκου των αντίστοιχων κηλίδων ανιχνεύονται στην εικόνα Cy2 του ομαδοποιημένου δείγματος εσωτερικό πρότυπο, χρησιμοποιώντας το εσωτερικό πρότυπο module. Όλες οι κανονικοποιημένες ποσότητες σημείο από τα πήγματα συλλογικά αναλύονται ως δύο ανεξάρτητες ομάδες «όγκου» και «Καλοήθης», η οποία δίνει τη δυνατότητα αντιστοίχισης πολλαπλών εικόνων τζελ από διαφορετικούς ασθενείς για την παροχή στατιστικών στοιχείων, κατά μέσο όρο αφθονία για κάθε σημείο της πρωτεΐνης μεταξύ των τζελ ΨΗΦΟ που περιλαμβάνονται στην ανάλυση . Τρία τζελ από καλοήθεις ομάδα αποκλείστηκαν από την ανάλυση λόγω του προβλήματος στην επισήμανση ΨΗΦΟ. Μαθητή

t-test

διεξήχθη για να αξιολογηθεί η στατιστική σημαντικότητα των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών. Με βάση τη μέση αναλογία σημείο του όγκου, τα σημεία των οποίων η σχετική έκφραση έχει αλλάξει τουλάχιστον 1,5 φορές (αύξηση ή μείωση) μεταξύ καλοήθων και οι όγκοι σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95% (t-test? P db = πρωτεΐνη) από το NCBI. δίκτυα πρωτεϊνών για την ανάλυση μικρότερη μονοπάτια μεταξύ των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών χτίστηκαν από MetaCore ™ πρόγραμμα Ingenuity Pathways Ανάλυση (IPA) (Gene GO), το λογισμικό και (Ingenuity Systems) για τον προσδιορισμό των μοριακών τους εταίρους που εμπλέκονται στην συγκεκριμένη ασθένεια. Ένας κύριος παγκόσμιο δίκτυο όλων των διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών (αντικείμενα εισόδου) δημιουργήθηκε σύμφωνα με τα δημοσιευμένα σχολιασμούς λογοτεχνία-βάση, και στη συνέχεια τα περαιτέρω επιμέρους δίκτυα χτίστηκαν από τον πλοίαρχο του δικτύου να επικεντρωθεί σε ενεργοποιημένα πειράματα ή /και μονοπάτια. Σημαντικές πλήμνες ταυτοποιήθηκαν με βάση τις συνδέσεις και τις ακμές με το δίκτυο. Τα δεδομένα έκφραση της πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ιεραρχική ομαδοποίηση και ανάλυση διαμέρισμα με R-γλώσσα για να βρουν πιθανούς δείκτες που μπορούν να ταξινομούν όλα τα δείγματα ως καρκινικά και καλοήθεις με μεγάλη βεβαιότητα. Η μη επιβλεπόμενη ομαδοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Ευκλείδειας μέτρο απόσταση και τη μέθοδο οικισμό «μέσο όρο» των μεταμορφωμένων καταγραφής τιμών όλων των σημαντικών διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών των 45 δειγμάτων που περιλαμβάνονται στο σύνολο ανάλυση.

Lukk et al. έδειξαν ότι γονιδιώματος σε επίπεδο διαφορικής έκφρασης μεταξύ όγκων και ιστών ελέγχου μπορούν να χαρακτηριστούν χρησιμοποιώντας ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) μέσω μίας παραμέτρου κακοήθειας που χαρακτηρίζει συνεκτικό διαφορική έκφραση ομιλίες οι οποίες συνδέονται με το σχηματισμό όγκων. Για την ανάλυση των επιπτώσεων της από κοινού ρύθμισης της έκφρασης της πρωτεΐνης για την ταυτοποίηση βιοδεικτών, χωρίς επίβλεψη PCA έχει εφαρμοστεί στα δεδομένα της έκφρασης της πρωτεΐνης (αναγωγή σε λογαριθμική κλίμακα), τόσο από όγκο και φυσιολογικά δείγματα ιστού. Η PCA έγινε σε Matlab [The Mathworks Inc, Έκδοση 14]. Οι προκύπτουσες κύριες συνιστώσες της PCA σταθμισμένο μέσο των μεμονωμένων εκφράσεων της πρωτεΐνης, όπου τα βάρη προσδιορίζονται αυτόματα, έτσι ώστε η κύρια διαφοροποίηση της έκφρασης της πρωτεΐνης στο σύνολο δεδομένων μπορεί να εξηγηθεί από τις πρώτες κύριες συνιστώσες.

προκειμένου να αποφευχθεί πλαστά αποτελέσματα από ακραίες τιμές, εφαρμόστηκε μια προσέγγιση δύο σταδίων, όπου σε ένα πρώτο βήμα PCA εφαρμόστηκε στην αρχικά δεδομένα. Η ανίχνευση ακραία εφαρμόστηκε στις εκφράσεις των κύριων συστατικών. Στο δεύτερο στάδιο, το PCA έγινε χωρίς τις ακραίες τιμές. Οι προκύπτουσες τιμές έκφρασης για τα σταθεροποιημένα κύρια συστατικά όπου χρησιμοποιούνται για περαιτέρω ανάλυση. Προκειμένου να αναλυθεί η αναλογία των πληροφοριών σε σχέση με την διαφορική έκφραση η οποία αντιπροσωπεύεται από τα πρώτα τρία κύρια συστατικά και το υπολειμματικό χώρο, για κάθε πρωτεΐνη οι τιμές έκφρασης για όλους τους ιστούς, ποσοτικά με τον φορέα x

i, όπου χωρίζεται σε δύο συνιστώσες: όπου x

p, i είναι η συνιστώσα του x

i η οποία εκπροσωπείται από τις τρεις πρώτες κύριες συνιστώσες του PCA (S3) και x

r, θ ποσοτικοποιεί τις υπολειμματική πρωτεΐνη εκφράσεις στο συμπληρωματικό χώρο CS3 που δεν μπορούν να εκπροσωπούνται από τις τρεις πρώτες κύριες συνιστώσες της PCA. Προκειμένου να ελεγχθεί η κατανομή της διαφορικής έκφρασης μεταξύ των δύο συστατικών, για τα αρχικά δεδομένα που έδωσε x

i, οι PCA-based συστατικά x

p, i, και τα εναπομείναντα συστατικά x

r, μεταξύ άλλων, δύο -sided t-test για διαφορική έκφραση μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων έχει πραγματοποιηθεί.

απομόνωση RNA και οι μετρήσεις της γονιδιακής μεταγραφές των συμφερόντων με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

ποσοτική PCR σε πραγματικό χρόνο για την ανάλυση των μεταγραφική επίπεδα των πρωτεϊνών των συμφερόντων διεξήχθη χρησιμοποιώντας SYBR Green όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εν συντομία RNA απομονώθηκε από τα ίδια βιοψίες χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση πρωτεώματος με τη χρήση αντιδραστηρίου TRIzol® (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. Το cDNA παρασκευάστηκε με ανάστροφη μεταγραφή 1 μα ολικού RNA χρησιμοποιώντας ολίγο dTprimer (15μερούς) και M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Fermentas Life Sciences GmbH, Germany). Quanti tect εκκινητές για τα γονίδια του GAPDH ενδιαφέροντος (γονίδιο καθαριότητας) αγοράστηκαν απευθείας από Qiagen, Γερμανία. Ομάδες εναρκτήρα έδειξαν να παράγουν ένα ενιαίο αμπλικόνιο του επιθυμητού μεγέθους αξιολογήθηκε με RT PCR ακολουθούμενη από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη σε θερμικό ανακυκλωτή (Stratagene, Γερμανία) με τη χρήση δυναμό Flash SYBR Green qPCR κιτ (Finnzymes, Φινλανδία). PCRs για τα γονίδια-στόχους και οικοκυρική διεξήχθησαν εις τριπλούν και η μέση σχετική επίπεδα έκφρασης έχουν αναφερθεί. Προϋποθέσεις για πραγματικού χρόνου PCR αντίδρασης ήταν ως ακολούθως: 1 κύκλος των 94 ° C για 3 λεπτά και 40 κύκλους των 94 ° C για 20 s, 60 ° C για 30 s και 68 ° C για 30 s. Στο τέλος της PCR, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε μία ανάλυση τήξης για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του αμπλικονίου. Προκειμένου να αποκτήσει δεδομένα στατιστικής σημαντικότητας λαμβάνονται αναλύθηκαν με αταίριαστα φοιτητής

t-test

εκτελούνται και τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική

κηλίδωση Western

εκχυλίσματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με. 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνη PVDF. Ο αποκλεισμός πραγματοποιήθηκε σε 1 × διάλυμα Rotiblock (Roth Chemicals), ακολουθούμενο από επώαση της μεμβράνης με πρωτεύον αντίσωμα όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Η περίσσεια αντισώματα αφαιρέθηκαν με πλύσιμο με NaCl-τρις-Tween 20. Η επώαση με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας [αντι- (IgG ποντικού) ή αντι- (IgG κουνελιού), αραιωμένο 1:5000 σε 1 × Rotiblock] εκτελέστηκε για 1 h σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από τρεις πλύσεις, η αντίδραση αναπτύχθηκε με προσθήκη του υποστρώματος LumiGLO (Thermo). Το εκπεμπόμενο φως συνελήφθη σε φιλμ ακτίνων Χ (GE Healthcare).

Αποτελέσματα

2D-ΨΗΦΟ Ανάλυση και φασματομετρία μάζας

Σε αυτή τη μελέτη, ήμασταν σε θέση να αποδείξει μια τυπική διαδικασία για χειροκίνητη μικρο ανατομή ριζική προστατεκτομή δείγματα για την απόκτηση παθολογικά αξιολογούνται όγκου και καλοήθεις ιστούς για ανάλυση πρωτεώματος. Επιπλέον, αναλύσαμε την πρωτεώματος του προστάτη από 24 ασθενείς με καρκίνο και τα αντίστοιχα καλοήθη ιστό τους σε 21 περιπτώσεις (Πίνακας 1) με 2D-ΨΗΦΟ με το φάσμα του 4,0 έως 7,0 ρΐ και το εύρος μοριακού βάρους μεταξύ 10 kDa και 120 kDa. Υπό αυτές τις συνθήκες, ένα σύνολο 1324 κηλίδες σαφώς ανιχνεύθηκαν και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Delta2D για διαφορική έκφραση της πρωτεΐνης. 118 σημεία ήταν σημαντικά μεταβληθεί σε αφθονία τους ανάμεσα σε όλα τα δείγματα που περιλαμβάνονται στο σύνολο ανάλυση και επιλέχθηκαν για περαιτέρω ταυτοποίηση. Οι μέσες αφθονία των κηλίδων ήταν ποσοτικά και εκείνων με σχετικές μεταβολές στην αφθονία είναι μεγαλύτερη από 1,5 φορές μεταξύ καλοήθων και όγκου (προς τα πάνω ή προς τα κάτω) σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95% (

σ

& lt? 0,05) θεωρήθηκαν ως σημαντικές. Σημεία ενδιαφέροντος αποκόπηκαν από παρασκευαστική πήγματα για ταυτοποίηση πρωτεϊνών (ID) με τρυπτική πέψη in-gel και ανάλυση MALDI-TOF MS /MS. Μετά από μια αναζήτηση της βάσης δεδομένων μασκότ χρησιμοποιώντας τα κεκτημένα MS δεδομένα 96 σημεία 79 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν ως διαφορικά εκφρασμένο σε καρκίνο σε σύγκριση με καλοήθη ιστό. Οι κηλίδες με ID πρωτεΐνη που απεικονίζεται στο Σχήμα 1. Μεμονωμένα πρωτεΐνες που ανακλάται από πολλαπλές κηλίδες πιθανότατα οφείλεται σε μετα-μεταφραστική τροποποίηση οδηγεί σε μετατοπίσεις στην 2-DE. Οι πρωτεΐνες εντοπίστηκαν ομαδοποιήθηκαν σε διαφορετικές κατηγορίες με βάση λειτουργική διαθέσιμες πληροφορίες. Οι περισσότερες από τις ταυτοποιημένες πρωτεΐνες ήταν είτε κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες, ένζυμα των ενδιάμεσων μεταβολισμό, τη μεταγωγή σήματος, πρωτεΐνες θερμικού σοκ, πρωτεΐνες όγκων που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες που σχετίζονται με πρωτεΐνες ή πρωτεΐνες άγνωστης λειτουργίας (Σχήμα 2Β). Οι λεπτομέρειες των πρωτεϊνών ταυτοποιήσεις, σκορ πρωτεΐνη, την κάλυψη ακολουθία, θεωρητική τιμή ρΙ και το μοριακό βάρος καθώς και την μέση σχετική μεταβολή παρουσιάζεται στον Πίνακα S1.

Οι πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ΙΕΡ σε όλο το εύρος ρΙ 4-7, ακολουθούμενη κατά 12,5% SDS-PAGE και επικαλύπτονται από Delta2D. Μετά την εκχύλιση από ιστούς, οι πρωτεΐνες επισημάνθηκαν με Cy3 και Cy5. Ένα εσωτερικό πρότυπο αποτελείται από ίση ποσότητα πρωτεϊνών από όλα τα δείγματα (καλοήθεις και προστάτη ομάδες) σημάνθηκε με Cy2 και περιλαμβάνονται σε όλα τα τζελ. Οι πράσινες κηλίδες δείχνουν μειωτικά πρωτεΐνες, ενώ οι κόκκινες κηλίδες δείχνουν προς τα πάνω ρυθμισμένη σε πρωτεΐνες PCa σχέση με την αντίστοιχη καλοήθη ιστό. Τα προσδιοριζόμενα πρωτεΐνες που έδειξαν μεταβληθεί σημαντικά την έκφραση του προστάτη υποδεικνύεται με βέλη και σημαίνονται με τα αναγνωριστικά respectives πρωτεΐνη.

Η

(Α) Ανεξέλεγκτη ομαδοποίησης (Ευκλείδεια μέτρο απόσταση και ο «μέσος» μέθοδος συσσωμάτωσης) ήταν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των μετασχηματισμένων τιμές log πρωτεΐνη έκφραση του 45 δείγματα. Τα δείγματα που παρουσιάζονται οριζόντια, οι πρωτεΐνες κάθετα. Οι δενδρογράμματα αντιπροσωπεύουν τις αποστάσεις μεταξύ των συμπλεγμάτων. Στην επάνω γραμμή χρώμα, τα δείγματα όγκων σημειώνονται με κόκκινο χρώμα, οι φυσιολογικούς ιστούς εμφανίζεται με πράσινο χρώμα. (Β) τις βιολογικές διεργασίες που ρυθμίζονται από τις όλες τις σημαντικές διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών αξιολογείται από την αναζήτηση Γονιδιακή Οντολογία και συνοψίζονται ανάλογα με τις λειτουργίες τους.

Η

Ιεραρχική ομαδοποίηση και ανάλυση κατάτμηση των δειγμάτων

Η Εικόνα 2Α εμφανίζει το αποτέλεσμα ομαδοποίησης. Οι υψηλότερες εκφράσεις κόκκινο χρώμα, τα χαμηλότερα σε πράσινο. Τα δείγματα που παρουσιάζονται στις στήλες και τις σειρές δείχνουν πρωτεΐνες. Οι δενδρογράμματα αντιπροσωπεύουν τις αποστάσεις μεταξύ των συμπλεγμάτων. Τα δείγματα όγκων και καλοήθων δεν αποτελούν δύο διακριτές ξεχωριστές ομάδες. Ωστόσο, ιεραρχική ομαδοποίηση αποκάλυψε μία ομάδα πολύ παρόμοια δείγματα όγκων (10 δείγματα), σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα. Τα δείγματα αυτά θεωρούνται ως υποομάδα όγκου σε περαιτέρω ανάλυση. ανάλυση κατάτμηση των τιμών έκφρασης οδήγησε στη διαπίστωση ότι μια ενιαία πρωτεΐνη, ρΡΑ2 να ταξινομούν τα δείγματα που έχουν σημασία (Fisher δοκιμή με τιμή p 6.682e-09). Η υποομάδα όγκος ορθώς ταξινομηθεί, ένα (από τα 14) των υπόλοιπων όγκων ταξινομηθεί εσφαλμένα ως καλοήθη και τρία (από 21) των καλοηθών δειγμάτων ταξινομηθεί εσφαλμένα ως όγκοι (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). αποτελέσματα της ανάλυσης διαμέρισμα έχουν επίσης δείξει πολλές πρωτεΐνες μπορεί να ταξινομήσει όλα τα δείγματα σωστά (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε μια προσπάθεια να εκχωρήσει μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη PSA υπογραφή, υπάρχει άμεσος συσχετισμός μεταξύ της PSA και διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών παρατηρήθηκε (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στο σύνολό τους, περισσότερες από μία πρωτεΐνη μπορεί να διακρίνει όλα τα δείγματα που είχαν ανατεθεί στις ομάδες.

ανάλυση κύριων τμημάτων (PCA)

Ένα 3-διαστάσεων διάγραμμα διασποράς των τριών πρώτων κύριες συνιστώσες του δείγματα ιστών δείχνει έναν καλό διαχωρισμό μεταξύ των όγκων και των φυσιολογικών ιστών (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, το σχήμα 3Β, που απεικονίζουν τις λογαριθμικές τιμές ρ των αρχικών x δεδομένα

i για κάθε πρωτεΐνη στον χ-άξονα και τα συστατικά χ

ρ, Ι και Χ

r, i στον y- άξονας, δείχνει ότι σχεδόν όλοι διαφορική έκφραση μπορεί να αντανακλάται από την συνιστώσα PCA-based (κόκκινα αστέρια).

(Α) Scatterplot από τα πρώτα τρία κύρια συστατικά του PCA από τα δεδομένα έκφρασης πρωτεΐνης. Τα μπλε αστέρια αντιπροσωπεύουν τις φυσιολογικούς ιστούς, ενώ τα κόκκινα αστέρια παρουσιάζουν όγκους. (Β) Κατανομή των πληροφοριών σε σχέση με την διαφορική έκφραση μεταξύ όγκου και φυσιολογικών ιστών. Κάθε εγκάρσια αντιπροσωπεύει μια πρωτεΐνη. Οι τιμές p σε δύο όψεων t-test που αντιπροσωπεύεται από τον άξονα x, ενώ οι προεξοχές (κόκκινο: προβολή σε S3, μπλε: προβολή σε συμπληρωματικό χώρο) αντιπροσωπεύονται από τις τιμές στο y-άξονα. Προφανώς για όλες τις πρωτεΐνες με σημαντική διαφορική έκφραση στα αρχικά δεδομένα (log10 (ρ) & lt? -2) Η διαφορική έκφραση του εναπομένοντος συστατικού (μπλε αστέρων) δεν είναι σημαντική (log10 (ρ) & lt? -1), Ενώ η p -τιμές των συνιστωσών PCA-based (κόκκινα αστέρια) είναι παρόμοιες με τις αρχικές τιμές-ρ (χ-άξονας). (C-D) λόγο Διάμεση ακρίβεια και την απόδοση της πρόβλεψης του όγκου /φυσιολογικό ταξινόμησης. Οι μπλε καμπύλες δείχνουν την αύξηση της ποιότητας μοντέλο από την αύξηση του μεγέθους του δείγματος που χρησιμοποιείται για το μοντέλο βιοδεικτών. Τα κόκκινα αστέρια δείχνουν τις ιδιότητες του μοντέλου logit με βάση τις τρεις πρώτες κύριες συνιστώσες. (Ε) Η έξοδος του μοντέλου παλινδρόμησης (άξονας γ) υποδηλώνει την ύπαρξη δύο τάξεων όγκου διαφέρουν σημαντικά ανάλογα με διαχωριστικότητα τους. Φυσιολογικούς ιστούς (μπλε και πράσινα κουτιά) χρησιμοποιώντας την έκφραση της πρωτεΐνης.

Η

Προφανώς η έκφραση της πρωτεΐνης διαφορά μεταξύ των όγκων και των φυσιολογικών ιστών δεν μπορεί να ανατεθεί σε ένα άτομο πρωτεΐνης, αλλά φαίνεται να εξαρτάται από τη συνολική πρότυπα έκφρασης πρωτεϊνών που είναι αντιπροσωπεύεται από μόνο τρία συστατικά της ΣΕΣΣ, σύμφωνα με τα αποτελέσματα που περιγράφονται από Lukk et al. [17]. Ως εκ τούτου, όλα τα (γενικές, μη απολύονται) συνδυασμούς τουλάχιστον τρεις πρωτεΐνες που μπορεί να μετρηθεί με μεγάλη ακρίβεια πρέπει να είναι επαρκής για τη δημιουργία βιοδεικτών με παρόμοια έξυπνη απόδοση, αν οι πρωτεΐνες δείχνουν μια σημαντική συμβολή στις τρεις πρώτες κύριες συνιστώσες του PCA. Το αντίστοιχο σετ πρωτεΐνη μπορεί να επιλεγεί σύμφωνα με πειραματικά κριτήρια, μη πλεονασμός και η σημασία του συσχετισμού με τις αντίστοιχες συνιστώσες PCA. Λόγω της κατασκευής των κύριων συστατικών του PCA ως σταθμισμένο μέσο των εκφράσεων όλων σχεδόν των πρωτεϊνών, οι κύριες συνιστώσες μπορεί να γεμίσει το ρόλο του «εγγενούς φίλτρο θορύβου». Ως εκ τούτου, είναι σκόπιμο να εκφράσει κάθε κύριο συστατικό από το μέσο έκφρασης ενός (μικρή) ομάδα πρωτεϊνών, προκειμένου να επωφεληθούν από την εγγενή καταστολή του θορύβου του μέσου όρου, καθώς και. Τα Σχήματα 3C-D δείχνει την επίδραση του μέσου όρου. Η έκφραση του κάθε κύρια συνιστώσα έχει αντιπροσωπεύεται από την μέση έκφραση του 1-25 πρωτεϊνών, οι οποίες έχουν επιλεγεί τυχαία από το σύνολο των 38 πρωτεϊνών με υψηλότερη συσχέτιση με κάθε κύριο συστατικό. Προφανώς ο λόγος ακρίβεια και την απόδοση εξαρτάται από το μέγεθος του δείγματος των πρωτεϊνών που χρησιμοποιούνται για την αναπαράσταση των κύριων συστατικών. Η διάμεση τιμή των μοντέλου ιδιότητες είναι στο ίδιο μέγεθος των ιδιοτήτων των δεικτών οι οποίες βασίζονται σε ένα βιολογικό λογική, υποδεικνύοντας ότι η διαφορική έκφραση μπορεί να κυριαρχείται από μεγάλης κλίμακας, η έκφραση έντονα συν-ρυθμιζόμενων πρωτεΐνη μετατοπίζεται λόγω του σχηματισμού όγκου.

για να ελέγξετε την αναμενόμενη προγνωστική επιδόσεων, logit μοντέλο έχει προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας μόνο τις τρεις πρώτες κύριες συνιστώσες της PCA. Σε διασταυρωμένης επικύρωσης (άδεια-μία έξω) την ακρίβεια της πρόβλεψης των όγκων και φυσιολογικών ιστών σε δοκιμαστικό σετ ήταν 86%. Οι τρεις (21) φυσιολογικούς ιστούς και 3 (24) καρκινικών ιστών έχουν ταξινομηθεί εσφαλμένα. Το μοντέλο δείχνει ότι οι όγκοι μπορούν να χωριστούν σε δύο ομάδες που διαφέρουν σημαντικά σε σχέση με τους διαχωριστικότητας από φυσιολογικούς ιστούς (Σχήμα 3Ε και Πίνακας 2). Στατιστική δοκιμές έδειξαν καμία άμεση σχέση των ομάδων του όγκου των σχολιασμένο χαρακτηρισμούς όγκου (σκορ Gleason, PSA δείκτης κλπ). Ως εκ τούτου, είτε οι παράγοντες επιπτώσεις εκτός από την έκφραση της πρωτεΐνης μπορεί να συμβάλλουν στα χαρακτηριστικά του όγκου του προστάτη, ή εξαιρετικά πολύπλοκος, μη-μονότονη συνεταιριστικές διαδικασίες μεταξύ των πρωτεϊνών έχουν αντίκτυπο στην κατάσταση του όγκου που δεν καλύπτεται από τα κύρια συστατικά της PCA που χρησιμοποιείται στο μοντέλο logit παλινδρόμησης. Λειτουργική ταξινόμηση των 26 ταυτοποιημένες πρωτεΐνες που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των δύο ομάδων όγκων συνοψίζονται στο Σχήμα 4Α-C. Συνολικά το 70% των πρωτεϊνών από αυτό το σύνολο δεδομένων ταξινομήθηκαν σε μεταβολικές διεργασίες και περισσότερο από το 60% είχαν ταξινομηθεί σε καταλυτική ή δεσμευτική λειτουργίες.

(Α) Οι βιολογικές διαδικασίες, (Β) μοριακής λειτουργίες και (C ) κυτταρικά διαμερίσματα ρυθμίζονται από τα διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών μεταξύ των δύο ομάδων όγκου αξιολογείται από την αναζήτηση Γονιδιακή Οντολογία.

η

Δίκτυα ανάλυση των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών στα καρκινικά εναντίον καλοήθη δείγματα

Πορείες και δίκτυα που εμπλέκονται πρωτεΐνες που προέρχονται από 2-D ΨΗΦΟ πειραματισμούς διαφορικά εκφρασμένο σε προστάτη αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας MetaCore ™, web-based ολοκληρωμένη λογισμικού. Η αρχιτεκτονική του δικτύου αντιπροσωπεύει συνδέσεις μεταξύ των επιμέρους πρωτεϊνών (κόμβους).

Οι αυτή την ανάλυση κόμβους (βασικές πρωτεΐνες) των δικτύων πρωτεΐνης προτείνεται να είναι οι βασικές ρυθμιστικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε πολυκύτταρους διαδικασίες. Το ενσωματωμένο συντομότερη δίκτυο (Σχήμα 5Α) αποκαλύπτει ότι το c-myc, ρ53, υποδοχέα ανδρογόνου, 14-3-3-έψιλον, βιμεντίνη, PSA και υποδοχέα οιστρογόνου 1 ως κόμβους του δικτύου.